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1、带负电荷的磷酸基与介质中的阳离子形成离子键,可有效地屏蔽磷酸基间的静电斥力。四、DNA物理结构的不均一性1. 反向重复序列（Inveerted repeats）又称为回文序列（palindrome）,能形成发夹结构或十字形结构2. 富含A+T的序列 3. 嘌呤和嘧啶的排列顺序 碱基组成相同，但排列不同，双螺旋的稳定性有差别5GC5CG ， 和碱基堆积力有关，碱基堆聚力是嘌呤向嘧啶方向大于嘧啶向嘌呤方向。五、DNA二级结构的多形性DNA可以以多种形式的双螺旋结构存在1、A-DNA 2、B-DNA 3、Z-DNA 4、其他形式DNA: 三链DNA，四链DNA: 六、DNA的变性与复性1、基本概念：

2、下列因素可导致DNA变性：高温 、 酸 、碱 、尿素 、甲酰胺2、DNA的熔解曲线: 双链DNA 的A260=1.00 （ 浓度为50g/ml时，对波长260nm紫外线的吸收能力）；单链DNA的A260=1.37； 游离碱基或核苷酸的A260=1.60。解链温度（melting temperature, Tm）或熔点，Tm是双螺旋失去一半时的温度，即A260的升高达到极大值一半时的温度。是变性温度范围的中点。Tm 时DNA，A260=1.185Tm值的影响因素：（1） DNA的均一性: 均一性高，Tm值的范围小（2） G-C含量: G-C含量高，Tm值高（3） 介质中的离子强度影响变性的因素：

3、（1） 外部条件 （2） 内部条件：GC含量。马默-多蒂（Marmur-Doty）关系式：Tm = 69.3+0.41（G +C）%，或GC%=（Tm-69.3）2.44DNA变性后物理性质发生的变化：（1）流体力学的性质发生改变：粘度下降，而沉降速度增加；（2）提高了对紫外线的吸收能力，此称为增色效应（hyperchromicity）。3、性反应曲线复 Cot曲线:DNA复性时单链消失的速度:C/Co=1/1+KCotC：单链DNA浓度 Co：DNA总浓度 t：时间/秒，k：=二级反应常数复性分数C/Co决定于单链起始浓度和保温时间的乘积（Cot）。定义C/Co=1/2时，Cot值定义为Co

4、t1/2；即复性一半时DNA总浓度和时间乘积1/2=1/1+KCot1/2 1+KCot 1/2=2 k Cot1/2=1总DNA浓度相同时，不同DNA的Cot1/2 值不同复性动力学公式，复性进行一半时C/C0 1/21/1+KCot1/2根据复性动力学公式我们可以知到些什么？（1） 单链浓度随着时间的增大而减小；片断越短， Cot1/2 值越小，（2） 反应速率取决于初始的单链浓度Co；（3） 以反应浓度和COt1/2的对数为座标可绘复性曲线（4） 通过Cot1/2值可测原核生物基因组的大小； （5）不同生物基因组大小不同，复性曲线也不同；可用以区分真核生物和原核生物基因组。DNA复杂性越

5、高，复性越慢， 基因组大复性慢.基因组的复杂性与其Cot1/2成正比单一序列和重复序列复性动力学曲线的区别_ 真核生物的DNA有重复顺序，而原核生物多为单一顺序。（1） 单一顺序的复性曲线常只有一个拐点，而重复顺序常有多个拐点。（2） COt 比值变化范围。原核生物的COt比值为100,真核生物的COt比值大于100影响复性反应的因素（1） DNA片段的大小：片断小复性快，移动碰撞机会多（2） DNA的浓度：高浓度复性快（3） DNA复杂性： 简单序列复性快（4） 温度：过低温度减少互补链的碰撞机会最佳复性温度一般比Tm低25C。（5） 盐的浓度：过低盐浓度使复性后的DNA又变性复性时要求盐的

6、浓度达到足够高;在复性反应中如何知道单链已经结合成双链了呢？可以通过哪些方法来检测？（1） 减色效应（hpochromic effect）测定光密度，即OD值（opticaldensity），DNA从单链变成双链，OD260减少30%（2） 羟基磷灰石柱层析，羟基磷灰石对双链DNA吸附较牢，不易吸附单链而使其通过七、分子杂交1特点是：（1）都是应用复性动力学原理；（2）都必须有探针（probe）的存在。2探针就是用同位素或非同位素如荧光染料，生物素等标记的短片段特异DNA或RNA序列。3杂交：不同来源的单链核酸经碱基互补配对而形成的双螺旋，DNA-DNA, DNA-RNADNA杂交可反映不同生

7、物中DNA的共同序列和不同序列，研究生物的进化，核酸杂交是现代分子生物学的基础4常用的分子杂交方法_ 原位分子杂交（in situ hybridization）_ 斑点杂交（dot blotting）_ 萨瑟杂交（ Southern blot）_ 诺瑟杂交（Northern hybridization）_ Western blotting八、DNA超螺旋结构和拓扑异构现象1生物体中大多数DNA是以超螺旋的形成存在，而缺少超螺旋的DNA则为松弛型DNA原核生物DNA，共价封闭环，再经螺旋就成为超螺旋。真核生物DNA为线性，DNA与蛋白质结合之间的DNA可形成一个小“环”，类似共价封闭环，从而螺旋

8、成为超螺旋2正超螺旋：和DNA内部双螺旋缠绕方向相同的方向缠绕形成的超螺旋，结构更加紧密。DNA每圈初级螺旋的碱基对小于10.5，则为正超螺旋3负超螺旋：DNA绕其轴与右手双螺旋方向相反的方向缠绕所产生的超螺旋，结果减少每个碱基对的旋转，每圈初级螺旋的碱基对大于10.5，则为负超螺旋。超螺旋是耗能过程，超螺旋的产生可能为能量的储存形式4拓扑异构现象拓扑异构酶 催化DNA链断裂和重新连接。每次只作用于一条单链，无需ATP，功能是松弛DNA， 代表：E.coli拓扑异构酶，对单链DNA的亲和力比双链高，能识别负超螺旋区，使负超螺旋扩大化而成松弛状，该酶不能松弛正超螺旋；真核生物拓扑异构酶可结合15

9、-19核苷酸的双链区域,其断裂点在此区域中间.该酶倾向于结合超螺旋而不是结合松弛DNA区域,对正负超螺旋都有松弛功能.拓扑异构酶 大肠杆菌拓扑异构酶又称DNA旋转酶（DNAgyrase），能催化断裂和连接双链DNA，需能量ATP参与，无碱基序列特异性，DNA旋转酶结合到双链闭环分子中在ATP的作用下产生负超螺旋。无ATP时只能缓慢松弛负超螺旋而不能松弛正超螺旋。大肠杆菌拓扑异构酶主要功能是引入负超螺旋以抵消复制叉移动所产生的正超螺旋，还具有形成或拆开双链DNA环连体的能力。该酶对DNA的结合顺序是正超螺旋松弛负超螺旋5拓扑异构酶的生物学功能：_ 恢复细胞过程产生的DNA超螺旋，如复制叉前的正超

10、螺旋、转录时聚合酶前产生的正超螺旋。_ 防止细胞DNA过度超螺旋，维持超螺旋的稳定水平。生物体内5负超螺旋，有利于基因的转录、基因组稳定、促进重组。_ 去连环活性（大肠杆菌）、染色体凝缩（真核）、解开缠绕DNA双螺旋6拓扑异构酶的催化反应本质：是先切割DNA的磷酸二脂键，改变DNA链环数后再连接，兼具DNA内切酶和DNA连接酶的功能，但是它不能连接事先已经存在的断裂DNA，是DNA复制、重组和转录中必需的酶九、常见DNA分子形式及相互关系型DNA：具正、负超螺旋的双链环状DNA S1.41；型DNA：无超螺旋的双链环状DNA，是松弛型S=1.14；型DNA：一条链或两条链上有一个或几个切口的双

11、链环状DNA S=1.14；型DNA：线形双链DNA S=1.00；崩溃DNA：型或型DNA变性时，氢键断裂但两条链无法分离而紧密缠绕的分子S=3.0单链环状DNA： S=1.14线状单链DNA： S=1.30连环状DNA： 两个型DNA环连而成。S1.41沉降系数：CsCl密度梯度离心时的表示单位。CsCl本身有梯度，在离心时将不同分子大小的物质集中到它自身的不同梯度中。在同一种密度梯度离心条件下，沉降系数大表示易沉淀，则具有较高的超螺旋。鉴定DNA超螺旋的手段。第二章染色体、基因组和基因一、原核生物和真核生物真核生物：有完整的细胞结构；遗传物质集中在有核膜包围着的细胞核中与特殊的蛋白质相结

12、合形成染色体结构原核生物：没有真正的核结构；遗传物质存在于整个细胞之中，以裸露的核酸分子存在，不形成染色体结构，也常被称为染色体噬菌体和病毒：是一种超分子的亚细胞生命形式，繁殖必须在寄主体内进行，遗传机制与其寄主密切相关二、基因组大小与C值矛盾 基因组（genome）: 一个物种的单倍体的染色体的数目C值（C value） ：即单倍体基因组的DNA总量。它是每一种活生物的一个性质。C值矛盾（C值佯谬，C value paradox）：人们无法用已知功能来解释基因组的DNA含量，所以产生了C值矛盾：与预期的编码蛋白质基因数量相比，基因组DNA含量过多；一些物种间的复杂性变化范围并不大，但C值却很

13、大。三、原核生物染色体及其基因一个染色体即一个核酸分子（DNA或RNA）大多数为双螺旋结构，少数以单链形式存在；大多数为环状，少数为线状E.Coli 基因结构特点： 功能上相关的几个结构基因前后相连，再加上一个共同的调节基因和一组共同的控制位点即启动子和操作子在基因转录时协同动作（操作元形式）。蛋白质基因通常以单拷贝的形式存在。RNA基因通常是多拷贝的。不同基因的启动子和操作子DNA序列不同，实现表达的精细调节结构基因：编码蛋白质的特定DNA序列，常为单拷贝。调节基因： 一类对其它基因的活性进行调节或限制的基因。 操纵子（元）：功能上相关的几个结构基因相连，由一个共同的调节基因和一组共同的控制

14、位点即启动子（promoter）和操纵基因（operator，也称操作子）。在基因表达时协调作用。这种基因表达调控结构组成一个单元，称为操纵子（也称为操纵元，Operon）。调控子：一个调节基因的产物能同时调控几个非相邻的结构基因的表达。操纵子的不同结构基因是相邻的。而调控子的结构基因位于同一染色体的不同部位或不同染色体。可读框: DNA中具有潜在编码蛋白质氨基酸的核苷酸序列。编码区：DNA中对应于蛋白质中氨基酸序列的核苷酸序列。转录单位：包括转录的启动子及其上游的其它调控区域、基因本身和转录的终止序列。间隔区：位于结构基因间不被转录的DNA片段。包括一些复制、转录、翻译过程的调控区段。2、噬

15、菌体单链环状DNA, 长5,386 bp，共有11个基因，3个mRNA，翻译11种蛋白质重叠基因和基因内基因。其基因组是一长48502bp 的双链DNA分子，在噬菌体颗粒内，该DNA为一线状双链分子，当进入宿主细胞后，其互补单链粘端通过碱基配对而结合，形成环状分子。编码基因：必要基因，非必要基因。四、真核生物的染色体真核生物染色体的化学组成：DNA： 27%,一条染色体只包含有一个DNA分子；RNA： 6%蛋白质：66% （组蛋白和非组蛋白）1、染色体的结构等级：DNA+组蛋白；核小体（Nucleosome）；染色质（Chromatin）；染色体（Chromosome）；染色质染色体，被压缩8

16、000-10000倍四级结构: 核小体-螺线体-超螺线体-染色单体常染色质；异染色质；组成型异染色质：DNA序列不转录,如卫星DNA；兼性异染色质： 雌性个体中的一个X染色体染色质（chromatin）：200bpDNA+组蛋白八聚体（H2A, H2B, H3, H4） + H1；核小体：染色体的基本结构单位核小体的组装：H3和H4先形成四聚体，一个锁芯样结构，70-80bp DNA缠绕其上形成一圈螺旋，然后H2A和H2B形成异二聚体，结合于四聚体的两个侧面，各异二聚体与30-40bp DNA 结合各产生半圈螺旋，最后H1与DNA结合锁住核小体的进出口。2着丝粒（Centromere）功能：保

17、证染色体分裂的完整性、连续性、两极分离性结构：特殊DNA序列，大多数着丝粒中含110bp的AT富集保守区，在其两侧是高度保守的序列（成分和成分）特征：着丝粒的DNA特殊，称-DNA，人类有由171bp重复单元所组成的500kb DNA区段。不同物种的着丝粒中DNA序列不同，同种生物不同染色体的着丝粒结构也有差别。3粒端（telomere） 线性DNA分子末端特化了的序列，是特殊的二级结构。 端粒的DNA由许多短的正向重复序列组成。5端总是在富含C的链上，3端则在富含G的链上。具有一条单链末端，总是富含G的链，即带有3端。端粒DNA单链末端不被核酸外切酶及单链特异性的内切核酸酶所识别。 端粒、着

18、丝粒和DNA复制起点构成了染色体的不可缺少的三要素。五、真核生物基因组序列特征1真核生物DNA复性动力学 DNA复杂性为最长的没有重复序列的DNA核苷酸对数目。可通过E.coli DNA 作为标准对被测DNA进行复杂性的计算：X 4.2106bp样品DNACot1/2（观察可得）/E.coli DNACot1/2（已知）真核DNA的复杂性大于原核DNA.从Cot曲线可见原核的Cot曲线都呈“S”形。跨度一般分布2个数量级，表明原核DNA都是单一序列。真核生物DNA复性跨越78个数量级，复性可分为三个组分，每个组分代表基因组中不同复杂性的序列第一相：快复性组分，约占25，Cot1042102，C

19、ot1/2 =0.0013第二相：中间复性组分，占30，Cot0.2100，Cot1/2 =1.9第三相：慢复性组分，占45，Cot8010000，Cot1/2 =630Cot: 单链起始浓度和保温时间的乘积Cot1/2: 即复性一半时DNA总浓度和时间乘积2、单一序列、重复序列及卫星DNA根据复性动力学研究结果可将真核DNA分为4种：单一序列：非重复序列轻度重复序列：在基因组中有210个拷贝，组蛋白基因、tRNA基因中度重复序列：在基因组中有10几百个拷贝一般不编码蛋白质，在基因调控中发挥作用高度重复序列：拷贝数几百几百万，如rRNA 基因。原核生物含完全不重复DNA，低等真核大部分为非重复

20、，重复组分不超过30,基本为中度重复，高等真核中近一半为中度或高度重复。真核DNA的四种类型并非在每一生物中都存在。多倍体植物中没有非重复序列。螃蟹基因组中没有中度重复。基因组大小和非重复DNA在低等简单的生物中有正比关系。即基因组增加，非重复DNA长度增加。当基因组大小在3.0109bp以上时，基因组增加，非重复DNA组分不增加，只是重复组分增加。切成数百个碱基的片段进行超速离心，会在主要的DNA带的上面有一个次要的DNA带相伴随。这就是卫星DNA,由长串联重复序列组成。一般对应于染色体上的异染色质区,位于着丝点区域。 小卫星DNA（minisatellite DNA） ：由中等大小的串联重

21、复序列组成。位于染色体末端区域，也可分散存在，一般不转录；有一个基本的核心序列（GGGCAGGAXC）。另一类小卫星DNA是端粒DNA，主要有串联重复单位TTAGGG组成。 微卫星DNA（microsatellite DNA）重复单位多为二核苷酸，也有少量三核苷酸和四核苷酸，分散存在于基因组中，可作为基因的标记。小卫星DNA和微卫星DNA可用于分子标记六 真核生物的基因1. 割裂基因和重叠基因基因不连续，即为割裂基因（interrupted gene）指基因的编码序列在DNA分子上不是连续排列的， 而是被不编码的序列所隔开外显子（外元，exon）：编码的序列（对应于mRNA序列,基因两端起始和

22、结束都是外显子）。内含子（内元, intron）：不编码的序列（在成熟mRNA中消失）割裂基因的特性：1、外显子广泛存在于各种生物不同的基因中，编码蛋白质基因、rRNA、tRNA.2、真核生物大多数是割裂基因，古细菌中少见，真细菌中没有。3、外显子排列顺序和其在成熟mRNA中排列顺序相同4、某种割裂基因在所有组织中都具有相同的内含子成分5、内含子通常在所有的可读框中都含有无义密码子，一般无编码功能外显子与生物进化： 基因内含子之间的亲缘关系远不如外显子之间的关系密切，内含子突变后不影响蛋白质的结构，外显子突变后影响蛋白质结构被自然选择淘汰，而表现内含子在进化过程中变化较大、较快，内含子就避免了

23、选择压力而自由积累。外显子是保守的，而内含子变化很大，基因长度的变化主要决定于内含子某些DNA序列编码一个以上的蛋白外显子的选择性剪接可产生不同的mRNA，产生重叠基因。外显子和内含子相对而言存在。2. 基因家族和基因簇基因家族（gene family）:来源相同，结构相似，功能相关的一组基因,家族成员有序列相关性。但相关程度和组织形式不同。基因家族成员分布在特定染色体区域。也可分散存在于同一染色体。甚至不同的染色体基因簇（gene cluster）:家族成员紧密成簇排列成大段的串联重复单位，并位于特定的染色体区域内，称为gene cluster,血红蛋白基因家族串联重复基因和基因家族的区别

24、串联重复基因各成分间有高度的序列一致性甚至完全相同,以同一基本单位进行重复。基因家族各成员的差别较大，以各自为基本单元重复拷贝数较高，常有几十几百个。基因家族拷贝数不高。非转录的间隔区短而一致。基因家族各成员的非转录的间隔长短不一.tRNA（4S基因）小分子，7590个核苷酸，20余种氨基酸约由40余种tRNA。酵母tRNA，长约140kb，有内含子，但各内含子没有序列的共同性。串联成堆排列，间隔区较大， 重复基因的起源： 滚环模型，不等交换，突然复制假说3、细胞器基因叶绿体、线粒体含有DNA，环状、非重复。同一线粒体或叶绿体内含有相同环状DNA。均编码自身所需的某些蛋白质及rRNA、tRNA

25、。其余所需的蛋白质均由核基因编码。叶绿体、线粒体的膜不允许核酸的通过。其合成的rRNA，mRNA和tRNA只能在细胞器内行使功能，进行翻译，合成系统是细胞器专用的。线粒体基因组呈母系遗传方式受精卵中线粒体基因组几乎都来自卵子在减数分裂过程中，卵子的线粒体DNA分子完全随机地分配到两个子代细胞中人类线粒体基因组双链环状DNA基因排列高度紧凑，总长为16,569bp，约93的顺序参与基因的编码DNA两条链的碱基组成差异很大：重链（H 链）富含鸟嘌呤轻链（L 链）富含胞嘧啶细胞内的数目：数千拷贝第三章DNA 复制 DNA replication一、复制概况1、半保留复制（Semiconservati

26、ve replication）复制时以解开的双链DNA中的一条链作为模板,通过碱基互补配对原则合成另一条新链,由新合成的子链与母链组成一新的DNA双链,其序列与母双链完全相同.DNA复制的可能方式:分散复制，半保留，全保留1958, Meselson和Stahl用实验证明了DNA的半保留复制机制2、制起点复、复制子、方向和方式复制起点（Ori, O）: 复制是在DNA分子的特定位点开始的,这一位点被称为复制起点. 一般富含AT序列。复制起点的数目原核生物染色体通常只有一个复制起点，复制从起点开始，进行到终点结束，完成整个DNA分子的复制。（一个复制单元）真核生物染色体DNA的复制是从多个位点（

27、多个复制起点），一个DNA分子上具有多个复制单元。复制子（replicon）：复制从起始到结束的DNA单位称为一个复制子，是基因组中能独立进行复制的单位。在每个细胞分裂周期中，每个复制子只启动一次。复制子中含有复制需要的控制元件。在复制的起始位点具有原点，在复制的终止位点具有终点（Terminus） 复制方向 复制可能是单向的，也可能是双向的。这是由从原点形成一个或两个复制叉决定的。 复制叉（Replication fork）：复制发生的位点，是双链分开的复制起点位置。复制叉从Ori开始沿着DNA移动。一个复制叉：复制时复制叉移动产生单向复制 二个复制叉：复制时相背向移动，产生双向复制大多数生

28、物DNA都是以双向等速方式进行复制 双向复制时复制叉的移动不对称单核苷酸是在3端加上，复制方向或链的延伸方向：53复制方式复制叉式（复制）：在复制原点产生复制叉，双链环状DNA的复制叉式类似“”，又称复制。滚环式（Rolling circle）: DNA双链环的一条链断裂，5端和特定的蛋白质相连，而在3端不断由DNA聚合酶催化向前延伸，以未切断的一条环链为模板进行合成。老环中另一条亲链的5端不断抛出，似一个环在滚动。类似“”，又称“”复制，被抛出的链到一定长度时则开始复制其互补链。3、DNA复制的半不连续性半不连续复制模型：DNA双链中一条链的复制合成是连续的，另一条链是不连续的。1968年由

29、冈崎等人提出：模板链（53）仍按碱基互补，但从反方向合成多个53DNA片段（冈崎片段），约长1000-2000核苷酸。合成的方向和复制叉移动的方向相反。以3-5 链作为模板合成的DNA为先导链（leading strand）以5-3 链作为模板合成的DNA为后随链4、DNA聚合酶与DNA聚合反应DNA复制是由DNA聚合酶以四种核苷三磷酸为前体负责催化完成的。Kornberg （ 1957 ） 首次发现DNA 聚合酶（pol），以后又发现DNA聚合酶（pol）和DNA聚合酶（pol）poly（核苷酸）n-OH3+dNTP poly（核苷酸）n+1-OH3+ppi二、复制体系 多种酶和蛋白质（E.coli中有30多种）参与DNA的复制。与复制有关的酶和蛋白质称为复制体系（Replisome）。 双链DNA的复制是一个涉及酶活动的复杂的聚合反应过程，可分为起始、延伸和终止三个不同的阶段。.1、DNA复制体系的鉴定_利用条件致死突变