CYP2C19药物代谢酶基因多态性检测试剂注册技术审查指导原则文档格式.docx

1、T）编码的CYP2C19酶活性增强，在中国人群的发生频率约为0.5%4%。除CYP2C19*2/*3/*17之外，可能影响CYP2C19酶活性的CYP2C19等位基因还包括CYP2C19*4CYP2C19*8等，但这些等位基因在中国人群的发生频率低，其功能与临床意义有待进一步研究。CYP2C19基因的遗传变异导致CYP2C19酶活性的个体差异，使人群出现超快代谢者（UM）、快代谢者（EM）、中间代谢者（IM）和慢代谢者（PM）4种表型。CYP2C19 UM患者应用常规剂量的氯吡格雷后体内生成的活性代谢产物增多，对血小板的抑制作用升高，抗血小板功能增强，出血风险增大。而CYP2C19 PM患者应

2、用常规剂量的氯吡格雷后体内生成的活性代谢产物减少，对血小板的抑制作用下降，抗血小板功能减弱，血栓风险增大。UM个体的基因型可为CYP2C19*17/*17纯合型或CYP2C19*1/*17杂合型；EM个体的基因型可为CYP2C19*1/*1纯合型；IM个体的基因型可为CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3、CYP2C19*2/*17或CYP2C19*3/*17杂合型；PM个体的基因型可为CYP2C19*2/*3、CYP2C19*2/*2和CYP2C19*3/*3杂合型或纯合型。通过CYP2C19药物代谢酶基因多态性检测，可将服药人群分为上述4类氯吡格雷代谢患者，从而用于氯吡格雷的用

3、药指导。美国FDA在氯吡格雷药物说明书中建议：对于CYP2C19 PM患者，可考虑使用其他血小板P2Y12抑制剂。遗传药理学知识库以及临床遗传药理学实施联盟（CPIC）发布的CYP2C19基因型和氯吡格雷用药指导文件建议：对于CYP2C19 PM患者和IM患者，可选用其它抗血小板药物（如：普拉格雷或替格瑞洛）进行治疗。2015年，原国家卫生计生委发布的药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南（试行）也建议：对于CYP2C19 PM患者的抗血小板治疗，可增加氯吡格雷的剂量或选用其他不经CYP2C19代谢的抗血小板药物（如替格瑞洛）等。然而，对于哪些氯吡格雷服药人群需进行CYP2C19基因型检测，

4、国内外尚无统一意见。2013年发布的抗血小板治疗中国专家共识建议：CYP2C19基因型检测临床应用价值有限，不推荐常规进行。CPIC在随后发布的CYP2C19基因型和氯吡格雷用药指导文件中建议：基于CYP2C19基因型的氯吡格雷抗血小板治疗主要用于进行经皮冠状动脉介入治疗的急性冠脉综合征患者（简称为ACS/PCI患者），尚无证据表明CYP2C19基因型可用于指导氯吡格雷在其他患者中的抗血小板治疗。2014年发布的抗血小板药物治疗反应多样性临床检测和处理的中国专家建议建议：不推荐常规进行CYP2C19基因型检测，仅对PCI术后血栓高危、且计划调整P2Y12抑制剂治疗方案的患者，推荐进行血小板功能

5、检测和CYP2C19基因型检测。2017年发布的基因多态性与抗栓药物临床应用专家建议建议：CYP2C19基因型检测主要对缺血高风险/出血高风险患者选用P2Y12抑制剂有参考价值。综合考虑上述意见并结合中国实际情况，建议将本指导原则的预期适用人群限定为：正在服用或将要服用氯吡格雷进行抗血小板治疗的冠心病患者，主要为急性冠脉综合征（ACS）且进行经皮冠状动脉介入治疗（PCI）的患者（ACS/PCI患者）、PCI术后血栓高危且计划调整P2Y12抑制剂治疗方案的患者、缺血高风险或出血高风险患者等。其中，PCI术后血栓高危患者以及缺血高风险/出血高风险患者的人群限定可参考相关指南。本指导原则所述CYP2

6、C19药物代谢酶基因多态性检测试剂是指：利用分子生物学检测技术，如聚合酶链反应（PCR）等，以CYP2C19基因特定序列为检测靶标，对接受氯吡格雷治疗患者的外周静脉全血或口腔拭子等样本基因组DNA中的CYP2C19基因多态性进行体外定性检测的试剂，用于氯吡格雷的用药指导。本指导原则的技术要求是基于荧光探针PCR方法建立的，对于其他分子生物学检测技术，可能部分要求不完全适用或本文所述技术指标不够全面，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行或补充其他的评价和验证，但需阐述不适用的理由，并验证替代方法的科学合理性。本指导原则仅对用于氯吡格雷用药指导的CYP2C19药物代谢酶基因多态性检测试剂的相关要

7、求进行了说明，由于CYP2C19参与了多种不同药物的代谢，对用于其他药物用药指导的CYP2C19药物代谢酶基因多态性检测试剂，可能部分要求不完全适用或本文所述技术指标不够全面，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行修订或补充其他的评价和验证。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。二、注册申报资料要求（一）综述资料综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及国内外同类产品上市情况介绍等内容。其中，同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学、检验原理、最低检测限及被测靶标（基因多态性位点）等方面详细说明申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之

8、间的主要区别。除此之外，还应说明被测靶标纯合型和杂合型在中国人群的发生频率。若被测靶标为新的多态性位点，申请人还应提交支持资料，以证明：1.携带新位点等位基因所编码的CYP2C19酶对氯吡格雷具有预期的代谢活性；2.携带新位点等位基因的患者，其血小板功能具有预期的差异；3.接受氯吡格雷治疗且携带新位点等位基因的患者表现出预期的主要不良心血管事件；4.根据基因型调整抗血小板治疗方案后，携带新位点等位基因的患者预后获得改善。上述资料应为体内临床试验数据，如：在预期适用人群体内进行的酶速率研究试验，基因型与预期适用人群的主要不良心血管事件关联试验，基因型导向的抗血小板治疗试验等。上述资料必须包括基于

9、中国人群的充分的临床数据。如新位点可用于氯吡格雷用药指导的结论已获得行业认可，应同时提交证明其获得行业认可的支持资料。综述资料应符合体外诊断试剂注册管理办法（原国家食品药品监督管理总局令第5号，以下简称办法）和关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告（原国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号），以下简称44号公告的要求。（二）主要原材料的研究资料CYP2C19基因多态性检测试剂主要原材料研究资料包括主要反应成分、质控品及企业参考品的研究资料。1. 此类产品的主要反应成分一般包括人基因组核酸提取/纯化试剂、检测所需引物、探针、酶、dNTP、反应缓冲液等。申请人应提交相

10、关原材料的选择、制备和质量标准研究资料。如为申请人自制，应提交详细的工艺稳定性研究资料；如为外购，还应提交供应商筛选资料以及供应商提供的原材料质量检定报告。1.1 核酸提取/纯化试剂（如有）的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。1.2 引物、探针本文所述CYP2C19基因多态性检测一般针对等位基因CYP2C19*1、CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17。申请人应详述引物、探针的设计原则，提供引物、探针核酸序列、模板核酸序列及两者的对应情况。建议设计两套或多套引物探针以供筛选，针对待测位点的检测灵敏度和特异性等进行评价，选择最佳设计，并提交详细的筛选研究数据。同时应针对引

11、物、探针核酸序列及检测靶序列进行同源性比对，如有同源序列应着重评价是否会有交叉反应。申请人应针对选定的引物、探针原材料进行质量评价，一般包括：分子量、纯度（HPLC等）、浓度、探针荧光标记基团的激发波长和发射波长，以及功能性试验等，并依据评价结果建立合理的质量标准。1.3酶CYP2C19基因多态性检测试剂可能涉及到的酶包括DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）。申请人应针对各种酶的活性进行验证，提交功能性试验资料，并确定酶的质量标准。DNA聚合酶应具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性，具热稳定性。UDG/UNG应具有水解尿嘧啶糖苷键的活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性。1.4脱

12、氧三磷酸核苷（dNTP）包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；应提交对其纯度、浓度、保存稳定性等的验证资料，以及功能性试验资料，并确定质量标准。2.质控品试剂盒的质控体系通过设置各种试剂盒质控品来实现。CYP2C19基因多态性检测试剂的质控品可分别设置野生型、杂合型及纯合突变型DNA样品（至少包含常见的多态性位点），同时设置不含待测靶序列的空白质控品用于交叉污染的质控；亦可直接采用常见多态性位点的杂合型样品及空白质控品进行质量控制。对于此类产品，一般情况下，反应体系中野生型序列和突变型序列均有阳性反应，可以对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，则试剂盒中可不另外设置内标对照；

13、否则，应另外设置内标对照。质控体系应能够对检测全过程进行有效的质量控制，包括试剂及仪器性能、可能的扩增反应抑制物（管内抑制）、交叉污染等因素造成的假阴性或假阳性结果。质控品可采用质粒或临床样本的核酸提取液等。空白质控品应参与样本核酸的平行提取。申请人应针对质控品原料选择、制备、定值过程等提供详细的研究数据，并对质控品的检测结果做出明确的范围要求。3.企业参考品企业参考品主要包括阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品、精密度参考品等。申请人应提交有关企业参考品原料选择、制备方法、基因序列确认及检验标准的研究资料，包括所用到的参考方法等。3.1阳性参考品：可采用临床样本或其核酸提取液，样本类型与待测

14、样本一致。应至少包含野生型和所有多态性位点的杂合型样本，同时尽量纳入纯合突变型样本。对于某些稀有基因型，需要时也可采用细胞系代替。3.2阴性参考品：应考虑检测特异性的评价，纳入同源序列交叉反应样本、干扰样本等。3.3检测限参考品可选择最低检测限浓度（例如：95%检出率水平）或接近最低检测限浓度（例如100%检出率水平）的临床样本或其核酸提取液，至少包含所有多态性位点的杂合型样本。3.4精密度参考品应至少包括所有多态性位点的低浓度杂合突变型临床样本或其核酸提取液。如CYP2C19基因多态性检测试剂已有国家参考品，企业参考品的要求应不低于国家参考品要求。（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料主要生

15、产工艺研究资料包括工作液配制（引物、探针浓度、酶浓度、dNTP浓度、缓冲液离子浓度等）、分装和冻干（如有）、荧光标记等工艺过程的描述及确定依据。生产过程应对关键参数进行有效控制，可采用流程图方式描述生产工艺，标明关键工艺质控步骤，并详细说明该步骤的质控方法及质控标准。反应体系研究指最佳反应条件的选择确定过程，包括样本采集预处理、样本保存、样本用量、试剂用量、核酸提取纯化步骤（如有）、PCR反应条件、阈值循环数（Ct值）等的确定。不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述。（四）分析性能评估资料申请人应针对下述各项分析性能提交详细的评估资料，包括试验方法、试验样本（类型、来源、数量、处理方法、基

16、因型和浓度确认）、试验可接受标准、统计方法、试验数据及结论等。有关背景信息也应在资料中有所体现，包括实验地点、适用仪器、试剂规格、批号等。分析性能评估的实验方法可以参考相关国内或国外有关体外诊断产品性能评估的指导原则进行。每项性能评估应尽量采用与适用样本类型一致的临床样本，对于某些稀有基因型也可采用细胞系等。如产品适用样本类型不止一种，申请人应针对不同样本类型分别完成性能评估。1. 核酸提取/纯化性能（如有）在进行靶核酸检测前，应有适当的核酸提取/纯化步骤。该步骤除最大量分离出目的核酸外，还应有相应的纯化作用，尽可能去除PCR抑制物。无论检测试剂是否含有核酸提取/纯化的组分，企业都应结合检测试

17、剂的特性，对配合使用的核酸提取/纯化方法的提取效率、提取核酸纯度等做充分的验证，并评价该方法能否满足CYP2C19基因多态性检测试剂的要求，提供详细的评价资料。2. 检测准确性建议采用若干份临床样本验证CYP2C19基因多态性试剂的检测准确性，样本类型与产品适用范围一致；样本应涵盖野生型和所有多态性位点的杂合突变、纯合突变情况，并包含不同基因组DNA浓度。对于某些基因型样本较为稀有的情况，亦可采用细胞系代替。3. 检测限和可报告范围CYP2C19基因多态性检测试剂的最低检测限可定义为：在满足一定的检测准确性和精密度的条件下，能够检出目标基因的最低人基因组DNA浓度。检测限评价建议采用临床样本或

18、细胞系，并至少包含所有多态性位点的杂合突变型。可采用梯度浓度的人基因组DNA样本进行多次重复检测，确定适当检出率水平（如：95%）下的最低人基因组DNA浓度，即为最低检测限。系列稀释度应能够覆盖大部分检出概率区间（0100%），可根据各浓度梯度检测结果直接判定，也可通过概率计算或其他适当方法进行测算。同时，申请人亦应评价CYP2C19基因多态性试剂可准确检出的人基因组DNA浓度上限，即适当检出率水平下的最高人基因组DNA浓度。4. 分析特异性4.1 应针对同源性序列（例如CYP2C19的其他突变序列、CYP2C9基因序列等）进行交叉反应验证，说明交叉反应样本的制备方法、核酸序列确认方法，提交详

19、细的验证资料。4.2 应针对可能的内源和外源性干扰物进行干扰试验研究。干扰物的选择与所用样本类型有关，例如：全血样本，内源干扰物主要涉及血脂、胆红素、血红蛋白和白蛋白等，外源干扰物主要包括血液样本采集可能用到的抗凝剂、常用药物等；对于口腔拭子样本，干扰物需考虑全血、口腔定植菌以及口腔可能接触到的抗菌漱口液、牙膏、食物、药物、烟草等。干扰试验可通过在临床样本中人工添加干扰物质的方式，评价干扰物质对目标基因检测的影响，也可直接采集暴露于干扰因素后的受试者样本，进行干扰试验评价。建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度（“最差条件”）条件下进行评价；如有干扰，应确定不产生干扰的最高浓度。5. 精密度精

20、密度评价应采用临床样本进行试验，试验操作完全按照说明书执行，包含核酸提取/纯化等样本处理步骤。样本应至少涵盖所有多态性位点的杂合突变型。精密度评价需满足如下要求：5.1对可能影响检测精密度的主要因素进行验证，除检测试剂（包括核酸提取/纯化组分）本身外，还包括分析仪、操作者、地点、时间、检测轮次、试剂批次等。5.2设定合理的精密度评价周期，对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。如有条件，申请人应选择不同的实验室进行重复实验以对室间重复性进行评价。5.3用于精密度评价的临床样本应根据可报告范围的基因组DNA浓度至少设置低浓度和中/高浓度水平。5.4精密度指标可设置为检测成

21、功率等，申请人应对精密度指标评价标准做出合理要求。精密度评价资料应详述试验设计、试验数据、统计分析及试验结果，列出有关试剂、仪器、实验室、人员、样本的相关信息。（五）阳性判断值确定资料对于此类试剂，阳性判断值即为能够获得理想的检测准确性的临界值（Cut-off）。建议纳入一定数量的临床样本，涵盖野生型和所有多态性位点的突变型，采用受试者工作特征（ROC）曲线的方式进行研究。相关资料中应详述试验方案、样本来源、样本量、样本入组标准及试验结果等。应针对不同样本类型（如有）分别进行阳性判断值研究，明确是否有差异。如果试剂判读存在灰区，应解释说明灰区范围的确定方法。对于某些检测方法学，阳性判断值研究可

22、能不适用，申请人应说明理由。（六）稳定性研究资料稳定性研究资料主要包括申报产品的稳定性研究和适用样本的稳定性研究两部分。前者主要包括申报产品的实时稳定性、开瓶稳定性、复溶稳定性、运输稳定性及冻融次数限制的研究等；后者则是指适用样本的保存条件、保存时间等方面的研究，如果包括多种样本类型，则需分别完成相关研究。申报产品实时稳定性研究中，应采用至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后，选取多个时间点进行产品性能评价，从而确定产品保存条件和有效期。样本稳定性研究中，如核酸提取液不一定立即进行检测，则还需对核酸提取液的保存条件和稳定性进行研究。申请人应提交有关稳定性研究方案的确定依据、具体的试验方

23、法及详细的研究数据、结论。（七）临床试验应满足体外诊断试剂临床试验技术指导原则（原国家食品药品监督管理总局通告2014年第16号）的要求，下面仅说明本类试剂临床试验中应关注的重点问题。1.临床试验机构申请人应当选定不少于3家（含3家）临床试验机构，按照相关规定开展临床试验。申请人应根据产品特点及预期用途，综合不同地区人种和流行病学背景等因素选择临床试验机构。2.临床试验人群3.临床样本应为临床原始样本，如静脉抗凝全血等，不应直接采用提取的基因组DNA进行试验。临床样本的采集、处理、保存和提取等应同时满足申报产品说明书以及对比试剂说明书（如适用）的相关要求。4.临床试验样本量如申报产品同时适用于

24、静脉全血或口腔拭子等不同基质的样本类型，则每种样本类型的例数应分别满足法规要求。5. 临床检测准确性验证5.1 对比试剂5.1.1已有同类产品上市的申报产品对于已批准的CYP2C19*2（rs，c.681GA）、CYP2C19*3（rs，c.636GA）以及CYP2C19*17（rs,c.-806CT）多态性位点，可选择已上市同类试剂作为对比试剂。5.1.2 无同类产品上市的申报产品对于新的多态性位点，可选择基因测序作为对比方法。5.1.3基因测序应提交临床试验机构和测序机构签章的委托测序协议。应对选用的测序方法做详细介绍，应提供以下关于测序的详细试验资料，该部分资料需由临床试验机构签章。5.

25、1.3.1测序原理、测序仪型号、测序试剂及消耗品的相关信息。5.1.3.2测序方法所用引物信息，如核酸序列、分子量、纯度、功能性实验等资料。引物设计应涵盖申报产品扩增的被测靶标。5.1.3.3 测序方法的性能验证，尤其是最低检测限的确认，建议将所选测序方法与申报产品的性能进行比对分析。5.1.3.4 测序方法应建立合理的阳性和阴性质控，以对临床样本的检测结果进行质量控制。5.1.3.5 提交有代表性的样本测序图谱及结果分析资料。6. 氯吡格雷指导用药临床有效性的验证6.1 已有同类产品上市的申报产品已批准的CYP2C19*2（rs，c.681GT）多态性位点，无需进行该部分验证。6.2 无同类

26、产品上市的申报产品6.2.1如新多态性位点用于氯吡格雷用药指导已获行业认可（包括：CPIC、国内相关指南或专家共识、相关药物说明书以及临床应用等的认可），且有充分的中国人群的体内临床数据，无需进行该部分验证。6.2.2如新多态性位点用于氯吡格雷用药指导未获行业认可，应提交基于中国人群的充分的体内临床数据，包括但不限于：6.2.2.1新的多态性位点等位基因编码的CYP2C19酶对氯吡格雷的代谢动力学验证资料。6.2.2.2血小板功能检测。比较不同基因型患者血小板功能的差异。6.2.2.3基因型与主要不良心血管事件关联性的体内临床试验。6.2.2.4基因型可指导氯吡格雷用药的有效性证据。6.2.3

27、 需要强调的是，对于6.2所述申报产品（包括6.2.1和6.2.2），申请人应在临床试验资料部分提交声称的新多态性位点已获行业认可的相关资料以及基于中国人群的充分的体内临床数据等，以证明申报产品可指导氯吡格雷用药。7. 临床试验方法、数据及统计分析7.1应在临床试验方案或报告中描述申报产品和对比试剂/方法的试验方法。7.2临床试验原始数据应以列表方式表示，包括申报产品的结果、对比试剂/方法的结果、临床诊断、年龄、性别以及是否进行PCI等。7.3应总结野生型、各多态性位点杂合型和纯合突变型的例数，以交叉四格表分别总结两种试剂对各多态性位点的定性检测结果，并分别计算各多态性位点基因型的阳性符合率、

28、阴性符合率、总体符合率及其95%置信区间，对定性结果分别进行四格表卡方或kappa检验，以验证两种试剂检测结果的一致性。7.4 结果差异样本的验证在数据收集过程中，对于两种试剂检测结果不一致的样本，应采用合理方法进行复核，并对差异原因进行分析。如无需复核，应说明理由。8. 临床试验方案各临床试验机构的方案设置应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案，不可随意改动。整个试验过程应在临床试验机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程。试验方案应确定严格的入选/排除标准，任何已入选的样本被排除出临床试验都应记录在案并明确说明原因。在试验操作过程和结果判定时应采用盲法以保证试验结果的客观