现代生物技术第4章Word文档下载推荐.docx

1、 注射含抗体成份的抗血清，使人体“被动地”获得特异的或非特异的抵抗能力。三、基因工程疫苗基因工程疫苗是利用基因工程方法表达出病原微生物一段基因序列，将表达的产物（多数无毒、无感染性、免疫性强）作为疫苗。在生产基因工程活体疫苗时，入们一般都使用活体非致病性载体系统。这种系统能够携带一些与它本身完全无关的致病物质的抗原决定簇（epitope，抗原分子上某一特定的被抗体识别的化学功能区域，也称表位）。采用这种方法就可以针对特定的致病物质产生更强的免疫反应。（一）亚单位疫苗概念1、 亚基疫苗（subunit vaccine）是指利用病原生物某一部分制得的疫苗。2、优点（1）避免直接使用病原体导致受者致

2、病的危险。（2）以纯化蛋白为抗原，避免混杂核酸导致的副作用,使用安全。（3）单独使用特异蛋白增强效果。 3、 局限性（缺点）（1）纯化单一蛋白价格昂贵（2）蛋白构象变化引起抗原性变化（3）活化免疫反应能力弱 4、制备亚单位疫苗的前提鉴别出什么成分引起宿主免疫反应。 例：单纯疱疹疫苗、口蹄疫病毒疫苗5、几个亚基疫苗的应用实例 （1）单纯疱疹病毒疫苗 单纯疱疹病毒（HSV-herps simple virus）属于疱疹病毒科疱疹病毒亚科，它可以在神经节中潜伏。它不但可以引起性病、严重的肺部感染以及脑炎,而且还是一种致癌病毒。因此，不论是用灭话的还是减毒的单纯疱疹病毒作为疫苗预防HSV感染，被接种者

3、都会有患癌症的风险。因此, 无致癌活性的亚基疫苗就是防治HSV的最佳选择了。 单纯疮疹病毒1型（HSV1）衣壳糖蛋白D（gpD）就是这样的成分。将HSV1的gpD蛋白注射入老鼠体内，老鼠就可以产生能中和完整的HSV的抗体。于是研究人员分离出了HSV1的gpD基因。完整的邮编码的蛋白通常是结合在哺乳动物细胞的细胞膜上。鉴于膜结合蛋白比可溶性蛋白更难于纯化，人们通过基因改造去掉了gpD中编码C端跨膜结构域的序列（图154）。将改造过的基因转化到中国仓鼠卵巢细胞中，其表达产物能正确地糖基化，并分泌倒细胞外，并能有效地防治HSV-l和HSV-2的感染。（2） 口蹄疫病毒疫苗 口蹄疫病毒 （ foot

4、and month disease virus，FMDV ） 对于牛和猪有极强的毒性, 用甲醛灭活的口蹄疫病毒作疫苗可以把FMDV的危害控制在较低水平。全世界每年要消耗约10亿支这种灭活疫苗。 FMDV中诱导抗体产生的主要成分是病毒衣壳蛋白1（VP1），虽然相对于完整的病毒粒子来说，纯化的VPl的抗原性要弱很多，但是它诱导产生的抗体仍然能够保护动物免受FMDV的感染，因此，人们可以克隆VPl基因进行表达，以进一步获得纯化的蛋白。（二）肽疫苗 根据病毒粒子的结构（图4.4 ），人们很容易产生这样的想法，只有位于病毒衣壳外表可以与抗体结合的蛋白，其结构域才能引起免疫反应。而那些位于病毒粒子内部，并

5、且与维持外部结构域的构象无关的部分可能就不具有免疫原性 。如果这个想法正确的话，那么实际上只需要类似于抗原决定簇的小肽就可以当作疫苗使用了。 小肽作疫苗也有一些限制因素，主要表现在以下几个方面。 一是 充当抗原决定簇的肽段不能太长，而且要连续；但在有的病毒中抗原决定簇是由很多氨基酸组成的，而且这些氨基酸有可能分开分布在蛋白的不同区域，这样要制造肽段疫苗就有一定的困难。 二是 要求脓段的构象必须与完整病毒上的抗原决定簇构象一致。 三是 要求选定的单一的抗原决定簇必须要有足够强的免疫原性。三、DNA疫苗1、DNA免疫又称基因免疫（genetic immunity）或核酸免疫 Wolf （1993）

6、等人意外地将流感病毒核蛋白P抗原基因直接注射到小鼠骨骼肌后发现可引起长达2个月的特异性免疫反应，产生多种亚型TK细胞。 从此，DNA免疫成为世界研究的热点。1994年和1995年世界卫生组织和美国科学院分别召开专门会议，讨论DNA免疫的应用前景，认为DNA免疫开创了疫苗学的新纪元。 DNA 免疫的应用研究也是从1993年开始的，科学家们首先将流感病毒的核蛋白抗原（NP）基因克隆到表达载体中，然后直接注人小鼠。 流感病毒属于正粘病毒科（Orthomyxioviridae）, 是有包膜的负链RNA病毒，其表面有血凝素（一种糖蛋白）突起（图4-7）。流感病毒的包膜蛋白极易变异，因而难以被免疫系统逐一

7、识别。但是它的核蛋白抗原（NP）却非常保守。 把NP基因注射进小鼠体内后可以产生针对多种亚型的杀伤性T细胞。用流感病毒去侵染免疫过的小鼠，小鼠的存活率较对照组提高了50。 还有人用丙型肝炎病毒（HCV）的核心抗原DNA免疫动物。获得了针对比HCV核心抗原的体液免疫及细胞免疫。 可见，DNA免疫对于防治变异较大，难以用传统疫苗防治的病毒及病原微生物具有良好的应用前景。 目前，研究入员已对轮状病毒（急性婴幼儿肠胃炎）、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒（生殖器溃疡）、狂犬病毒（脑炎）、结核杆菌感染和疟疾（寄生虫）等开展了DNA疫苗的研究。2、DNA免疫的优点（1）DNA片段更加稳定；DNA在

8、制成于粉后可以保存的时 间较长；（2）DNA的提取纯化比蛋白质的提取纯化要容易得多，大 规模生产比蛋白容易，成本低；（3）任何DNA都可作为疫苗,同一个质粒可插入多个基因;（4）对目前难以用常规疫苗控制的疾病有重要意义；（5）难以纯化或抗原成分不明的抗原可制成DNA疫苗；（6）用于癌症等疑难疾病治疗。 DNA免疫还可用于癌症等疑难病症的治疗。研究表明，向小鼠体内注人编码抗体可变区基因的质粒，可产生抗独特型抗体，因此，抗体可变区基因疫苗可用于治疗B淋巴瘤，同样，T细胞受体独特型基因疫苗也可用于治疗T细胞淋巴瘤。有人把编码人癌胚抗原（CEA）的质粒注入到小鼠舌中之后，引起了针对人CEA的特异性细胞

9、免疫和体液免疫，这结果为治疗人类结肠癌、乳肠癌和肺癌带来了希望。 因此，DNA免疫很可能为人类最终攻克癌症、艾滋病等疑难病症提供有力的支持。3、 DNA免疫存在的问题 现有的研究结果表明DNA疫苗可以在肌肉，皮内,皮下, 血液内和粘膜等处引起免疫应答。但是, DNA疫苗普遍存在免疫效力较低的问题。因此，提高DNA疫苗的效力是目前研究的主要中心。（1）免疫效率低提高免疫效率是目前的研究中心。（2）免疫机制、免疫毒理不明 建立动物模型进行研究4、提高DNA疫苗的效力的方法（1）注射疫苗DNA的剂量越大，所引起的免疫反应就越强。（2）有人认为还可通过加强免疫来达到提高DNA疫苗效力的目的，隔56周进

10、行一次加强免疫，加强12次以后，就可以明显地提高DNA疫苗的效力。（3）维生素的D作为DNA疫苗佐剂也可以增强DNA疫苗的效力。 DNA免疫还只是一项刚刚起步的新技术，因此迫切需要解决一系列理论和实践问题，如DNA免疫的机制、DNA免疫的毒理研究及动物模型的建立等。有人预测，这方面的研究可能最终会产生生物学中一个新的研究领域DNA免疫学。四、活体重组疫苗 活体重组疫苗就是用基因工程方法对非病原微生物（细菌、病毒）进行改造，使微生物携带有某种特定病原微生物抗原决定簇基因并表达这些基因产生免疫原性；或通过基因修饰或去除毒性基因但保留抗原性而制成的疫苗。2、特点 能激活MHC蛋白和细胞免疫，诱导出T

11、K细胞杀伤感染细胞。诱发产生的免疫反应优于单一抗原。例：霍乱活体重组疫苗症状 发烧、脱水、腹泻、腹痛等病原体 霍乱弧菌，寄生于小肠，分泌大量霍乱肠毒素霍乱肠毒素特征 肠毒素含有1个A亚基和5个B亚基。（1）A亚基 具有ADP糖化酶活性，同时能激活腺苷酸环 化酶。有两个功能区： A1肽：包括毒性区，194AA A2肽：连接A1和B亚基（2）B亚基 能与肠黏膜结合。（3）霍乱肠毒素特征改造方法 破坏A1基因序列，获得A1肽基因不能恢复的菌株；即在A1肽基因中插入四环素抗性基因。3、活体重组疫苗载体应满足的基本条件（1）有稳定的减毒表型（2）生活史中不能与宿主染色体整合（3）可表达出具有免疫原性的外

12、源序列（4）操作方便（5）接种后不会长期在体外存留4、常用活体重组疫苗载体（1）痘苗病毒载体（2）流感病毒载体（3）Mango 病毒载体（4）金丝雀痘病毒载体（5）仙苔病毒载体（6）疱疹病毒载体五、细菌及其它疫苗（1）抗细菌疫苗（2）抗独特型抗体疫苗（3）器官移植排斥反应预防（4）细菌血症感染治疗（5）免疫避孕疫苗（一）抗细菌疫苗 由于青霉素、链霉素等抗生素的发现和广泛使用,抗细菌疫苗的开发和研制工作长期以来进展较慢。但是抗生索的广泛使用也存在一些缺点。（1）并非所有的细菌病均可用抗生素治疗；（2）在过去的40几年中由于抗生素的大量使用，有些菌株已进化出了对多种抗生素的抗性；（3）抗生素需要冷

13、藏，这在很多热带国家是比较困难的。（二）抗独特型抗体疫苗 在研究中人们发现，与特定抗原的抗体结合的抗体，即抗抗体，有时候具有初始抗原的免疫原性。这种抗抗体称为抗独特型抗体（anti-idotype antibody）。也就是说，抗独特型抗体是抗原的代用品，来模拟特定的抗原。因此可以利用抗抗体来获得疫苗 目前的研究已经证明，用抗独特型抗体作为疫苗是可行的。在鼠体内注人用这种方法制得的抗人类昏睡症致病寄生虫Trypanosoma rhodesiense（锥虫属）疫苗和在鸡体内注人抗人球虫病的致病原核寄生物Eimeria tenella疫苗均获得了满意的效果。同样拟病毒或细菌的抗独特型抗体也能在受体

14、体内激活足够多的抗体。这种方法为疫苗的研制开辟了新的途径。 在有些情况下，可以利用抗抗体来获得疫苗。例如：抗原物质难以得到；或是目标分子或病原物自身的免疫原性较弱；或是培养病原物十分危险，不好操作；或是需要针对病原物的某些特殊抗原决定簇进行免疫；还有就是抗原不是蛋白质等等，应用抗独特型抗体来制造疫苗是有其独特的优越性的。（三）移植器官的排斥反应的预防 从20世纪70年代开始被动免疫就被视为防止器官移植过程中发生免疫排斥的一种方法。其基本原理就是给患者服用一些特殊的抗体，它能够与特定的淋巴细胞相结合，从而消除针对移植器官的免疫反应。 在美国，鼠单克隆抗体OKT3是被批准使用的第一例移植器官抗免疫

15、反应药物。在胸腺中分化生成的淋巴细胞叫T细胞，不同种类的T细胞或作为辅助细胞或作为效应细胞在免疫排斥过程中起作用。OKT3单克隆抗体可以与T细胞表面受体CD3 相结合，阻止免疫反应的发生，保护移植器官不被排斥。虽然免疫抑制对于抗排斥反应也同样有效，但是有一些负作用产生，包括发烧、疱疹等 。 （四）细菌造成的血液感染的治疗 由于造成血液感染的多数菌株对抗生素具有抗性、所以由革兰氏阴性细菌感染造成的血液感染在美国每年会造成数千甚至几万人死亡。因此，人们迫切需要找到抵抗这些细菌的新药。 革兰氏阴性细菌的毒性主要是由于它们的细胞壁中能释放出一种脂多糖（LPS）内毒素，这种可溶性的内毒素能启动一系列剧烈

16、的免疫反应，导致发烧、细胞解体、心跳加快、呼吸急促，甚至致命的器官衰竭 控制革兰氏阴性细菌的方法之一就是使用内毒素抗体。 人们制备了革兰氏阴性细菌保守区域的人源的或鼠源的单克隆抗体。这两种抗体都能控制革兰氏阴性细菌感染，其中人源单抗基本没有负作用，而对鼠源的单抗少数患者会产生较轻的不良反应。 这些抗体的功能和效果还需要通过更多的病例来验证。目前的每剂单抗药物很贵，如果所有的细菌病均利用单抗药物治疗的话，每年的花费恐怕要达到2000亿美元。（五）恶性疟原虫疫苗 疟疾是威胁人类健康的主要寄生虫疾病之一，尤其在落后的发展中国家发病严重。恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）是危害最

17、大的病原体。它的感染力强、增殖迅速、引起的症状严重、致死率高，迄今还没有十分有效的预防方法。 疟原虫侵染人体的过程大致是这样的： 当携带有疟疾子孢子的按蚊（Anopheles mosquito）叮咬人体后，子孢子进入血液循环，几分钟后大部分被肝脏或脾脏清除，少量侵入肝脏。一周之后持有成千的裂殖性芽抱释放到血液中侵染红细胞，并在其中进行无性增殖，破裂释放，再侵人新的红细胞的感染循环。也有一小部分裂殖性芽抱在红细胞内发育成配子母细胞，形成雌、雄配子体，它们被吸人蚊体后，受精并在蚊子的中肠内发育，数周后成熟。经过血液、淋巴液循环迁移到唾液腺即为成熟的子孢子，这种蚊子对人体的叮咬又会启动下一轮新的感染

18、。 根据疟原虫的生活史及其逃避免疫攻击的方法，研究人员正试图从3个方面人手获得疟原虫疫苗：诱导疫苗受体产生针对环子孢子蛋白（CSP）的抗体；诱导疫苗受体产生针对裂殖子表面抗原，与侵入红细胞有关的抗原及感染的红细胞的表面抗原的抗体；以配子体表面抗原或合子体表面抗原作为疫苗的组分，以阻止配子的结合或合子的发育，从而阻断疟原虫的传播。 目前已经确定的疟原虫的几种重要抗原有： 环子孢子抗原（CSP）, 主要表面抗原1、2（MSAl, MSA2）， 环状体感染红细胞表面抗原（RESA）等。 综合考虑价格、效果等多方面的因素，基因工程肽疫苗的前景很好。目前已经获得的基因工程疫苗有3种，一是:FSV1（R3

19、2tet32），它以胞壁酰二肽（MDP）为载体,由 （NANP）15（NVDP）12与四环素抗性基因的前32个氨 基酸（tet32）组成融合蛋白； 二是: RESA基因3重复或5重复的部分表达产物； 三是: 利用HRP、SERP、MSAl等分子中的抗原决定簇构成多亚基重组疫苗。 遗憾的是，到目前为止人们尚未获得满意的疟疾疫苗。究其原因主要有以下几个方面：疟原虫在生活史的不同阶段其抗原成分各不相同；而且抗原甚至还有株特异性和种特异性；在疟原虫抗原中广泛存在的重复性短肽分散了机体的免疫力量，阻止有效免疫反应的扩大，它们还可能参与了与疟疾相关的免疫抑制；目前所发现的疟疾相关抗原的免疫原性都很弱；很多

20、抗原决定簇所诱导的抗体水平与其发生的保护作用不一定是正相关的；抗体的持久性较差；由于MHC的限制，对一种人群有效的疟疾亚基疫苗可能对另一种人群无效六、肿瘤疫苗1、肿瘤细胞免疫特性（1）缺乏肿瘤特异性抗原（2）抑制复合因子产生（3）抑制细胞因子产生（4）抑制MHCII复合物产生（5）抑制MHC表达2、肿瘤细胞疫苗制备一般流程：（1）肿瘤细胞灭活 紫外照射、同位素处理、化学物质处理、加热（2）将外源基因导入肿瘤细胞 复合刺激因子基因、细胞因子基因、MHC基因3、活体重组肿瘤疫苗制备 将肿瘤相关抗原基因或肿瘤特异性抗原基因导入正常细胞。4、肽疫苗（1）独特型肽疫苗（2）Heat Shock蛋白肽复合

21、体疫苗（3）双功能抗体/双特异性抗体七、AIDS疫苗 艾滋病（AIDS -aquried immunodeficiency syndrome）是获得性免疫缺陷综合症的简称。1、艾滋病的简介1981年在美国发现首例获得性免疫缺陷综合症（AIDS）患者。而后，这种中文音译为艾滋病的病以极快的速度迅速在全球蔓延。 1988年世界卫生组织将每年的12月1日定为艾滋病日。 到1996年底，全球已有约3000万人感染上了艾滋病，且发病人数仍在逐年增加，据世界卫生组织预测，到20世纪的最后一年全球将有多达4000万人感染上艾滋病。（一）艾滋病（AIDS）是20世纪的瘟疫 1981年在美国发现首例获得性免疫缺

22、陷综合症患者。 到1996年底，全球已有约3000万人感染上了艾滋病，且发病人数仍在逐年增加，据世界卫生组织预测，到20世纪的最后一年全球将有多达4000万人感染上艾滋病一、艾滋病是20世纪的瘟疫也就是说在20世纪的最后三年中平均每天都将有8000到9000人感染上这种病，每12秒就增加一名患者。（二）艾滋病为什么可怕2.1 艾滋病病毒简介2.2 艾滋病的传播途径2.1人类免疫缺陷病毒 （HIV）1、获得性免疫缺陷综合症 （AIDS） 的病原体是： 人类免疫缺陷病毒 Human Immunodeficiency Virus，HIV 慢病毒属的逆转录病毒2、 HIV感染和破坏CD4+ T淋巴细胞

23、，导致免疫系统的损害3、分类（1）HIV-1亚型： 致病力 强 、起源于中非A-J（M）,O和N （2）HIV-2亚型：致病力 弱 、起源于西非。A-F4、HIV攻击的目标感染和破坏CD4+ T淋巴细胞，导致免疫系统的损害。 2.2 艾滋病的传播途径流行特征性接触传播（异性性行为、同性性行为）血液传播（共用注射器静脉吸毒、输入含艾滋病病毒的血液及制品等）母婴垂直传播（通过胎盘、分娩、哺乳等）艾滋病的危害（一）1、传播途径与人类行为密切相关，对人类生存危害大 感染艾滋病病毒后长期没有临床症状，欺骗性大。2、感染对象主要是青壮年，是社会劳动力，对经济发展影响大。3、感染者管理涉及社会方方面，管理难

24、度大4、虽然有药物可以治疗，但是不能治愈，有多种表现，治疗难度大。5、一旦感染艾滋病涉及到家庭子女，社会负面影响大1、对患者自身的危害 目前艾滋病已成为一种可控的慢性病。但仍有相当一部分患者因未及时诊治、病毒耐药或药物的副作用等原因，而死亡或致残。同时由于社会对感染者的歧视，也常常给感染者带来沉重的精神压力。2. 对他人的危害 感染者无保护的性行为、多个性伴、共用针具静脉吸毒及经过母婴途径等可将病毒传染给其他人。3. 对家庭及社会的危害 虽然我国早已实施对HIV感染者“四免一关怀”的政策，但晚期并发症的治疗仍可能给家庭和社会带来沉重的经济负担和社会问题。现实状况1、由于羞耻和担心社会歧视，不主

25、动做检查。2、检查发现阳性后，来自家庭、社会的歧视。3、拒绝检查、采取极端行为等。4、高危险行为仍然继续。降低感染 HIV的危险1、避免没有防护的任何方式的性行为。使用安全套或其他有保护性的器具（并非100%有效）2、限制性伴侣数目，长期有固定专一伴侣。3、性关系开始前，讨论彼此作病毒检测。诊断的重要性1、及时发现和治疗，延长生命2、进行防治教育，改变高危行为和预防进一步传播3、减低母婴传播的危险性4、早期治疗，保障和稳定免疫系统的应答功能 检 测1、病毒 （1）检定抗体，抗原 （2）病毒核酸 （DNA/RNA）2、免疫系统 CD4 计数3、免疫指标A、周围血 循环淋巴细胞显著减少，往往低于1

26、00/mm2（正 常1500-4000/mm2）。 T淋巴细胞中则以辅助细胞（T4）减少为主，抑 制细胞（T8）相对增加，T4与T8的比例下降 （正常人T4/T8比例为1.75-2.1），而艾滋病患者中其比例1.0）。这一点是诊断艾滋病的免疫学依据。B、T细胞功能下降 临床出现条件性感染和肿瘤； 迟发型变态反应性的皮肤试验转阴； 体外试验证实非特异性有丝分裂原刺激时，T细胞反应性降低， T细胞的细胞毒下降； 产生白细胞介毒-2和 r一干扰素少。C、B细胞功能失调 多克隆性高球蛋白血症； 对新抗原的刺激不产生应有的抗体反应。D、自然杀伤细胞活性下降，其中T4的受损是造成本病免疫缺陷的关键。4、H

27、IV 的血清学检测 （1）急性期 病毒量与抗体 （2）非急性期 抗体5、HIV 感染者的监测 病毒量与 CD4 计数的追踪检测HIV抗体的检测方法1、快速血液检测法2、快速唾液检测法3、标准血液检测法无症状/潜伏期 HIV1、无症状，但有感染性。2、一般长达8-10年。3、感染后4个月时的病毒量（Set Point）, 与是否医治, 决定潜伏期的长久。 此期间，病毒隐藏在机体内。临床表现（一） 我国将HIV感染分为急性期、无症状期和艾滋病期。（一）急性期：通常发生在初次感染HIV后2-4周左右。 临床主要表现为发热、咽痛、盗汗、恶心、呕吐、腹泻、皮疹、关节痛、淋巴结肿大及神经系统症状。多数患者临床症状轻微，持续1-3周后缓解。 此期在血液中可检出HIVRNA和P24抗原，而HIV抗体则在感染后数周才出现。CD4+ T淋巴细胞计数一过性减少，CD4/CD8比例可倒置。（二）无症状期 可从急性期进入此期，或无明显的急性期症状而直接进入此期。 此期持续时间一般为6-8年。但也有快速进展和长期不进展者。此期的长短与感染病毒的数量、型别，感染途径，机体免疫状