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1、将脱分化的愈伤组织转移到适当的培养基上继续培养，这些无定形的愈伤组织又会重新分化出具有根、茎、叶的完整植株-再分化（re-differentiation）。2离体器官分化途径 离体器官的分化方式有许多种，最常见的有三种：一是由分生组织直接分生芽；二是由分生组织形成愈伤组织，经过分化实现细胞的全能性；三是游离细胞或原生质体形成胚状体（embryoid），由胚状体直接重建植株。三植物组织培养的历史 根据细胞学说，德国植物学家Haberlandt于1902年提出细胞全能性概念，认为离体培养的植物细胞具有通过胚胎发生过程而发育成完整植株的潜在能力。White在1939年报道了由烟草种间杂种幼茎切断的形

2、成层组织，进行组织培养获得成功并能继代培养，他提出了植物细胞全能性的学说。20世纪40年代末50年代初。Skoog和崔澄等人进行烟草髓培养诱导根、芽器官，获得成功。1958年美国Steward等和德国Reinert等分别由培养的胡萝卜根细胞诱导形成了胚状体，形成新植株。这从实验上证明植物细胞的全能性。我国的李继侗等曾作银杏离体培养，发现其胚乳提取物能促进离体胚生长。 罗士韦是我国植物组织培养和细胞培养研究的开拓者和奠基人之一。在30年代即开创离体根培养，随着又进行幼胚和茎尖培养。解放后，特别是70年代以后，身体力行，指导植物组织培养技术的推广工作，取得了很大成效。近二三十年，我国植物组织培养研

3、究工作取得了很大成就，特别是在花药培养和单倍体育种上处于世界领先水平。在果树、林业、花卉等方面也取得了很大成功。四植物组织培养的应用1无性系快速繁殖；2花药培养和花粉单倍体育种；3药用植物的工厂化生产；4种质的保存和基因库的建立；5突变体的筛选培育。第一章 实验室设备和一般技术教学时数 2教学重点 实验室设计和常用器材的使用。教学难点 无菌概念和无菌操作。教学目的 通过本章教学，让学生对植物组织培养实验室有个初步的认识，明白无菌操作的概念及其在组织培养中的重要性，掌握常用设备和器皿的基本操作。教学方法 讲授、图示、参观及操作示范。第一节 实验室设计植物组织培养实验室通常包括通用实验室、接种室、

4、恒温培养室、检查培养情况并做记录的细胞学实验室。此外还需有相应的花房和试管苗移栽房等。一通用实验室 主要用于植物组织培养所需器皿的洗涤、干燥和保存，培养基的配制、分装和灭菌，化学试剂的存放及配制，蒸馏水的生产，待培养植物材料的预处理及培养物的常规生理生化分析等操作。二接种室接种室主要用于植物材料的消毒和接种，培养物的继代转移等等。它是无尘、无对流空气的非常洁净的实验室。要求进入室内的工作人员的衣物、鞋帽、头发、手和脸都要十分清洁，避免带入杂菌造成污染。1无菌操作室（顺便交代无菌操作概念）无菌操作室最好设有内外两间：外间是缓冲室，内间是无菌操作室，缓冲间可使工作人员进入无菌操作室前有一个过度，以

5、减少将室外杂菌带入无菌操作室。无菌操作室是无菌操作的重要空间，墙壁和地面要光滑，便于清洗和消毒。室内要定期消毒、灭菌。2接种箱在条件较差的情况下，可考虑自制无菌箱来代替无菌操作室。现一般不常用。3超净工作台超净工作台一般由鼓风机、滤板、操作台、紫外光灯和照明灯等部分组成。根据风幕形成的方式，可分为垂直式和水平式两种。超净工作台的工作原理是：鼓风机送入的空气经过细菌过滤板除去微生物后，再流过工作台面，并在操作人员和操作台之间形成风障，使杂菌不能进入，形成一个无菌的工作面。三培养室 培养室是培养试管苗的场所，要满足外植体生长所需的温度、光照、湿度和空气等条件。室内温度通常要求在25左右，一般采用空

6、调机来控制。光源通常采用普通40W的白色日光灯，每层培养架安放24支日光灯管。有可能的话可考虑增设一个暗培养室，作为那些不需光照的外植体培养场所，如愈伤组织诱导等。培养室的墙壁最好用隔热性能良好的材料，少受外界温度的影响。 培养室的湿度应保持在7080%。此外在培养室内可放置液体培养需用的摇床或旋转床等。四洗涤室 大量生产时应另辟一个洗涤室，装有水槽以清洗用具，地面要耐湿并能排水。灭菌锅、蒸馏水器、干燥箱等可从通用实验室移到本室，方便操作。 除上述几种主要房间外，假如条件许可，也可以再建立摄影室、人工气候室、试管苗练苗室等。第二节 常用设备和器材一高压蒸汽灭菌锅 1种类： 2原理 3使用方法

7、4注意事项二接种工具 常用的有：双筒实体显微镜、镊子、剪刀、解剖刀、酒精灯等。三培养设备空调机、定时器、温度控制器、增湿和去湿机、培养架、摇床或旋转床、日光灯、光照培养箱等。四化学实验及分析设备 天平、酸度计、蒸馏水器、烘箱、电炉、药品柜、冰箱、废污物桶等。五培养物细胞学观察设备 主要包括显微观察设备、组织切片染色用设备、照相冲洗设备。第三节 玻璃器皿的选择与清洗一玻璃器皿的选择 常见的有：试管、三角锥瓶、培养皿、果酱瓶等。二玻璃器皿的清洗 1洗涤剂：肥皂、洗洁精、洗衣粉和铬酸洗涤剂。一般用洗衣粉即可。 2新购置的玻璃器皿由于它们或多或少含有游离碱性物质，使用前先用1%稀盐酸内浸泡一夜，然后用

8、肥皂水洗净，清水冲洗，最后用蒸馏水冲淋一便，干后备用。 3对已被霉菌等杂菌污染的玻璃器皿则必须现在121高压蒸汽灭菌30分钟后再清洗。 4洗净的玻璃器皿应透明发亮、内外壁水膜均匀，不挂水珠。第二章 培养基及其配制教学时数 3教学重点 培养基成分及其作用、培养基配制程序教学难点 培养基配制程序及方法教学目的 通过本章教学，使学生掌握培养基配制方法，了解培养基各成分的作用及不同培养基的特点。教学方法 讲述、讲授结合实物演示及实验植物组织培养的成功与否，除了培养材料本身的因素外，很大程度上取决于对培养基的选择。培养基的种类、成分等直接影响材料的生长发育，故应根据培养材料的种类和部位，选取适宜的培养基

9、。不同的培养基特点不尽相同，了解和分析它们的特点，既便于选择合适的培养基，又可在组织培养中开发新的培养基。第一节 培养基的成分 植物组织培养基都是由无机营养物、炭源、维生素、生长调节物质和有机附加物等几大类物质组成。一无机盐 无机盐包括大量元素和微量元素。大量元素是指碳、氢、氧、氮、磷、钾、硫、钙、氯、镁。 氮通常是指硝态氮或氨态氮，但在培养基中多以KNO3或Ca（NO3）2的硝态氮形式来满足培养物对氮素的需求，或将两种混合使用，有时也以硝态氮为主，补加（NH4）2SO4以满足酸性植物的需要。 磷是植物的必须元素之一，参与植物生命活动中核酸、蛋白质合成、光合作用、呼吸作用、及能量的贮存、转化与

10、释放等重要生理生化过程，因此在组织培养物中需大量的磷。 钾是主要的阳离子，近年来在培养基中的用量呈逐渐提高的趋势。钙、钠、镁的用量较少。 微量元素是指铁、硼、锰、锌、钴、钼、铜等，其需要量很少，一般多为10-510-7mol.L-1，稍多则产生毒害。二炭源和能源植物组织培养中被培养的外植体，由于其光合作用的能力较低，需要在培养基中添加一些碳水化合物作为生长发育的能源。一般是添加蔗糖、葡萄糖和果糖，其中以蔗糖为最常用，效果也最好。然而在体细胞组织培养中，葡萄糖、麦芽糖和山梨醇也有影响；在花药培养中，麦芽糖也有促进作用。糖类在培养基中除了作为碳源和能源以外，还具有维持培养基一定的渗透压的作用。大多

11、数植物细胞对蔗糖的需求范围是1%5%，但个别植物组织培养中蔗糖的浓度也可高达7%甚至15%，如玉米、油菜等植物的花药培养。一般来说，蔗糖作为碳源和渗透剂的比例约为3：13：2，即约有1/42/5的蔗糖用于保持培养基的渗透压。三维生素类维生素类与植物体内各种酶的形成有关。维生素的种类很多，在植物组织培养中通常以B族维生素为主，使用浓度一般为0.11.0mg/L，其中以盐酸硫胺素（B1）、盐酸吡哆素（B6）、维生素B12、烟酸、生物素和维生素C最为常用。在各种维生素中，Vit.B1可能是必需的。其它可能只对外植体的生长起促进作用。肌醇本身不促进外植体的生长，但可能有助于活性物质发挥作用，从而促进外

12、植体生长、胚状体及芽的形成。培养基中肌醇的用量为50100mg/L。四氨基酸及有机附加物 在一些培养基中可加入一些氨基酸，如甘氨酸（Gly）、丝氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）、谷氨酰胺（Gln）、天冬酰胺（Asn）等，它们是培养基中重要的有机氮源。甘氨酸能促进离体根的生长，对植物组织培养物的生长也有良好的促进作用，一般用量为23mg/L。丝氨酸和谷氨酰胺有利于花药胚状体的形成或不定芽的分化。水解酪蛋白（CH）和水解乳蛋白（LH）也是多种氨基酸的混合物，对胚状体或不定芽或多胚的分化有良好的促进作用，常用量为500mg/L。酪氨酸可不同程度地替代水解酪蛋白或水解乳蛋白的作用。在某些植物组织培养中

13、还加入一些天然的有机物，例如椰子乳1020%，酵母提取物0.5%，番茄汁510%，香蕉泥100200mg/L，其作用是提供一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素等。如培养基中加入100200mg/L的香蕉泥，具有较大的pH缓冲作用，主要用于兰花的组织培养，对幼苗的发育有较大的促进作用。五植物生长调节物质生长调节物质是培养基中不可缺少的关键物质，其用量虽极少，但它们对外植体愈伤组织的诱导和器官分化起着重要和明显的调节作用，其中以生长素类和细胞分裂素最为常用。（一） 生长素它们的主要作用是诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产

14、生。生长素常用的是2.4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、NAA（萘乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸），它们作用的强弱顺序为2.4-DNAAIBAIAA。它们使用的适宜浓度：IAA以1-10mg/L最常用；2.4-D为1-5mg/L；NAA的适宜范围较前两者均高。在大多数情况下，只用2.4-D就可以成功诱导出愈伤组织，假如将2.4-D等生长素类物质与一种细胞分裂素一起使用时，效果会更好。虽然2.4-D诱导细胞分裂较好，但这个化合物趋向于抑制植物形态的发生，故在形态发生时很少用它（但在禾本科及某些单子叶植物的培养中，2.4-D却对其器官分化有促进作用），一般多用NAA或IBA或IAA与一

15、种细胞分裂素配合使用。值得一提的是，低浓度的2.4-D往往有利于胚状体的分化，NAA有利于单子叶植物的分化，而IBA诱导生根的效果最好。（二） 细胞分裂素常用的细胞分裂素类有：激动素（KT）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、2-异戊烯腺嘌呤（2-iP）、吡效隆（4PU，CPPU）和噻重氮苯基脲（TDZ）。它们的主要作用是促进细胞的分裂和器官的分化、延缓组织的衰老、增强蛋白质的合成、抑制顶端优势、促进芽的生长及显著改变其它的激素的作用。就发挥同一生理效应的处理浓度来比较，它们作用的强弱顺序为TDZ，4PU ZT 2-Ip 6-BA KT。但在组织培养中通常使用人工合成的、性能稳定的而

16、价格适中的KT和6-BA，二者的最适浓度为1-10mg/L。此外，赤霉素（GA3）、脱落酸（ABA）和多效唑（PP333）等生长调节物质也见于组织培养中。六琼脂琼脂是从海藻中提取的一种高分子碳水化合物，它的主要作用是使培养基在常温下凝固，同时不参与代谢，所以在组织培养中一直被作为首选的培养基质而广泛应用。七活性炭活性炭加入培养基中的目的主要是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响。例如可以防止酚类物质的污染而引起组织褐化死亡。在兰花组织培养中的效果更明显。另外，活性炭培养基变黑，有利于某些植物生根。但活性炭对物质吸附无选择性，既吸附有害物质，也吸附有利物质，例如植物生长调节物质、培养宜过浓，一

17、般在0.02%1.0%，尤以0.1%0.5%更常用。活性炭对形态发生和器官形成有良好的效应。在失去胚胎状体发生能力的胡萝卜悬浮培养细胞中加入1%4%的活性炭，可使胚状体的发生能力得以恢复。 第二节 培养基的配制培养基在外植体的去分化、出芽、增殖、生根及成苗整个过程中都起着重要的作用。而培养基的选择和配制则是植物组织培养及其试管苗生产中的关键环节之一。一、水和药品严格来讲，用于配制培养基的水最好是用玻璃容器蒸馏过的去质离子的蒸馏水。所用的各种化学药品应尽可能采用分析纯或化学纯级别的试剂，以免对培养基物造成不利影响。生长调节物质在应用前有时还需要进行重结晶或选用纯度更高的。蛋白质水解物最好是用酶水

18、解的，这样可以使氨基酸更好地在自然状态中保存。药品的称量及定容都要准确，不同的化学药品需要使用不同的药匙，避免药品都应随时记录称量情况（包括品名、重量等），以免重复搞错，以便于今后分析。 二、母液的配制和保存配制培养基最方便的方法是预先配制好不同组分的培养基母液，配成培养基配方使用浓度的10倍100倍 ，甚至1000倍。这些母液包括无机盐、维生素以及在水溶液中稳定的生长调节物质等。平时应贮存在24冰箱内。待做培养基时取出，按比例稀释配用。这样每种药品称量一次，可以使用多次，并可减少单一化合物母液；另一种是配成几中不同化合物的混合母液。前一种方法使用配制多中培养基需要的同一种母液；后一种方法在大

19、量配制同种培养基时省时省力。配好的母液应防在容量瓶中贮存 。 现以MS培养基为例，在配制母液时为减少工作量可以把几种药品（如培养基中的大量元素或微量元素）配在同一母液中（21），但应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序，以免发生沉淀。通常把每中试剂单独溶解后再与别的也已完全溶解的药品混合，或者待前一种化合物完全溶解后再加入后一种化合物。混合已溶解的各种矿物质说还应注意先后顺序，力求把Ca2+与SO42-和PO43-错开，以免形成硫酸钙或磷酸钙的不容物。同时，要漫漫地混合，边混合边搅拌。铁盐宜单独配制，其配法为5.57g硫酸亚铁（FeSO4.7H2O）和乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA）溶于

20、1L水中，用时每配1L培养基取该溶液5mL。对于植物生长调节物质，配制成母液时，通常用mg/ml较为方便，一般宜配制成0.5mg/ml的母液，这样的浓度既便于计算也可避免冷藏时形成的结晶。由于多数生长调节物质难溶于水，因此配法各不相同：IAA，IBA和GA3可先用少量95%酒精溶解，再加水定容，摇匀后贮于试剂瓶中，贴上标签后存放在冰箱中；NAA可溶于热水或少量95%酒精中，再加水定容至一定体积；2.4-D不溶于水，可用1N的NaOH溶解后，再加水定容KT和6-BA应先溶于少量1N的HCl中，再加水定容；玉米素先溶于少量95%的酒精中再加水定容至一定浓度。椰子汁的活性成分是耐热的，椰子汁从椰子中

21、倒出后应立即煮沸过滤去除蛋白质，高压消毒后贮于-20低温冰箱中备用。三培养基配制程序水+药品+糖 混合 定容加热 调节pH值琼脂+水 加热预溶玻璃器皿及其它准备 分装 灭菌 放冷 凝固 接种 第三节 常用培养基配方及其特点一 几种常用培养基的配方（复印给学生 略）二 几种常用培养基的特点自1937年White建立第一个植物组织培养的培养基以来，许多研究者报道了各种植物组织培养的培养基，数量多达几十种，相信其种类还将继续增加，其中以MS培养基的应用最为广泛。MS培养基是1962年Murashige和Skoog为培养烟草材料而设计的。特点是无机盐的浓度高，有加速愈伤组织生长的作用，能满足植物组织对

22、矿质营养的要求。铵盐和硝酸盐含量高，比例也较为合适，也不需要添加更多的有机附加物，这是目前应用的最广泛的一种培养基。与MS较为接近的还有LS、RM、等培养基。与MS培养基相比，于1943年设计，1963年作了改良的White培养基则是一个无机盐浓度较低的培养基。它的使用也很广泛，无论是生根培养、胚胎培养还是一般组织培养都有很好的效果。B5培养基是1968年由Gamborg等设计的。它的主要特点是含有较低的铵盐，该营养成分可能对不少培养物的生长有抑制作用，对有些植物如双子叶植物特别是木本植物更加适合。N6培养基是1974年由我国的朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的，其KNO3和（NH4）

23、2SO4高且不含钼。目前在国内已广泛用于小麦、水稻及其它植物的花粉和花药的培养和其它的组织培养。SH培养基与B5培养基相似，不用硫酸铵而改用磷酸二氢铵，在不少单子叶和双子叶植物上使用。第三章 外植体的选择和灭菌教学重点 外植体的选择和外植体的灭菌方法教学难点 外植体的灭菌方法教学目的 要求学生在掌握无菌概念的基础上，进一步理解和掌握无菌操作的一些方法，理解在植物组织培养过程中对外植体的选择及灭菌要灵活。教学方法 讲解、示范、实验。除培养基成分外，决定外植体培养成败的另一个重要因素就是外植体的来源。虽然从理论上讲，植物细胞具有全能性，能够再生新植株，因此任何器官、任何组织都可以作为外植体，但实际

24、上，不同品种、不同器官之间的分化能力有巨大的差别，同时由于组织培养是建立在无菌操作基础之上的专门技术，因此，在进行植物组织培养时，必须选择合适的外植体并进行灭菌操作，以确保组织培养工作的顺利进行。第一节 外植体的选择一外植体的部位迄今为止组织培养获得的成功，几乎包括了植物体的各个部位，如茎尖、茎段、皮层及维管组织、髓组织、表皮、块茎的贮藏薄壁组织、花瓣、根、叶、子叶、鳞茎、胚珠、花药等。但是不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条件的反应是不一样的。有的部位诱导分化的成功率高，有的部位却很难脱分化或再分化频率很低。因此，在组织培养过程中，如何选择合适的、最易表达全能性的部位是决定组织体系成

25、功建立的前提之一。此外，还要考虑培养材料的来源是否有保障，是否容易成苗；同时要考虑该外植体，特别是经过脱分化的愈伤组织，是否会引起不良变异，丧失原品种的优良性状。对于大多数植物来讲，茎尖是较好的部位，由于其形态已基本建成，遗传稳定，也是获得无菌苗的重要途径，但茎尖往往受材料的来源的限制，而采用茎段可解决培养材料不足的困难。由于叶片的来源最有保证，因而许多植物的组织培养以叶片为起始物，如玫瑰、海棠、大岩桐、矮牵牛和豆瓣绿许多植物。对一些培养较为困难的植物，则往往可以通过其子叶或下胚轴来建立其组织培养体系。如有可能，最好对培养较为困难的植物的各个部位的诱导及其分化能力进行比较，从中筛选出最佳外植体

26、。二取材季节除上述取材部位外，取材季节也是重要的影响因素之一。但不同植物的取材季节要求各有不同。对大多数植物而言，应在其生长开始的季节采样，如在生长末期或已进入休眠期时取样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应，较难成活。2-4月，11月至次年1月取材培养，其成活率也很低。在母株生长旺盛的季节取材，不仅成活率高，而且增殖率也大。三器官的生理状态和发育年龄 作为外植体的器官，其生理状态和发育年龄直接影响形态发生。一般认为，沿植物的主轴，越向上的部分所形成的器官的生长时间越短，其生理年龄也越老，越接近发育上的成熟，越易形成花器官。反之，越向基部，其生理年龄越小。所以植株下部组织产生营养芽的比例高，而

27、上部组织产生花器官的比例高。另外，一般情况下，年幼组织比老年组织具有较高的形态发生能力。四外植体大小 目前许多植物的茎尖培养表明，外植体（茎尖）越小成活率越低。因此除非用去除病毒，否则不宜将外植体切的太小。但不是说外植体越大越好，外植体过大，不易彻底灭菌。第二节 外植体的灭菌方法一常用灭菌药剂下表时目前常用的灭菌消毒剂，其使用浓度和时间因外植体而异，需经实验确定。消毒剂使用浓度/%清除难易消毒时间/分灭菌效果次氯酸钠2易5-30很好次氯酸钙9-10漂白粉饱和溶液升汞0.1-1较难2-10最好酒精70-750.2-2好过氧化氢10-12最易5-15溴水1-2硝酸银1抗菌素4-50mg/L中30-60较好170%-75%酒精-具有较强的穿透力和杀菌力，通常外植体浸入15-30秒即可。常作为表面灭菌的第一步，它具有浸润和灭菌的双重作用，但不能达到彻底灭菌的作用，必须结合其它药剂灭菌。有时为了提高乙醇的杀菌效果，可在乙醇溶液中加入0.1%的酸或碱，提高乙醇的杀菌效果。2升汞（HgCl2）-是有剧毒的重金属盐杀菌剂，其杀菌原理是Hg2+可与带负电荷的蛋白质结合，使菌体蛋白质变性，酶失活。使用浓度为0.1%-0.2%一般浸泡时间为6-12分钟。灭菌效果极好，但其清除较难，通常用无菌水冲