苏云金芽孢杆菌杀虫方面的研究及运用进展文档格式.docx

1、1. 苏云金芽孢杆菌的毒素 毒素是苏云金杆菌杀虫的核心，主要有三种：伴孢晶体（杀虫晶体蛋白，Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）即-内毒素，苏云金素即-外毒素，芽孢。1.1 杀虫晶体蛋白（ICPs） 杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins,简称ICPs）是由Cry基因和Cyt基因编码的，自从1981年克隆了第一个ICPs基因，并于1985年发表了他的核苷酸序列起，大量的ICPs基因相继被发现和克隆。他们的分类系统也从最初的基于杀虫活性和基因的同源性的分类系统变为基因的核苷酸序列及其演化关系的分类系统，并且其基因编号也该用阿拉伯

2、数字取代了原来的罗马数字。Cry基因广泛用于转基因作物中，目前对Cry基因及其蛋白的主要分析方法有：PCR-RFLP、核酸分子杂交鉴定等。1.1.1 ICPs基因的命名 传统命名法，Hofte和Whiteley（1989）提出根据杀虫谱进行分类的分类系统，根据基因编码的杀虫晶体蛋白的同源性及杀虫活性，已克隆的42个基因被划分为五类。其中，cryI、cryII、cryIII、cryIV编码的杀虫晶体蛋白分别特异地对鳞翅目、鳞翅目和双翅目、鞘翅目、双翅目有毒力作用，而对双翅目有生物活性且具溶细胞的作用的杀虫晶体蛋白基因则被划入cytA类。随着新的基因不断被克隆和发现，人们发现有些序列相似，但其杀虫

3、活性却不同，而有些基因具有相同的杀虫活性，同源性却又相差很大，所以以序列同源性和生物活性划分类别的分类系统很难高度统一。新的命名法， Crickmore等提出了完全根据ICPs一级结构的序列同源性进行分类的新的分类系统。按照晶体蛋白氨基酸序列的同源性确定其不同的分类等级，而与基因的生物活性无关，这个系统用计算机比较晶体蛋白氨基酸序列的同源性，以45 、78 和95 为界，将基因分为4个分类等级: 同源性在45以下为第一等级，用阿拉伯数字表示；同源性在45、78之间为第二等级，用大写英文字母表示；同源性在78、95之间为第三等级，用小写英文字母表示；同源性在95以上为第四等级，用阿拉伯数字表示。

4、同时还对新基因的命名提出了要求：cry基因包括来自苏云金芽胞杆菌编码伴胞晶体蛋白的杀虫基因或者与已知cry基因有明显的序列相似性的基因，cyt基因是编码具有溶细胞活性的伴胞晶体蛋白或与已知cyt基因有明显的序列相似性的基因。各个等级的划分界限并不是固定不变的，随着新基因的不断添加，等级范围将会相应调整（Crickmore et al, 1998） 。 1.1.2 杀虫晶体蛋白的作用机制一般认为晶体蛋白在昆虫肠道中由于碱性消化液的溶解作用而从晶体形式溶解出来成为原毒素，并在昆虫中肠蛋白酶作用下降解为活性毒素片断，此毒素片断与中肠上皮细胞表面的受体结合，在改变构像后插入到细胞膜中形成离子通道或小孔

5、，导致中肠上皮细胞膨胀并裂解，此时中肠中碱性内涵物进入血腔，使pH值升高，改变渗透压而使昆虫死亡，同时也可能芽胞或营养细胞进入血腔，迅速萌发繁殖，最终使昆虫的败血病而致死（喻子牛，1990）。活性毒素有两种功能：受体结合和形成离子通道。活性毒素与中肠的BBMV（Brash border membrane vesicles）中的受体结合，结合分两步：可逆结合、不可逆结合。不可逆过程使毒素与受体结合紧密进入上皮膜。近来的研究表明，对鳞翅目害虫具有特异性杀虫活性的CrylA蛋白在昆虫中存在两类受体：氨肽酶N（APN）和类钙粘蛋白，他们都属于糖蛋白。Joel等（2005）在线虫中发现糖脂也可以作为Bt

6、蛋白的受体。毒素与受体的结合导致毒素蛋白的构型发生改变，而这种改变对于毒素插入上皮细胞膜是必须的；另一方面，蛋白与受体的结合可以增强蛋白在膜表面的附着，进而导致蛋白的聚合或穿透膜；蛋白插入膜后，形成跨膜的渗透孔洞或通道，引起细胞膨胀，最后造成细胞裂解、死亡。近两年有研究者提出了新的杀虫晶体蛋白的可能作用机制。张学斌等提出Cry1Ab毒素和昆虫细胞之间存在两种不同的作用模式：一是低聚体形式的Cry1Ab毒素和细胞膜脂质进行不依赖受体的非特异性结合，但不导致细胞死亡；一是单聚体形式的Cry1Ab毒素与细胞膜上的Bt-R1受体进行特异性结合，并诱导Mg2+依赖型信号途径的发生，引起细胞起泡、肿胀并裂

7、解死亡，提出Cry毒素引发的细胞死亡是一个复杂的细胞应答过程，而不仅仅是简单的细胞透性改变裂解。Handlesma等（2006）也提出昆虫肠道环境中仅仅只有苏云金芽胞杆菌存在时并不能有效地引发昆虫死亡，而必需有其他机会病原微生物共同存在时才能引发昆虫死亡，说明晶体蛋白毒素需要其他微生物的协同作用，即毒素片断使细胞膜穿孔从而使其它机会病原微生物进入血腔最终使昆虫死亡。1.2 苏云金素苏云金素是苏云芽孢杆菌属（Bacillus thuringiensis）产生的一种小分子量的核苷酸杀虫活性物质，又称-外毒素，具有广谱、低毒、稳定性好、降解慢等特点。它的分子式为C22H32N5O19P3H30,分子

8、量为701，脱磷酸苏云金素的分子式为C22H31N5O16，分子量为621。它是DNA依赖性的RNA聚合酶抑制剂，同ATP竞争酶的结合位点。 苏云金素由核糖葡萄糖部分，葡萄糖别粘酸部分和别粘酸磷酸部分组成。所含腺嘌呤、核糖、葡萄糖和磷酸的分子比为1111。 由于结构的差异，苏云金素有多种类似物，然而，脱磷酸的苏云金素便失去了对昆虫的毒性。已有两种方法能全合成苏云金素，合成路线基本相同，反应顺序如下： （葡萄糖+核酸）十别粘酸+腺嘌呤+磷酸苏云金素可用同位素、高效液相色谱、离子交换树脂层析、微生物等测定方法，然而，用家蝇幼虫进行的生物测定，乃是准确的经典方法。由于苏云金素具有广谱性等特点，因此具

9、有广泛的用途和良好的研究前景。张继红等（2000）研究表明苏云金素A与苏云芽孢杆菌芽孢晶体混合一起使用，可以使棉铃虫的死亡率显著提高。1.3 芽孢芽孢既是病原，又是毒素，当中肠细胞受伴孢晶体损伤后，活芽孢便萌发成营养体穿透肠壁进入血液，并在那里大量繁殖，使害虫患败血症死亡。然而，由于芽孢衣蛋白质与伴孢晶体蛋白质的同源性致死,芽孢致死害虫的剂量、死亡斜率、致死症状与伴孢晶体相近。2. 具有杀虫功效的其他基因2.1 Chi基因几丁质酶（Chitinase，Chi ）是微生物、高等植物和昆虫体内普遍合成的一种具有生物催化活性的水解酶类，能特异地催化水解几丁质的糖苷键生成乙酰葡萄糖胺。昆虫的外骨骼和中

10、肠围食膜均含有几丁质。围食膜是昆虫防止病原入侵的一道天然屏障，几丁质酶水解围食膜促进杀虫微生物对昆虫的侵染，有杀虫增效作用。Bt有近10个亚种能产生几丁质酶，有些还有较高的产酶活性，并且一些Bt产的几丁质酶与其宿主昆虫的死亡率有较高的正相关。因此，对几丁质酶的分离纯化成为未来主要的研究工作。Chi基因目前也广泛运用于转基因作物中，它在具有杀虫增效的同时，也有增强抗病性的功效。转Chi基因的小麦对白粉病的抵抗能力增强并且能够稳定的遗传和表达（李新玲等，2008）。转几丁质酶-葡聚糖酶双价基因的籼稻植株抗病、抗瘟能力增强（王志成等，2009），许明辉（2002）在转几丁质酶-葡聚糖酶双价基因的滇型

11、杂交水稻恢复系中也得到抗瘟性的结果。朱荷琴（2011）在转几丁质酶-葡聚糖酶双价基因的棉花株系中也发现其对黄萎病的抗性得以增加。从近些年的一些研究来看，几丁质酶及其相关基因的实用性不亚于杀虫晶体蛋白。2.2 VIPs 基因 营养期杀虫蛋白（Vegetative Insecticidal Proteins，简称VIPs）是Bt在营养期分泌的的一种很有应用前景的杀虫蛋白主要分为VIP1、VIP2、VIP3三种，VIP1和VIP2构成二元毒素，对鞘翅目叶甲科的昆虫具有杀虫特异性，而VIP3对鳞翅目昆虫具有较广的杀虫活性。它从对数生长中期开始分泌，直到稳定前期达到最高峰。它与苏云金素不同，具有热不稳定

12、性。某些Vip蛋白具有独特的杀虫活性，一些对Bt杀虫晶体蛋白有很强抗性的昆虫对Vip都较为敏感。如VIP3A不仅对鳞翅目昆虫具有广谱杀虫活性，而且对抗Bt杀虫蛋白的昆虫（小地虎等）有特效，并且毒性要比Cry1Ac高260倍（陈建武等，2002）。所以，Vips的发现弥补了ICPs的不足，为更有效地利用ICPs提供了可能，如转Cry-Vip融合基因可使植株更好的表达对虫的抗性（Ryan等,2007；方军，2008；）。可目前VIPs的杀虫机理、进行新杀虫活性物质的筛选、VIPs嵌合蛋白的构建和VIP及其融合基因导入其他宿主微生物方面的研究都具有诱人的潜在应用前景。3. Bt的应用及应用中所遇的问

13、题苏云金芽胞杆菌对多种昆虫都有很高的杀虫活性，而且具有对环境和人畜无损害等优点，因此被广泛地应用于转基因植物与生物农药的开发。利用Bt杀虫毒蛋白基因可以构建载体对植物进行转化，现阶段已成功培育出抗虫棉花（Gossypium sp.）、烟草（Nicotiana tabacum L.）、蔬菜以及杨树（Populus sp.）等抗虫品种。同时，基于苏云金芽胞杆菌开发的生物杀虫剂也已经成为最成功的一种生物农药，占到了整个生物农药行业90%以上的市场，广泛地应用于农业、林业和仓储等害虫的防治。3.1 Bt微生物农药 化学农药的广泛应用带来了污染环境、害虫产生抗药性及害虫再次猖獗等问题，基于对环境安全的考

14、虑，各国政府竞相采服措施，限制化学农药的使用，大力推广生物安全、无环境污染的生物农药，这使得微生物农药，特别是Bt杀虫剂迅速发展并占有越来越多的份额。近年来，甜菜夜蛾、斜纹夜蛾在我国主要蔬菜产区发生趋势逐年加重，造成巨大的损失。此外，甜菜夜蛾、斜纹夜蛾还为害大豆、花生、玉米、棉花及园林植物等。在东南亚一带甜菜夜蛾、斜纹夜蛾的发生也十分严重。目前主要采用化学药剂防治，但田间防效不甚显著；而抑太保、米螨等抑蜕皮激素类杀虫剂又极易产生抗性。常规Bt制剂对甜菜夜蛾及斜纹夜蛾的田间防治效果较低。因此，开发高效Bt制剂用于上述害虫的防治迫在眉睫，并具有广阔的市场潜力和良好的经济效益。3.2 推广中的问题国

15、内外大量试验表明，一般应用Bt还是安全的。但是有两点必须给予关注：一是有些菌株含有-外毒素，它对哺乳动物等有毒，欧美国家禁止使用。有些国家采用含-外毒素的Bt产品防治家蝇，但许多机构则禁止使用。第二个问题也是争论比较多的是Bt如何与Bc分清楚。因为后者会导致人的呕吐和腹泻。二者都含有肠毒素基因，只不过根据研究，Bt的基因表达量很低而已。随着Bt杀虫剂和Bt转基因植物的不断推广和使用强度的不断增加，害虫对Bt产品可能产生的抗性从而导致Bt基因的相对退化进而失去抗虫活性，是目前阻碍Bt产品研发与推广的一个很严重的问题。由于我国目前Bt产品的应用范围广泛，抗性问题将在不久的将来变得尤为突出。解决这一

16、问题的有效途径之一就是寻找新的高活性菌株或是新的杀虫晶体蛋白基因。新的高活性菌株用以显著提高现有商业菌株的杀虫活性，可以起到延缓昆虫对Bt产品产生的抗性，因此，寻找新的高活性菌株或是新的杀虫晶体蛋白基因资源是一项有重要意义的研究。4. 展望 人类对健康和生态平衡的关注，使得基因工程及其产品的安全性问题成为全世界研究的重要课题。在对基因工程产物利用时，需要进行安全性评价，故大量的基因工程菌株与转基因植物还仍处于试验阶段，转Bt作物也不例外。随着人们对绿色食品及生态环境的的关注，生物农药及抗虫植物会有广阔开发与应用前景，另外Bt与昆虫互作机制的研究以及Bt杀蚊、杀线虫等方面的研究也将成为热点。参考

17、文献：1. 喻子牛苏云金杆菌北京：科学出版社，19902. 沈鞠群，王锦举，喻子牛苏云金杆菌制剂的标准化程序和方法生物防治通报，1990， （增刊） ：12-162. 郭承亮,刘晓艳.苏云金芽孢杆菌产苏云金素菌株CT-43及其缺失突变株的差异蛋白.微生物学报，2008，48（7）：970-9743. 张继红，王琛柱.苏云金杆菌-内毒素、芽孢及苏云金素A对棉铃虫毒性及拒食性的比较.昆虫学报，2000，（增刊）：85-914. 胡晓婷，宋福平，宋健.Bt分子生物学研究进展.华北农学报，2007，6-95. 中国科学院微生物研究所伯杰细菌鉴定手册翻译组. 伯杰细菌鉴定手册.北京：科学出版社，1984

18、6. 陈建武，余键秀，胡晓晖，庞义.苏云金杆菌营养期杀虫蛋白的研究.中国微生物工程杂志，2002，22（3）:33-367. 李新玲，徐香玲，张楠楠.转几丁质酶基因的小麦后代遗传分析和抗病性鉴定.植物生理学通讯，2008，44（1）：65688. 王志成，易自力，蒋建雄，覃静平，肖亮，储成才.几丁质酶基因和葡聚糖基因转化籼稻的研究.湖南农业大学学报，2009，35（4）348-3519.朱荷琴，冯自力，李志芳，赵丽红，师勇强，尹志新，几丁质酶基因和葡聚糖双价基因棉花株系对黄萎病的抗性，棉花学报，2011，23（1）：58-6310.方军（2008）苏云金菌营养期杀虫蛋白Vip3基因及其在水稻中

19、的应用.博士论文，浙江大学，导师：程家安：64-6511. Xuebin Zhang, Mehmet Candas, Natalya B. Griko, Ronald Taussig, and Lee A. Bulla, Jr. A mechanism of cell death involving an adenylyl cyclase/PKA signaling pathway is induced by the Cry1Ab toxin of Bacillus thuringiensis. PNAS 2006, 103:9897-990212. Crickmore N, Zeigler

20、D R, Feitelson J, Schnepf E, Van J, Rie, Lereclus D, Baum J, and Dean D H. Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol Biol Rev, 1998, 62:80781313. Nichole A, Broderick, Kenneth F. Raffa, and Jo Handelsman. Midgut bacteria required for Bacillus thuringiensis insecticidal activity. PNAS 2006, 103: 15196-15199. 14. Ryan W.Kurtz AM, David OReilly（2007） Insect resistance management for Syngenta,s VipCot transgenic cotton. Journal of invertebrate pathology 95:227-230