精品电泳问题解决方案Word格式文档下载.docx

1、简直一塌糊涂！首先做好分离胶时，没有封闭。另外，样品很快的沉降到不平整的脚面上，随着电泳的进行，样品不断的融解，以至形成托尾而不是一条条清洗的条带。另外，这个样品可能含有杂质比较多（不溶性杂质或基因组DNA），可见上样前的充分离心也是必要的!Example7条带太淡。背景脏且不够均匀，说明电泳缓冲液有污染（杂质在电泳过程中不断的进入胶中），或者板子没有洗干净。在溴芬兰线的后面还有连续的细线，说明上样不够小心，致使样品飞了出孔，同时也污染了其他的相临样品。Example8完全是染液重复利用惹的祸，对于这张（只有下面着色），只要重新再染，效果还是可以的。Example9这是一张银染的结果。本来一切

2、都小心奕奕的，结果把胶放到去离子水中回家了，过了一夜，第二天染色结果变成这个样子了，呵呵原因：固定在胶中的蛋白都溶到水里了。Example10电泳停的太早。如果能继续再跑，效果就好了，当然，缓冲液必须有足够的缓冲能力，否则会引起扩散。Example11这张图大家最主要的看看是胶孔作的不够齐整（我用箭头标出了）。另外，可能由于选用旧的上样缓冲液，致使2-mercaptoethanol挥发，电泳的样品没有完全处于变性状态下，这使得跑出的结果难以很好预测。Example12胶的浓度过大（不是自己的，浪费也不心疼），只有少量的小分子蛋白能入胶；由于胶的浓度过大，聚合不够均匀，载样过大，出现上面的情况自

3、然是必然的了！Example13可能由于选用旧的上样缓冲液，还原试剂已经挥发，另外缓冲液中SDS的量也应该稍微的补加（可能有析出），样品根本无法进入胶中。只有让分离的蛋白入胶，才能进行良好的分离。Example14要么样品盐浓度过高，要么分离胶不均匀。因此应该把部分样品中的盐透洗除去，或者一直采用较小的电流来跑，可能效果会稍微的好一点点。当然，根本的还是应该去盐份（如果重复结果一致的话）。Example15做的好图。SDS-PAGE是蛋白质及核酸分离中的常用技术，其质量的好坏往往对后续操作具有决定性的影响，这个专题也许并不能带给你完整的SDS-PAGE技术的理论体系，也不能告诉你怎样制备一块完

4、美的凝胶，但是，它通过实例告诉你什么是错误的，我们应该怎样去改进，我想这往往是我们最需要的.这个专题是一个译本，来自于Rice大学的网站，http:/www.ruf.rice.edu/bioslabs/studies/sds-page/sdsgoofs.html，我看过很多遍，觉得非常有用，因此也就萌生了将此翻译为中文，供大家方便的浏览，鉴于本人的英语水平有限，译文中如有错误望各位战友不吝指出，谢谢！我也非常希望能够借此帖引起大家对SDS-PAGE中的问题进行反思，共同讨论您在SDS-PAGE中遇到的问题及解决方案，争取在这里建立一个SDS-PAGE问题凝胶的图像库。OK，letsgo.SDS

5、-PAGE“hallofshame”如果你能够非常熟练的制备一块完美的凝胶，甚至对它进行改进都十分困难，那么你真的应该值得庆幸！但是如果你不能达到这个水平也不要灰心。所有的优秀的科学家都是从失败中成长起来的，事实上，如果不出错我们就很难学到更多的东西！（我的westernblot技术也是从上百次的失败中成熟起来的，这中间我就学到了很多，相对于PCR，我第一次就成功的做出了RT-PCR和重叠延伸PCR，但是对于PCR我能说的真的很少！）这本“失误大全”包括了过去实验室中许多学生包括老师跑的最“烂”的胶，它们代表了人们在跑胶是最容易犯的多种错误（当然这些错误仍在更新之中）。看你自己的胶缺陷也许并不

6、能很好的解决问题，至少不是最完美的解决方式，本文用图例指出你可能在哪一些方面改进你的技术。评价你的胶找出你的症状并和这个小册子收集的实例比对。每一个例子都配有完整的凝胶图像和与之相对的解释及建议。从这本“失误大全”中你应该能够找到解决你的问题的正确的方法。症状1涂抹痕迹（smears）涂抹痕迹例1涂抹痕迹可能由于多种原因引起，但是最常见的原因是聚丙烯酰胺凝胶倒胶的不均匀或者上样量过大。这块胶倒胶不正确，在上部胶倒入制胶槽之前就已经发生聚合。首先倒入的胶聚合发生的太快了。与其重新倒胶，不如停止倒胶重新准备新的聚丙烯酰胺混合液，然后将新的胶倒入旧胶的上方。但是显然这种连接不是非常牢固。（我推荐重新

7、倒胶，制胶很关键，如果你后续还要做blot，胶没有跑好浪费太多了！涂抹痕迹例2这块胶每孔上样量过大。大多数的泳道还是能分清条带，但是在3、4道涂抹痕迹非常明显。这些泳道的样品主要含有一种蛋白（血红蛋白的亚基），与9、10道一样。但是，3、4道的样品低估了红细胞裂解物和红细胞胞浆组分中的蛋白含量。这些组分包含了过多的蛋白以至于样品需要稀释后才能进行蛋白含量测定。但是这名学生却忘记了这个样品已经稀释过了，因此造成了蛋白浓度的低估。（严重的失误啊！小型胶每孔的蛋白样品的量为20-40微克，取决于所需的分辨率和混合液中包含的多肽数目。但是，如果是一个纯化样品上样，一个带包含了20-40微克蛋白，那么其

8、结果肯定也是一团糟！涂抹痕迹例3这也是一个上样量过大的例子，这名学生似乎犯了和例2中同样的错误，因此在胶上也表现出各泳道的不一致性。涂抹痕迹例4涂抹痕迹可能常见于用非连续胶跑膜相关蛋白这类脂质含量丰富的样品。在非连续PAGE中，样品蛋白基于两个因素而被超浓缩。首先，当样品从非限制性的积层胶移动至限制速度的分离胶时迁移速率陡然下降。其次，也是最重要的，PH变化造成蛋白样品电泳速率的改变，导致样品突然停滞。一个高约半厘米左右的样品被压缩成为一个仅为数微米厚的薄层条带，局部蛋白浓度急剧增加。胞膜相关蛋白一般于较低浓度是沉淀，因此泳道的顶部通常有一条神色的条带含有沉淀的蛋白。当电泳进行时沉淀的蛋白重新

9、溶解然后持续进入凝胶，因此造成了一个持续性的较深的不可分辨的背景。许多膜相关蛋白的凝胶图像都显示同样的特征。上图中4、7道的蛋白样品虽然含有相同的蛋白量，但是第4道的样品中含有的膜蛋白的量超过了凝胶的分辨能力，造成了很深的涂抹痕迹。症状2条纹拖尾条纹拖尾例1这个不是非常严重，有条纹拖尾的泳道（图中左边第5道）也是可以用的。条纹的出现是由于一部分膜组分中的高浓度蛋白在跑积层胶过程中析出然后在很短的时间里又回到溶液中。由于分离胶表面存在轻度的缺陷（可能是在倒积层胶之前分离胶干了一些），造成整个泳道的蛋白浓度的不一致，使得出现这种条纹拖尾症状，而不是一致的很深的背景。条纹拖尾例2第4道也是由于上述原

10、因而出现条纹拖尾。电场受到了第4道非均一浓度的影响而出现了条带的缩窄。注意凝胶前端染料的缺失，是由于电泳时间过长所致。条纹拖尾例3这块胶就非常难看了。原因在于分离胶倒完之后没有用水或者异丙醇压胶，导致分离叫上缘非常粗燥，就像你看到的一样。当样品堆积在凹凸不平的分界线时，位于凹陷部位的蛋白由于不能适当的浓缩就析出来了。然后再跑胶过程中逐渐溶解造成了条纹拖尾症状。症状3条带过浅条带过浅例1这个问题可能是由于加样孔成形不佳和/或凝胶加样不认真所致。背景较深而且不均一说明蛋白可能存在于电泳缓冲液中。最有可能原因是由于装置没有正确紧密的装配导致较多的样品溢出加样孔。溢出的样品很可能不会重新溶入形成条带，

11、因为这些蛋白从上层缓冲液的间隔持续进入凝胶。注意在凝胶下部存在一条贯穿若干泳道的水平线，说明加样孔太浅，部分样品溢出至相邻的加样孔。这个症状在一些配制正确的凝胶中也会出现，常常是在电极连通之后的数分钟内。蛋白溢出至加样孔外而不是进入积层胶。在几分钟之内发现问题可能挽救一部分损失，但是由于PH效应导致有效的样品浓缩失败，样品损失以及蛋白污染电泳缓冲液。条带过浅例2由于没有其他的症状，这块胶的问题似乎仅仅就是染色出问题了。考马斯亮蓝染液如果反复利用就会被SDS污染，这些回收的染液对于蛋白的染色效率就不及新鲜配制的染液。只要样品蛋白被染液中酸化的甲醇固定于胶上，那么这个问题只需要简单的重新用新鲜配制

12、的染液染色剂可解决。条带过浅例3第五道旁边用“X”标记的泳道的样品蛋白含量被低估了，或者电泳样品准备时弄错了样品浓度，或者上样体积太少可能是加样针没有正确的吸取足够的样品。和其它的样品对比，缺乏几乎所有的主要的条带，说明这个孔的问题就是上样量过低。条带过浅例4这是你可能遇到的问题中比较让人沮丧的。我们可以说你是非常仔细的，把每件事都做得倾向于完美，跑胶直到溴酚蓝前沿非常平直的落在胶的最底部。你用去离子水冲洗凝胶，然后将其置于摇床震荡。在这天稍晚些时候你发现你忘了将凝胶放到染色缸里面。第二天染色结果就是上面的样子了。注意分子量较小的蛋白从胶上弥散较快，而较大分子量的蛋白弥散很慢而能被染色。染色和

13、脱色液中的酸化甲醇是非常必要的，它可以固定蛋白阻止其从聚丙烯酰胺基质上弥散。症状4前端指示剂缺失部分前端指示剂例1为了装置凝胶花了不少功夫，如果停止电泳太晚就太可惜了。因为如果部分前端的指示剂已经跑出凝胶的话就不能确定各个条带相对应的迁移率了。这块胶有一个内部的刻度也就是跑胶时带上了分子量标准（Marker）。由于条带较平直，任意条带都可以作为参考来确定跑胶的迁移率。前端指示剂缺失例2这块胶跑胶时间过长以至于全部的指示剂都跑出凝胶。由于泳道有些扭曲，这就对相对迁移率的分析造成了困难。如果凝胶前端的指示剂完整，泳道之间的相对迁移率都可以做比较，哪怕是凝胶扭曲或者同一电泳槽两块凝胶的分离胶高度不一

14、致。无论分离胶的绝对高度是否一致，相对迁移率对于组成均一的凝胶来说都是一致的。前端指示剂缺失例3从这块胶曲率来看应该是属于由于两侧薄板之间结合稍微松弛形成的边缘效应（“皱眉”效应）。由于前端指示剂也是缺失的，因此很难准确分析其相对迁移率。但是如果有完整的前端指示剂作为参考线，即使存在“皱眉效应”也可以进行比较。症状5条带仅在凝胶顶部过早终止电泳例1很明显这块胶的指示剂前端位于什么位置。仍有继续电泳的空间可以把条带分得更开以增加分辨率。相对迁移率是为了分析凝胶相同位置上相同大小的蛋白。随着蛋白迁移距离的增加分辨率逐渐增高直到弥散限制了分辨率的继续提高。过早终止电泳例2这两块胶一个是7%的一个是1

15、4%的，看起来都还不错。有些人做实验室很不耐烦过早就终止了电泳。这些胶虽然可以用，但是如果继续分离直到指示剂达到凝胶底部可能效果会好得多。这种情况可能发生在你很晚跑电泳的时候，你的老师都饿了，而你却不能让他等你一步一步地做完。症状6混杂因素扭曲的条带有这个问题的凝胶在整个“失误大全”中到处可见。这是由于分离胶的表面不平所造成的，因此当样品浓缩之后所有的条带都变扭曲的形状。扭曲的条带也可以见于电场的不均一，但是这种条带的扭曲应该是对称的。加样孔不成形当样品溢出至邻近加样孔，你就会观察到横贯几个孔的连续的蛋白条带（箭头所示）。事实上，这种情况通常发生在加样孔深度不够或者样品不慎漏至加样孔外。此外，

16、我们也很可能用陈旧的上样缓冲液。使用Cleland试剂（DTT）的好处就是它可以减少二硫键的形成但是却没有二巯基乙醇的难闻。但是二巯基乙醇却要稳定得多。二硫键将各个单独的多肽链接在一起并在非变性条件下维持一些蛋白的折叠状态。这可以造成某些蛋白泳动异常。高密度胶这块胶明显是非正确聚合的。聚丙烯酰胺的密度相当高以至于只有少数小分子蛋白可以进入分离胶。条带也由于上样量过大发生扭曲，事实上大多数凝胶在超过一个合理的浓度范围之后都不能均匀的聚合。破碎胶这个结果可能非常令人沮丧。你做了一个非常好的实验，但是在处理凝胶的时候却发生了破裂。记住如果你收集了足够多的碎片这块胶仍然是可以用的。电场效应在一定程度上

17、来说这个现象是正常的，只是在这里电场被夸大了。两块挡板在凝胶边缘处干扰了电场，因此这种拉力使得样品的靠近边缘的一端被加强，结果就产生了这种“皱眉效应”。 可能某些条带会出现“微笑现象”，但是只要整块胶都有蛋白条带，则肯定是皱眉的形状。我猜如果把你浸在蓝色染料中然后拉着你在电场中跑，你也一定会皱眉的症状7包含多种症状的失败凝胶多种症状例1许多时候你跑的胶会有多种症状同时存在。由于评论凝胶的目的就是改善你的实验，因此发现是什么导致这些意料之外的效应非常重要。接下来你就可以着手改进你的跑胶质量。这块胶：缺乏前端指示剂电泳时间过长；条带扭曲分离胶上沿不平，最可能的原因是压胶的液封不恰当；右侧泳道上样量

18、偏大。多种症状例2出现电场效应，条带弯曲。上样量太大。分离胶上沿不平，条带扭曲。多种症状例3上样量不均一（相邻加样孔上样不同），导致某些条带被压缩。胶上有一些痕迹而且被完全脱色。这说明可能是由于没有正确取放凝胶用手直接接触凝胶导致胶表面留下蛋白而被考马斯亮蓝染色。有时候你可以得到非常漂亮的指纹！症状7千奇百怪的胶例1装甘氨酸的容器和装氯化胆碱的非常相似。由于胆碱的吸水性要强于甘氨酸，因此如果错误地用于电极缓冲液肯定会出现一些变化。胆碱是一种基础的化合物，但是肯定不是甘氨酸的替代物。这里我们找到了一个这样的实例。虽然在电泳一段时间后发现后立即更换了缓冲液，但是还是太晚了。例2这个图由捷克的T.S

19、edlacek提供。跑的时候电流过高导致发热量过大。例3这两块胶由E.MoralesRayas提供。一种可能的解释是可能这两次跑胶时在加样与实际跑胶之间间隔时间太长。第一块胶中间的几个泳道出现了增宽和压缩交替的形式，而第二块胶的条带则向凝胶边缘扩散。当蛋白样品加入上样孔后即开始弥散到积层胶，同时向垂直和两侧发生（在没有电场的情况下蛋白弥散的方向是随机的，因此上样后必须尽快开始电泳）。较小分子量的蛋白弥散速度快于大分子量的蛋白。如果蛋白横向扩散就会影响邻近泳道的电场，特别是邻近的泳道蛋白含量更高时。但是如果所有的样品组成相似并序贯上样，弥散造成的影响就不是这么重要。但是仍然会造成条带的失真。例4显然在实验室中用塑料瓶大量储存Tris-甘氨酸电极缓冲工作液并不是好主意。我们看不见缓冲液中的霉菌，但是它确实存在其中。注意脱色后这块胶的指示剂下方都呈透明的颜色，而胶的背景却仍然呈蓝色，说明霉菌蛋白在整个电泳过程中已经渗透到凝胶之中。