生物工程工艺综合性实验报告Word格式文档下载.docx

1、 1 仪器设备：电子分析天平 手提式蒸汽灭菌锅、自动控制蒸汽灭菌锅 双孔水浴锅 1000W电炉 5台 生物显微镜、电脑成像生物显微镜 生物培养箱、培养摇床 真空干燥箱 紫外可见分光光度计 离心机 真空泵、真空干燥器 蒸发器 气象色谱仪 2 药品和耗材： 药品：可溶淀粉 1瓶，蛋白胨 1瓶，琼脂，饴糖麦芽1000克，大米粉 5公斤，硝酸钠NaNO3 1瓶，磷酸二氢钾KH2PO4 1瓶，磷酸氢二钾K2HPO4 1瓶，硫酸镁MgSO47H2O 1瓶 ,硫酸铵（NH4）2SO4 1瓶，氯化锰MnCL2 1瓶，硫酸锰MnSO4H2O 1瓶，碳酸钙CaCO3 1瓶，维生素B1（盐酸硫胺素）1小瓶，酵母膏1

2、瓶，乳酸，葡萄糖1瓶，乙醇5瓶（5500克），乙醇（色谱纯Aladdin） 2瓶,丁醇2瓶，丙酮2瓶，叔戊醇2瓶 耗材：500ml三角瓶50只， 250ml三角瓶16个，100ml粗口径试管50只，1000ml烧杯10个，培养皿160套，常规试管160个，200ml烧杯16个，1ml移液枪头5盒，标签纸若干，玻璃真空干燥器大号1个，波美计8只，移液枪2只，玻璃珠2盒，100ml量筒8个，500ml量筒2个，称量纸2盒，不锈钢试剂勺4根， pH试纸2包，玻璃棒若干，玻璃推棒32根，5ml移液管16只 五、实验方法步骤和具体操作过程 红曲的发酵实验及其抑菌作用研究 红曲是一种具有一定营养和药理作用

3、的纯天然红色素，可赋予肉制品、食品、饮料等鲜艳的色泽及特殊风味，而且具有较好的营养价值和一定的防腐作用，因而被广泛地应用于食品工业。 红曲是红曲霉经发酵分泌到胞外的一种色素，发酵的主要原料是淀粉类如大米、薯类等。红曲霉发酵合成色素同时对有害菌产生抑制作用。本实验分为两个部分，前一部分为红曲的发酵实验，后一部分为红曲的抑菌试验。 红曲的发酵实验 1菌种 本实验室保藏的红曲霉菌种monascus purpureus。用本实验室自主设计的保藏方法，在短梗霉多糖膜片中封存，置于冰箱中保藏。使用时每取出一片，进行活化，然后作为种子扩大培养。 2培养基 斜面试管和平板培养基： 饴糖培养基：68。Bx饴糖1

4、00 mL，可溶淀粉5 g，蛋白胨3 g，琼脂2 g，121灭菌30。每大组制备200ml用于制作平皿 用于菌种活化则不加琼脂，100ml饴糖培养基装入500ml三角瓶中121灭菌30分钟备用 *饴糖的制备：大麦芽50克，粉碎后加入4倍于麦芽重量的水，搅拌均匀，在55至60的保温箱中糖化4小时，取出过滤得麦芽汁，测波美度，灭菌备用。 以上麦芽汁的制备分为四个大组进行实验，每大组做2瓶试样， 种子培养基为： 大米粉3% ，硝酸钠% ，KH2PO4 % ， MgSO4 % , 250ml三角瓶中装量100ml，乳酸调，121灭菌30分钟备用每小组做一瓶 发酵培养基为： a. 大米粉9% ，硝酸钠%

5、 ，KH2PO4 %， MgSO4 % ，乳酸调 b. 小麦粉9% ，硝酸钠% ，KH2PO4 %， MgSO4 % ，乳酸调 c. 玉米粉9% ，硝酸钠% ，KH2PO4 %， MgSO4 % ，乳酸调 d. 木薯粉9% ，硝酸钠% ，KH2PO4 %， MgSO4 % ，乳酸调 e. 土豆粉9% ，硝酸钠% ，KH2PO4 %， MgSO4 % ，乳酸调 f. 称取100g籼米热水浸泡1小时，沥干，入玻杯中，灭菌锅中蒸30分钟，冷却后接入种子液，摇匀，培养35天，米粒呈紫红色 *分为四大组，每组一个配方进行实验，配方e.、f.作为自选项 3菌种活化 在净化操作台上操作。保藏于短梗霉多糖薄膜

6、的保藏片，用灭过菌的剪刀将其外包装塑料膜剪开，再用灭过菌的镊子将里面的短梗霉多糖膜片夹出，置于装有100ml饴糖培养基的500ml三角瓶中，在恒温摇床上（28士1），以200转速度震荡培养3天左右至瓶中浑浊有颜色变化有孢子生成 4平板单菌落超净工作台擦拭干净，打开紫外灯提前灭菌15分钟至20分钟。 准备9个平皿、玻棒、推棒、1ml移液吸管头1包、9只试管分 别装9ml生理盐水，包扎灭菌好，放入净化操作台备用。 配制加有琼脂的饴糖培养基200ml，三角瓶中灭菌好，放入净化操作台，待培养基冷却至50左右，将其分别平均倒入9个平皿中，待其冷却凝固。 将三角瓶中活化好的红曲孢子，用移液枪吸取1ml，放

7、入其中1只装有9ml生理盐水的试管中，玻棒搅打均匀。再用移液枪吸取上述试管中的液体1ml放入装有9ml净化水的试管2中，依此类推，逐步稀释，至第9只试管。将上述试管中的第3、第4、第5、第6、第7，五只试管中稀释的孢子各吸取，涂布在已经凝固好的平板上。从最稀的第7只开始涂布，到较浓的第3只。以玻棒推平，同样也是从最稀的开始逐个推平。置于恒温培养箱中28培养至明显的单个菌落出现且能观察到孢子生成。 5种子培养 配制种子培养基121灭菌30分钟，放入无菌操作台，待其冷却至常温，将上述平皿上长出的单个菌落上的红曲孢子挑取一环接入三角瓶种子培养基中，放置培养摇床上2830，200rpm转速培养，每日在

8、超净工作台上取样观察，至有较多的菌丝生成，将转速调整到160rpm，待有孢子生成即可作为种子。 6发酵培养 分为4大组，分别配制大米粉培养基、小麦粉培养基、玉米粉培养基、木薯粉培养基，500ml三角瓶装量100ml，121灭菌30分钟，放入无菌操作台待冷却至常温。 在超净工作台上将上述培养好的种子培养液用移液枪吸取2ml，接种于已灭六 、实验报告 1. 要求每人有完整的原始实验记录，实验记录连同实验报告一起交老师评分。 2. 实验报告主要内容： 实验名称 实验原理 实验仪器设备和化学试剂 实验菌种名称，培养基和实验方法，包括分析方法；实验步骤按顺序填写 实验结果，包括菌的生长曲线，产物的生成曲

9、线，分析图谱，每批实验的产物量，列表，以及对比分析，说明等 查阅的与实验相关的入废液缸。沉淀物用95%的乙醇浸提9:43 3在无菌操作台上，从大米三角锥瓶中，取大于5g大米。取出后，再用天平称量8g，用40ml95%的乙醇浸泡，用牛皮纸封口10:46。 4测红曲4号样的吸光度，?A4= ，?B4=16:10 5.从摇床上取出实验组，取出对照组，重复6月7号二过程，离心管A为实验组，B为对照组，记为6号样16:16，操作完毕，三角锥瓶放回原位。离心管离心5min，3500r/min，将A中上清液倒入一离心管，测吸光值。B中上清液倒入废液缸。沉淀物用95%的乙醇浸提16:27 6月8号 1.测红曲

10、5号样的吸光度，?A5= ，?B5=8:56 2.从摇床上取出实验组，取出对照组，重复6月7号五过程，离心管A为实验组，B为对照组，记为7号样8:45，操作完毕，三角锥瓶放回原位。沉淀物用95%的乙醇浸提8:56 3.取6月7号8g大米用乙醇浸提液，离心5min，测吸光度，用酒精稀释8倍后，?=10:48 4.测红曲6号样的吸光度，?A6= 后，?A6=16:14 6月9号 1测红曲7号样的吸光度，?A7= ，?B7=11:19,实验组稀释2倍后，?A7=11:24 5）实验结果 6）实验结果分析 影响红曲发酵的因素：1.菌种：应选择生长快，适应性强，产红色素明显的菌株；2.原料：一般选用无粘

11、性的粳米或籼米，其淀粉含量高，营养丰富，且可，?B6=16:09,实验组稀释2倍吸收适量水分。米的含水量对发酵影响很大，起始水分含量低，红曲色素易生成；水分含量高，会抑制色素合成。一般米中含水量以25%-30%为宜；3.补水:红曲霉在生长繁殖过程中，需补充适量的水分，尤其在生长旺盛期补水显得更加重要；4.湿度：空气相对湿度关系到水分的蒸发，对发酵的影响也很大，一般RH控制在85%以上；5.温度：能在20-37范围内生长，通常冷却至30发酵；6.通气：红曲霉是一种好氧性微生物，因此培养过程中要注意保持良好的通气。鉴于以上这些客观因素每组都相同，因此结果不同可能是主观原因，比如培养基成分漏加，错加

12、，重复加；摇瓶时培养瓶所处的位置；取样时所取菌种的量不同；加酒精浸提的量不同；观察时间和取样时间不同；调pH值时，有的加了乳酸，有的未加，加了的加的滴数不同等等。 丁醇的发酵试验及其气相色谱检测 1）实验原理： 丙丁梭状芽孢杆菌经厌氧发酵将农副产品转化为丁醇和丙酮。 2）实验仪器设备和化学试剂 1、 实验仪器：电子分析天平，手提式蒸汽灭菌锅，自动控制蒸汽灭菌锅，双孔水浴锅，电驴，生物显微镜，恒温培养箱，培养摇床，真空干燥箱，紫外可见分光光度计，离心机，真空泵，真空干燥器，布氏漏斗，蒸发器 2、化学试剂：玉米粉，葡萄糖，玉米浆，硫酸铵，磷酸二氢钾，碳酸钙、氢氧化钠 3）试验菌种名称，培养基 1菌

13、种：丙酮丁醇梭状芽孢杆菌 2.培养基：发酵培养基 玉米培养基 葡萄糖培养基 4）实验步骤 1丙酮丁醇梭状芽孢杆菌发酵培养基配制 玉米培养基：一大组配2大瓶 每瓶 电炉煮沸 灭菌：用10层纱布包裹瓶口，牛皮纸、细线密封。121，30min。同时每小组放2个50mL试管一起灭菌 2接种 在无菌操作台上，将种子液上清液倒出，下部细胞搅匀分装。再倒入灭菌好的玉米培养基，于沸水中煮沸2min，在自来水管下迅速冷却至常温 3抽真空，培养 接种好的试管一起放入真空干燥器抽真空，然后连同真空干燥器一起放入恒温培养箱中，37静置培养。 5月28号 观察丙酮丁醇梭状芽孢杆菌发酵情况：两个试管中都有泡盖部分形成，有

14、气泡产生。 其他组：有些只有气泡，没有泡盖形成，有些组部分形成泡盖 5月29号 1.挑泡盖 【见图六】 两个试管培养基中都有明显泡盖形成，于无菌操作台中将发酵培养基上的泡盖挑出，继续培养。所有组都有明显的泡盖形成，统一于无菌操作台挑出泡盖。 2油镜观察 在无菌操作台上，用接种环挑取试管A底部菌体，涂片于涂有生理盐水的载玻片上，用酒精灯烘干固定，油镜观察【见图七】 5月30号1油镜观察 在无菌操作台上，用接种环挑取试管A底部的菌体，涂布滴生理盐水的载玻片上，在酒精灯上烘干固定，染色2min,洗去染液，用油镜观察【见图八】 6月5号 1. 葡萄糖培养基配制 葡萄糖18g，2SO4 玉米浆3,0g

15、KH2PO4将上述四种用150mL溶解， CaCO3 用150mL水尽量溶解，PH 要求 滴加了4滴NaOH,封口，灭菌121，30min 2接种培养 在无菌操作台上，将号厌氧发酵A中上清液倒入一空试管，底部的孢子倒入上午灭菌的空锥形瓶里，再将上午灭菌好的葡萄糖培养基倒入装有孢子的锥形瓶中，从中取5mL于离心管中测吸光值，完后，封口，置于沸水中热激活2min，迅速用冷水冷却，抽真空，放入恒温箱32培养 3测上一条离心管中样液在600nm处的吸光值 = 4测葡萄糖消耗量 将上述离心管离心5min，3500rpm，在生物传感分析仪测葡萄糖消耗量取1mL上清液，加99mL蒸馏水，即稀释100倍，测得

16、葡萄糖含量为47mg/dL 6月6号 1 将号下午做的丙酮丁醇发酵培养液取样5mL，测吸光值，此为1号样 对照组取5ml，测吸光值。 以蒸馏水为对照， 实验组=,对照组= 以对照组为参照。 实验组=2重复上午丁醇发酵试验的取样步骤，制丁醇2号样以蒸馏水为对照， 实验组= 对照组= 以对照组为参照。 实验组= 从实验组中取1ml，加入蒸馏水49ml，测葡萄糖消耗量 测得的葡萄糖含量：第一次：80mg/dL，第二次：78mg/dL6月7号 1取丙酮丁醇的发酵液5ml，制丁醇3号样 对照组取5ml，测吸光值。 以蒸馏水为对照， 实验组=，对照组= 稀释2倍后，实验组= 对照组= 以对照组为对照，实验

17、组= 稀释2倍后，实验组= 稀释前时间为9:50 稀释后时间为10:02 将实验组离心后，去上清液1ml，加蒸馏水稀释50倍，测葡萄糖含量：第一次60mg/dL 第二次：60mg/dL 2取丙酮丁醇的发酵液5ml，制丁醇4号样 对照组取5ml，测吸光值。第一次67mgdL 第二次：68mg/dL6月8号 1取丙酮丁醇的发酵液5ml，制丁醇5号样 实验组稀释4倍后= 将实验组离心后，去上清液1ml，加蒸馏水稀释30倍，混合均匀后，测葡萄糖含量：第一次77mg/dL 第二次：79mg/dL2取丙酮丁醇的发酵液5ml，制丁醇6号样 实验组稀释8倍后= 将实验组离心后，去上清液1ml，加蒸馏水稀释30

18、倍，混合均匀后，测葡萄糖含量：第一次70mg/dL 第二次：71mg/dL 6月9号 1取丙酮丁醇的发酵液5ml，制丁醇7号样 实验组稀释8倍后= 将实验组离心后，去上清液1ml，加蒸馏水稀释30倍，混合均匀后，测葡萄糖含量：第一次32mg/dL 第二次：31mg/dL 2从冰箱里取出丁醇上清液A试管中倒入39ml，B试管中倒入36ml共75ml。倒入圆底烧瓶进行蒸馏。蒸馏出馏分62ml，将此馏分装于150ml的锥形瓶中，套上橡皮塞。 【蒸馏装置见图九、图十】 3制片，用油镜观察芽孢形态。 先用接种环挑取上述二中处理过的芽孢于干净的载玻片上，置于酒精灯上固定，固定好后用孔雀绿染色，并在火焰上固

19、定，固定过程中要滴加孔雀绿保持湿润，不能烤干，十分钟后用蒸馏水洗净，动作要轻，以免将菌体冲洗干净，再用番红复染，静置一分钟，在用蒸馏水洗净。滴加香柏油，置于载物台上，用油镜观察。【见图十一、十二】 6月10号 取蒸馏液，加入 2%的叔戊醇，在加60%的酒精定容至10ml，用玻璃棒搅拌均匀后，上气相色谱仪。分析图谱见附录 5）实验结果 丁醇含量20V馏出液/V馏前液=62/75=/100ml 6）实验结果分析 鉴于客观因素每组都相同，因此结果不同可能是主观原因，比如培养基成分漏加，错加，重复加；观察时显微镜操作方式不同；制片操作手法不同；稀释倍数不同；调pH值时，有的加了NaOH，有的未加，加了

20、的加的滴数不同等等。 试验对动手能力培养的收获及试验中获得的经验教训建 这是我做的第一次为期这么长时间的的实验。在做实验前，我以为这会是一个很难做的实验，和以前那种半天就可以完事，做完实验然后两下子就可以将实验报告做完的实验不一样。但当我真的着手去做时才发现也没有那么难，都是我自己吓自己吧了。 不管难与易，在做实验前，一定要先把老师发的讲义大概看一遍，了解实验的大概方向，当老师讲解时一定要认真听，虽然老师分给我们四个人一个小组，但是只有每个人都了解清楚了，我们的小组才能配合的更加默契，我们的速度才会更快，实验结果才会更加令人满意。这次实验让我体会到作为一个团队齐心协力，默契很重要。另外做实验时

21、，一定要亲力亲为并且弄清楚每一个环节，弄明白。生物实验特别要注意操作，操作一定要规范，严格要求自己要用科学严谨的态度对待实验，因为生物实验与其他的化学实验物理实验不同特别要注意不能染菌，接种时一定要在无菌操作台进行，勤消毒灭菌。这次实验让我见识到了一些以前没有见过或不曾亲手操作过的仪器如生物传感器，摇床，气相色谱仪等等。增长的我许多见识及动手操作能力，希望下次还有机会做这样的实验。 附录 时间/h 吸光值 脂溶性色素 水溶性色素 总色素 0 48 5468 72 90 96 1120 3 吸光值 0号样 1号样 2号样 3号样 4号样 5号样 6号样 7号样 时间h 以蒸馏水为参照实验组 葡萄糖含量 5 5 1742 0 18 23 41 48 64 71 90 g/ml 丙酮丁醇馏出液气相色谱图 峰号峰名保留时间峰高峰面积 含量12丙酮 34乙醇 5叔戊醇 6 7丁醇丙酮丁醇馏出液气相色谱图 峰号峰名保留时间峰高峰面积 含量12丙酮 34乙醇 5叔戊醇 6 7丁醇