钙拮抗剂对大鼠心肌缺血再灌注初期生长反映基因1表达的阻碍.docx

1、钙拮抗剂对大鼠心肌缺血再灌注初期生长反映基因1表达的阻碍钙拮抗剂对大鼠心肌缺血再灌注初期生长反映基因-1表达的阻碍 李海青，石方才，高分飞，贾强用【摘要】 目的：研究钙拮抗剂(维拉帕米、地尔硫芭卓和硝苯地平)对大鼠心肌缺血再灌注(I/R)芭卓初期生长反映基因-1(Egr-1)表达的阻碍。方式：大鼠随机分为假手术组、I/R组、二甲基亚砜组、维拉帕米组、地尔硫芭卓组、硝苯地平组。Western blot法测定Egr-1蛋白表达水平的转变；RT-PCR法测定Egr-1 mRNA表达水平的转变。结果：与假手术组比，I/R组Egr-1蛋白及Egr-1 mRNA表达显著增高(P<；与I/R组比，维拉

2、帕米组、地尔硫芭卓组和硝苯地平组Egr-1蛋白及Egr-1 mRNA表达明显减少(P<。结论：维拉帕米、地尔硫芭卓和硝苯地平都可抑制缺血再灌注心肌Egr-1蛋白及Egr-1 mRNA的过度表达。 【关键词】 钙拮抗剂；缺血再灌注；初期生长反映基因-1AbstractObjective: To study the effects of calcium antagonist(verapamil、diltiazem and nifedipine)on early growth response gene-1(Egr-1)expression in rats after myocardial i

3、schemia-reperfusion(I/R). Methods: Rats were randomly assigned into Sham、I/R、DMSO、verapamil、diltiazem、nifedipine groups. The expression levels of Egr-1 protein and mRNA were examined by Western blot and RT-PCR, respectively. Results: Compared with sham group, Egr-1 protein and mRNA of I/R group over

4、expressed(P<. The expression levels of Egr-1 of verapamil、diltiazem、nifedipine groups significantly decreased, compared with I/R group(P<. Conclusion: Verapamil、diltiazem and nifedipine can inhibit the overexpression of Egr-1 protein and mRNA in rats caused by I/R.Key Wordscalcium atagonist; i

5、schemia-reperfusion; early growth response gene-1 细胞内钙超载是缺血再灌注(I/R)损伤的要紧病理机制之一，而作为组成I/R损伤分子通路一起分子基础的核内转录因子Egr-11，其与细胞内Ca2+之间存在超级紧密的联系，Ca2+可通过不同的信号转导途径直接或间接阻碍Egr-1的表达。众所周知，钙拮抗剂防治心肌I/R损伤的要紧机制是阻断心肌细胞膜钙通道，降低细胞内钙离子浓度(Ca2+)i，拮抗钙超载。而咱们的前期工作也证明了F2和维拉帕米均能通过阻断心肌细胞膜钙通道，降低心肌细胞(Ca2+)i，避免钙超载拮抗心肌I/R Egr-1的异样表达2,3。

6、因此咱们提出假设：具有钙拮抗作用的化合物均有抑制Egr-1高表达的效应。为了验证这一假设，进一步探讨钙拮抗剂的共性作用，本实验通过成立大鼠心肌I/R损伤模型，运用3种经典的钙拮抗剂，观看其对Egr-1 mRNA及Egr-1蛋白表达的阻碍，为进一步探讨其分子生物学机制提供有力的依据。1 材料与方式 动物 SD大鼠广州第一军医大学动物中心提供许可证号：SCXK(粤)2006-0015,2006B008；SPF雌雄不拘，体质量250350g。 仪器与试剂 BL-420E信号记录分析系统(四川成都泰盟科技，中国)；低温高速离心机(Eppendorf公司，德国)；乳化分析仪(IKA公司，德国)；聚丙烯酰

7、胺凝胶电泳相关仪器、凝胶成像分析系统、转印系统、紫外分光光度计、全自动PCR扩增仪(Bio-RAD公司，美国)；压力蒸汽灭菌器(嘉兴市中新医疗仪器，中国)；电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂，中国)；二甲基亚砜(DMSO，上海凌峰化学试剂，中国)；兔抗大鼠Egr-1多克隆抗体(Santa Crutz公司，美国)；HRP标记的山羊抗兔IgG、小鼠抗大鼠-actin单克隆抗体、HRP标记2抗IgG(博士德公司,中国)；硝酸纤维素膜、Trizol试剂、PCR扩增反映试剂盒(Invitrogen公司,美国)；Egr-1引物和-actin引物(上海华丽生物工程公司，中国)；第一链cDNA合成试剂盒(

8、MBI Fermentas公司,立陶宛)；维拉帕米(恒瑞医药股分，中国)；硝苯地平和地尔硫芭卓(Sigma公司，美国)。 心肌I/R模型的成立及分组 大鼠称重,乌拉坦kg)腹腔麻醉，分离气管后当即行正压人工呼吸(频率60次/min，流量2mL/100g)。从左侧第3、4肋间打开胸腔，暴露心脏，剪破心包膜，用2个小拉钩撑开并向下按压胸廓使心脏暴露于胸腔外，在肺动脉圆锥左缘平左心耳下缘2mm冠状动脉处进针，用5/0丝线穿过心肌层。结扎冠状动脉时连同直径2mm的塑料胶管一路结扎造故意肌缺血60min，然后解除结扎再灌注180min。 大鼠随机分为I/R组(术前5min予NS 1mL/kg，结扎大鼠冠

9、状动脉前降支，60min后松开结扎线，恢复血流，再灌注180min)；DMSO组(术前5min改NS为DMSO，手术操作同I/R组)；维拉帕米组(术前5min予维拉帕米kg,用NS稀释，一样依照1mL/kg给予)；地尔硫芭卓组(术前5min予地尔硫芭卓kg,用NS稀释成1mL/kg给予)；硝苯地平组(术前5min予硝苯地平kg，用NS稀释成1mL/kg给予)；假手术组(术前5min予NS 1mL/kg，手术时冠状动脉前降支穿线但不结扎，持续观看240min)。 Egr-1蛋白测定 取100mg心肌组织块，用干净的剪子将组织于冰上快速剪碎，加入预冷的裂解液20mmol/L TrisHCl，150

10、mmol/L NaCl，体积分数1的TritonX-100，1mmol/L乙二胺四乙酸；pH 与5L的Protease inhibitor cocktail ，用乳化分散仪将心肌组织于冰上充分匀浆，每一标本匀浆30s冰上静置30s，共匀浆3次，匀浆至无明显组织颗粒为止，冰上静置10min，2655g，离心10min(4)，弃上清液，加入裂解液200L，冰上静置裂解2h， 期间不断涡旋使其充割裂解， 然后15294g，离心20min(4)，吸取部份上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，部份上清液与5上样缓冲液41混合，煮沸5min。配制分离胶与浓缩胶，然后每一泳道加60g蛋白样品，电泳(125V，

11、80min)，转膜(350mA，60min)。封锁液封锁1h，加入1200 Egr-1抗体稀释液，4留宿，洗膜3次，每次10min，加11500的2抗稀释液室温孵育2h，洗膜3次，每次10min，滴11 Ecl化学发光试剂于膜上，反映1min，压片1min，曝光1min，将胶片进行显影、定影。 Egr-1 mRNA的测定 取-30冰箱保留的100mg心肌组织块，转移到5mL离心管中，每管加入1mL Trizol试剂，用干净的剪子将组织于冰上快速剪碎，用乳化分散仪将心肌组织于冰上充分匀浆，每一标本匀浆30s冰上静置30s，共匀浆3次，匀浆至无明显组织颗粒为止。然后转移至2mL离心管中，室温静置5

12、min，每管加氯仿，振摇15s，室温静置3min，10621g,离心10min(4)，吸取上层水相，移至另一新的离心管中，加预冷的等体积异丙醇，-30冰箱中静置30min，15294g,离心10min(4)，弃上清液，加体积分数75%的乙醇1mL，摇振，充分洗涤沉淀，7600g,离心5min(4)，弃上清液，超净台中干燥2min，沉淀重悬于RNase-free水中，紫外分光光度计测定RNA浓度及A260/A280比值。提取的总RNA冻存于-70冰箱。采纳第一链cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA。采纳PCR扩增反映试剂盒合成DNA。Egr-1引物(512bp)：上游5-GCAACACTTTGT

13、GGCCTGAA-3，下游5-GAGTTGGGACTGGTAGGTGT-3；-actin引物(380bp)：上游5-GTGGGTATGGGTCAGAAGGA-3，下游5-AGCGCGTAACCCTCATAGAT-3。PCR产物经质量分数1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像分析系统进行拍照和图像分析。 统计学处置 所有计量资料以xs表示，采纳单因素方差分析进行组间比较。2 结果 钙拮抗剂对I/R心肌Egs-1蛋白水平的阻碍 各组均以Egr-1灰度与-actin灰度比值进行比较。以I/R组的灰度值为100，那么假手术组、DMSO组、维拉帕米组、地尔硫芭卓组、硝苯地平组灰度值别离为%,%，%,%和%。其中

14、，与假手术组比，I/R组和DMSO组Egr-1蛋白表达显著增高(P<；DMSO组与I/R组比无统计学意义；与I/R组比，维拉帕米组、地尔硫芭卓组及硝苯地平组Egr-1蛋白表达明显减少(P<，图1)。 钙拮抗剂对I/R心肌Egr-1 mRNA水平的阻碍 以Egr-1和-actin光密度值的百分比来反映各组Egr-1 mRNA的转录水平。以I/R组的灰度值为100，那么假手术组、DMSO组、维拉帕米组、地尔硫芭卓组、硝苯地平组灰度值别离为%,%，%,%和%。其中，与假手术组比，I/R组和DMSO组Egr-1蛋白表达显著增高(P<；DMSO组与I/R组比无统计学意义(P>；与

15、I/R组比，维拉帕米组、地尔硫芭卓组及硝苯地平组Egr-1蛋白表达明显减少(P<,图2)。3 讨论 研究说明，心肌I/R损伤的发生与细胞内、外Ca2+散布的破坏即钙超载紧密相关。钙拮抗剂通过阻断心肌细胞膜钙通道，降低细胞(Ca2+)i拮抗钙超载医治心肌I/R损伤已成为目前的一种共识4,5。 Egr-1属于即刻初期基因家族，多种刺激因素(缺血、缺氧等)都可诱导其快速表达。Egr-1初期被以为与细胞的生长分化及肿瘤发生紧密相关。除此之外，Egr-1还参与了多种病理生理进程，是多种细胞外环境的刺激信号与靶基因表达之间的耦联分子6,7。Yan等1采纳反义寡核苷酸(AS-ODN)技术证明，在未经E

16、gr-1 AS-ODN处置的肺组织，I/R进程中，Egr-1表达上调，而异样表达的Egr-1又起着“分子开关”的作用，通过诱导一系列下游基因的表达，最终引发炎症反映、凝血和血管通透性这三大I/R病理损害。本实验的结果也证明，I/R组的Egr-1蛋白和Egr-1mRNA的表达水平较假手术组明显升高，提示Egr-1在I/R病理进程中发挥着超级重要的作用。 Ca2+是细胞信号转导进程中最多见的第二信使，细胞(Ca2+)i升高可通过量条途径磷酸化Ca2+灵敏的基因转录序列，进而调剂靶基因的表达。研究说明，Ca2+可通过磷酸激酶C诱导牛冠状动脉内皮细胞及心肌细胞Egr-1的表达8，另外Ca2+也可通过MAPK、Ca2+/CaM依托性蛋白激酶等途径调剂Egr-1表达9,