脑缺血再灌注损伤后氧化应激对自噬调控机制的研究学位论文Word格式文档下载.docx

1、所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期： 年 月 日上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文

2、。保密，在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密。 （请在以上方框内打“”） 指导教师签名： 年 月 日 日期：上海交通大学硕士学位论文脑缺血再灌注损伤后氧化应激对自噬调控机制的研究0 要 目的 探讨缺血再灌注损伤后早期自噬激活的作用机制及氧化应激 对 早 期 自 噬 变 化 的 调 控 ， 探 讨 抗 氧 化 剂 N- 乙 酰 -L- 半 胱 氨 酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）和自噬诱导剂雷帕霉素（Rapamycin）在缺血性脑血管疾病方面的应用价值，为缺血性脑血管疾病新的药物治疗提供理论依据。方法 采用线栓法制作小鼠短暂性大脑中动脉闭塞（temporarymid

3、dle cerebral artery occlusion，tMCAO）模型。实验分为假手术组（sham组）、缺血再灌注组（ischemia/reperfusion，I/R组）。后者随机分tMCAO+生理盐水、tMCAO+rapamycin和tMCAO+NAC。tMCAO+rapamycin组于术前20分钟侧脑室立体定向注射rapamycin，tMCAO+NAC组于脑缺血术后立刻腹腔注射NAC，tMCAO组于脑缺血术后立刻腹腔注射同容积生理盐水。在脑缺血60分钟后，分别再灌注1小时，3小时，6小时，12小时，24小时，Western blot检测缺血侧皮质和纹状体自噬相关蛋白LC3 I、LC3

4、II和Beclin 1的表达。利用双氢溴乙啶（Dihydroethidium，DHE）染色检测细胞内ROS水平及对自噬活性的影响，借助荧光显微镜观察NAC或雷帕霉素（Rapamycin）条件下的自噬变化。NAC和Rapamycin分别干预缺血再灌I注24小时小鼠，脑片2,3,5-氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC）染色观察脑梗塞面积。结果 与假手术组比较，缺血再灌注损伤后1小时Beclin 1开始升高，6小时LC3 II/ LC3 I开始升高。与对照组相比，NAC干预后LC3 II/ LC3 I和Beclin 1表达趋势明显升高。DHE

5、染色结果显示缺血再灌注损伤1小时后即开始出现ROS活性增高，经NAC处理后可被部分抑制。TTC染色提示NAC或rapamycin处理后可减小梗塞面积。结论 本结果提示小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后自噬表达上调可能是一种保护机制，氧化应激的激活与自噬表达相互影响，抗氧化剂或自噬诱导剂可以通过激活细胞的自噬途径保护神经细胞，减小脑梗塞面积，减轻缺血神经元的损伤。关键词： 缺血再灌注损伤，氧化应激，自噬，LC3，Beclin 1，NACIITHE REGULATION OF OXIDATIVE STREE ON AUTOPHAGY AFTER CEREBRAL ISCHEMIA REPERFUSION

6、 INJURYABSTRACTObjective To discuss the activation of autophagy and changes of early-phase autophagy in which the mechanisms of reactive oxygen species（ROS） involved. Discover the Antioxidant N-acetyl L-cysteine （NAC） or the autophagy inducer rapamycin in ischemic cerebrovascular disease of the appl

7、ication.Methods The temporary focal cerebral ischemia was induced by occlusion of the left middle cerebral artery by applying a modified intraluminal filament technique. Animals were divided into sham group and ischemia/reperfusion group （ischemia / reperfusion, I / R） （+ saline）, the latter divided

8、 into temporary middle cerebral artery occlusion （tMCAO） group, tMCAO + NAC group and tMCAO + rapamycin group randomly. tMCAO + NAC group was treated by intraperitoneal injection of NAC after MCAO, then rapamycin was injected intracerebroventricular 20 min before MCAO. After 60 minutes in focal cere

9、bral ischemia, the reperfusion was performed at 1, 3, 6, 12 and 24 h. The expression of LC3 I, LC3 II and Beclin 1 in the cortex and striatum after ischemia-reperfusion were determined by immunoblotting analysis at each time point. The level of ROS was detected by staining technique with dihydroethi

10、dium （DHE）. Effects of antioxidant N-acetyl-L-cysteine （NAC） or rapamycin on antophagy were evaluated using fluorescence microscope. The total infarct volume of slices was determined by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride（TTC） staining after 24h reperfusionIIIunder the conditions of focal cerebral i

11、schemia and durg adminstrationResults Compared with the sham-operated group, the expression of Beclin1 and LC3 II/ LC3 I was increased at the point of 1h and 6h after focal ischemia reperfusion respectively, while upregulation treated by NAC. The results of DHE staining were that the level of ROS en

12、hanced at 1h after focal ischemia reperfusion, while down regulated after received injections of NAC. According to TTC staining, the treatment with NAC or rapamycin prevented the expansion of the infarct.Conclusion The degree of autophagy and ROS were up-regulated after focal ischemia-reperfusion in

13、jury, which may be a kind of protection. Mutual influence happended between activation of oxidative stress and autophagy. Antioxidants or rapamycin possibly increased the expression of autophagy to protect neurons and attenuated ischemic neuron injury.KEY WORDS reperfusion injury, oxidative stress,

14、autophagy, LC3,Beclin 1,NACIV目 录中文摘要 英文摘要 缩略语表 论文正文第一部分: 脑缺血再灌注损伤后自噬相关蛋白的表达及调控机制引言 1材料与方法 7实验结果 16讨论 23参考文献 28第二部分：局部脑缺血再灌注损伤后ROS激活及对自噬调控引言 31材料与方法 36实验结果 40讨论 53参考文献 57附录 60致谢 71攻读学位期间发表的学术论文目录 72V缩略语表缩略词英文全称中文全称AMPK5-AMP-activated protein kinase-AMP 激 活性蛋白激酶ATGAutophagy-related gene自 噬 相 关 基因3-MA3

15、-methyladenine三 甲 基 腺 嘌呤BHBcl-2 homologyBcl-2 同源结构域BSABovine serum albumin牛 血 清 白 蛋白CMAChaperone-mediated autophagy分 子 伴 侣 介导的自噬CNSCentral nerve system中 枢 神 经 系统DHEDihydroethidium双氢溴乙啶DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthylenediamine tetraacetic acid,disodium乙 二 胺 四 乙酸二钠EGTAEthyleneglycol-bis（-aminoethyl）-N

16、,N,乙 二 醇 双 （2-N,N-tetraacetic acid氨 基 乙 基 ） 四乙酸HEPESN-2-hydroxyethyl-piperazine-N-2-ethanesulfonicN-2- 羟 乙 基acid哌 嗪 -N-2- 乙磺酸HNE4-hydroxy-2-nonenal4- 羟 基 -2- 丙烯醛JNKC-Jun N-terminal kinasec-Jun 氨基端激酶LC3Microtubule-associated protein1 light chain3微 管 相 关 蛋白轻链 3MAPKMitogen-activated protein kinase丝 裂 原

17、 活 化蛋白激酶N-acetylcysteineN- 乙 酰 -L- 半胱氨酸O.D.Optical density光密度VIPAGEPolyacrylamide gel electrophoresis聚 丙 烯 酰 胺凝胶电泳PBSPhosphate buffered saline磷 酸 盐 缓 冲液PCDProgrammed Cell Death程 序 性 细 胞死亡PI3KClass III phosphatidylinositol 3-kinase 型 磷 脂 酰肌 醇 三 磷 酸PMSFPhenylmethyl sulfony1 fluoride苯 甲 基 磺 酰氟PNPPP-nit

18、rophenyl phosphate对 硝 基 苯 磷酸PVDFPolyvinylidene difluoride聚 偏 二 氟 乙烯膜ROSReactive oxygen species活性氧SDSSodium dodecyl sulfate十 二 烷 基 硫酸钠TEMEDN,N,N,N-tetramethylethylenediamine四 乙 基 乙 二胺tMCAOTemporary middle cerebral artery occlusion短 暂 性 大 脑中动脉闭塞TOR kinaseTarget of rapamycin kinase雷 帕 霉 素 靶点激酶TBITrauma

19、tic Brain Injury创 伤 性 脑 损伤TrisTris（hydroxymethyl）aminomethane三（羟甲基）氨基甲烷TTC2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride2，3，5-氯化三苯四氮唑Tween-20吐温-20VII第一部分： 脑缺血再灌注损伤后自噬相关蛋白的表达及调控机制引 言脑血管疾病是神经系统的常见疾病和多发病，是人类严重病残和死亡的重要原因之一，其中又以缺血性脑血管疾病的发病率居首位。流行病学调查显示缺血性脑卒中的发病率大约为 2.54，死亡率为 3。严重的后遗症及很高的死亡率一直困扰着医疗界，多年来缺乏新型的有效治疗药物。自

20、噬作为存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性的胞内降解途径，与神经元存活/死亡密切相关，其在脑缺血再灌注损伤过程中参与的复杂调控机制已经成为目前神经系统疾病研究的重点之一。1. 自噬1.1 自噬的概念脑缺血可以引起大脑神经元不可逆性损伤和死亡。在细胞死亡的过程中，可能发生凋亡性程序性细胞死亡（Apoptosis），自噬性程序性细胞死亡（Autophagy）和细胞坏死（Nercrosis）三种类型1。凋亡的主要形态学特征表现为细胞皱缩，染色质边集，核 DNA 降解，残余的细胞被吞噬细胞消化，被称为型程序性细胞死亡。近年来，另一种新的细胞死亡方式自噬性程序性细胞死亡吸引了科学家们的关注被称为 II 型

21、程序性细胞死亡。通过电镜可以看到膜状结构的自噬体和其他亚细胞结构以及荧光显微镜观察到点状聚集物的形成（如图 1 所示）。自噬这一概念最早由 Christian de Duve 于 1963 年提出，一份全新的国际性杂志Autophagy已在2005 年 4 月份出版，2007 年召开第一次自噬国际会议。针对目前自噬检测缺乏统一标准的问题，Autophagy杂志在 2008 年第二期，刊登了主编 Daniel 联合世界 上 200 多名自噬研究领域专家撰写的综述文章 Guidelines for the use andinterpretation of assays for monitoring

22、 autophagy in higher eukaryotes。目前，自噬继凋亡之后已逐渐成为学科各领域研究的重要发展方向。1图 1 自噬电镜及荧光显微镜的图片Figure 1 Images of electron microscopy and fluorescence microscopy in autophagy1.2 自噬的形成及分类1.2.1 自噬的形成过程自噬首先通过粗面内质网的非核糖体区域、高尔基体等来源的自噬体膜脱落形成杯状分隔膜，包绕在被降解胞质内容物周围，分隔膜逐延伸，将要被降解的胞浆成分完全包绕形成自噬体（autophagosome），自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体并借助

23、于蛋白水解酶降解其内成分，之后自噬体膜脱落再循环利用2 （如图 2 所示）。图 2 自噬体的形成过程 Nat Rev Drug Discov 2007, 6: 304-312Figure 2 The formation process of autophagosome Nat Rev Drug Discov 2007, 6:304-31221.2.2 自噬的分类 根据细胞物质运送到溶酶体内的途径不同，已确定自噬主要有3种形式：大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬3。大自噬（Macroautophagy），又称巨自噬，即我们通常所指的自噬，是非溶酶体来 源的双层膜结构包裹胞浆内容物和变性坏死的细胞

24、器形成自噬体，接着是在细胞骨 架蛋白驱动下自噬体与溶酶体的融合，形成自噬溶酶体，溶酶体利用自身的蛋白水解酶降解自噬体内细胞物质。大自噬通常在外界环境压力或者内环境变化刺激下激活，一方面利用降解成的核苷、氨基酸和脂肪酸合成新的大分子和ATP，维持细胞的正常代谢和生存，另一方面它可以选择性地清除某些细胞成分，维持细胞自我稳态。自噬相关蛋白的发现可以让我们使用分子生物学手段以这类蛋白为靶点来调控自噬，从而搞清楚巨自噬在病理条件下所起的作用4。小自噬（Microautophagy）又称微自噬。与大自噬不同，小自噬通过溶酶体膜自身变形来包裹和降解胞浆内容物。小自噬主要参与细胞在正常情况下细胞器的降解5，

25、此外小自噬还可以选择性降解细胞内多余的细胞器，如某些药物可以诱导过氧化物酶体增生，而小自噬则可以选择性的降解这种细胞器来维持细胞器的正常数目6。由于目前还没有很好的手段来调控小自噬，还不清楚这种自噬在人类疾病中所起的作用。分子伴侣介导的自噬（Chaperone-mediated autophagy,CMA） 与前两者不同，没有形成膜性结构的过程即不发生囊泡转运，其典型特点是具有选择性。首先由胞浆中分子伴侣识别底物蛋白分子的特定氨基酸序列并与之结合后，溶酶体腔中的另外一种分子伴侣介导底物在溶酶体膜的转位，进入溶酶体腔中的底物在水解酶作用下分解为其组成成分，被细胞再利用7。2. 自噬的调控机制2.

26、1 参与自噬体形成的两个泛素样蛋白系统在哺乳动物细胞自噬的自噬泡形成过程中与自噬相关基因（ATG）有关，即依赖于两个泛素样结合系统Atg12-Atg5 和 Atg8 系统。Atg 蛋白根据功能的不同分为四类：（1）Atg1 复合体，整合 TOR 激酶的信号，该复合体参与自噬体形成的起始、3成核、延伸8。（2）Beclin 1/ PI3K（Vps34）复合体，参与自噬的成核阶段9。（3）两条泛素样接合系统，Atg12 和 LC3（LC3 与酵母 Atg8 蛋白同源）。在自噬体形成的起始阶段，Atg12 结合 Atg5，并促进 LC3 与磷脂酰乙醇胺的结合来促进自噬体的延伸10。（4）Atg1 和

27、 Atg9 调控的再循环通路。Atg1 和 Atg9 蛋白调控其他 Atg 蛋白在自噬体形成过程中在自噬体内外的穿梭作用11。其中 Atg3、Atg5、Atg7、Atg10、Atg12 和LC3 （microtubule 2 associated protein 1 light chain 3 , MAP12LC3） 参与组成了这两条泛素样蛋白加工修饰过程。Atg12 首先由 E1 酶 Atg7 活化，之后转运至 E2 酶 Atg10，最后与 Atg5 泛素化结合，形成 Atg12-Atg5 复合物也称为自噬体前体（ autophagosomal precursor） 。这一复合物结合于形成中的自噬小体的外膜，帮助其延伸，在自噬小体完全形成后即脱落。另一泛素样结合系统包含 Atg8 及其靶向分子磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）。Atg4 是一种半胱氨酸天冬氨酸酶，它首先将