病理制片过程.docx

1、病理制片过程病理制片过程 在临床病理科和组织学实验室，切片是最重要的技术之一。切片的质量不好，就无法对标本进行观察。好的切片机只是整个样品制备过程 中的一个环节。要制备一张好的切片，必须要将技术、知识和技巧进行完美的结合。 待切片样品的质量是非常关键的因素，而样品质量有取决于前期处理工作的准确无误（例如：固定、巨检、脱水和包埋）必须选择正确的切片机型号以及合适的钢刀或一次性刀片。切片必须根据实际应用出发，需要根据样品的类型、大小、期望的厚度认真考 虑，还要兼顾操作者的便利性和舒适性。 要且出高质量的切片，经验丰富的操作者也是必不可少的条件之一。操作者必须懂得切片机的工作原理，能够对机器进行精细

2、调节以达到 最佳效果；并且能应对常见故障，消除一些潜在的切片问题；还可以运用恰当的切片技术，提高切片速度但不影响质量。 目前能做病理组织切片的地方很多，但要数上海舜田生物做出的病理切片相对质量上比较好，该公司有1位专业从事病理实验的老师及相关实验技术人员，积累了丰富的实验经验，所作出的切片及染色效果相当不错。1 正确处理标本的重要性1.1 固定 正确的固定是病理制片技术中最重要的一步，这个步骤会影响到后续的每个环节。如果固定不充分，样品的质量就会有欠缺。组织必须在 选定的固定剂中浸泡足够长的时间，使大分子保持固有形态。正确的固定可以防止样品在脱水剂中发生变性以及后期处理步骤对于样品造 成的损害

3、。固定不充分可能增加切片的困难，表现出过度收缩，并且会导致细胞核染色不足和/或胞核呈现“泡沫”状。 1.2巨检 样品需要修切成薄片，并尽可能做到均匀，否则很难在切片机上切出好的片子。如果样品太厚以至于无法渗透充分，则必须经过再次处理 才能进行切片。这样会影响样品的质量，更浪费时间。从最初的步骤开始就正确处理会使后面的工作更简单，因此在大体取材的时候多花 些功夫会为以后的步骤节省大量时间和精力。备注：包埋盒塞满组织且组织过厚就无法很好的固定，后续的处理步骤也会效果欠佳。1.3脱钙 为了后期进行石蜡包埋切片，骨组织需要进行脱钙，钙必须被完全去除才能确保切片的完整，并且可以防止刀具的损坏。在用酸溶液

4、进行 脱钙之前，骨组织必须经过彻底的固定，这样其中的软组织成分才能够被保护，且防止细胞核在酸的作用下被破坏，比如蛋白质水解作用 。1.4组织处理（脱水） 组织经过一系列经典的处理过程，是使原本亲水性的组织最终可以用疏水性的介质进行包埋，比如石蜡，火棉胶和绝大多数树酯。备注：样品无论是处理不充分还是处理过度，都可能导致切片效果不理想。脱水机旋转升降式脱水机目前仍有一些病理工作者使用，但是全自动全封闭负压/压力式脱水机逐渐占据主导地位。后者更有利于保护工作环境 ，更确保组织和试剂的充分作用，可以更有效缩短脱水时间。一些更先进的全自动全封闭脱水机还可以自动记录试剂的使用情况，并对试 剂进行智能监控和

5、更换。 有一点非常重要，就是处理过度对组织造成破坏绝对不亚于处理不充分造成的后果。多种因素，比如试剂的种类，处理步骤的多寡，处理 时间的长短，试剂的清洁度以及加热、真空和/或压力的使用都会影响具体某个样品的处理程度。 注：不同来源和不同大小的样品最好不要共用同一个处理程序，这样可以避免其中部分样品处理过度，而部分处理还不充分。处理步骤：（一）脱水： 脱水的关键就是将样品置于脱水试剂中足够长的时间，其中的游离水分子被除去，但是脱水时间也不宜过长，否则结合水分子也会被除去 ，会导致结构的变化。而脱水时间过短致使水分还残留在样品中，就会导致包埋介质无法很好渗透入样品。但是，脱水过度会导致样品的 皱缩

6、变脆。从过度脱水的组织块上切到的切片，一旦放入水中，切片就会膨胀最后破碎。如果将整个组织块浸入水中，则组织的表面会因 为水化而膨胀，这样再进行切片，虽然片子的性状会有所改善，但是形态学会发生改变，而且染色后会发生色彩偏淡，对比度较弱。最常 用的脱水剂是乙醇和变性酒精。甲基酒精有毒性，会破坏肝脏中的甲醛，因此不太单独使用。异丙醇是乙醇最佳替代物，常规在微波处理 中使用。丁醇，剧毒，适用于较慢的组织处理过程，而且多用在植物和动物组织。 无水酒精往往会含有水分，因此最好能检测一下试剂的纯度。可以用液体比重计来测定，也可以将几毫升酒精滴入几毫升二甲苯或甲苯， 如果混合液出现混浊就表示酒精中至少含有2的

7、水分。（二）透明：用来进行透明的试剂和脱水剂以及包埋介质必须非常容易混合。如果组织在透明剂中时间不够，那么组织就会发软甚至呈糊状。略微延长 时间并/或定期更换新鲜溶液可以避免透明不足的问题。最常用的透明试剂如下： 二甲苯： 目前仍被广泛使用的一种芳香烃类化合物，能够快速替换组织中的乙醇。在正确的脱水步骤后，芳香烃能够改变样品的折射率并使组织变 透明。当有水分存在的时候，二甲苯会变混浊，这时必须更换。作用时间过长会导致组织变硬，尤其一些纤维、肌肉中枢神经系统或软骨 组织更容易变硬。如果发现组织在完成处理后变得太硬或发脆，请减少透明的时间或者寻找二甲苯替代物。请注意，微波处理过程不需要 使用透明剂

8、，可以降低组织处理过度的风险。二甲苯替代物： 苯烯试剂或者短链脂肪酸碳氢化合物（烷烃）也得到了快速普及。苯烯试剂不会像二甲苯那样使组织发生硬化，但是前者更容易污染石蜡 ，因此石蜡需要更频繁的更换。脂肪族化合物更容易渗透入组织，相对二甲苯而言，更容易去除组织中的脂肪。然而，这类化合物不能接 触到水分，因此在比较潮湿的地区很难使用。若放弃二甲苯而使用其替代物，则重新调整处理的时间和溶液循环使用次数就显得尤为重要 。其他透明试剂例如苯，甲苯，氯仿和香精油的应用并不多见。（三）浸蜡（石蜡渗透）：石蜡是石油裂解物的提取物，属于惰性的碳氢化合物的混合物。在脱水机中使用石蜡，温度最好设定在熔点以上24， 在

9、最后一步石蜡渗透完成后，脱水缸必须用透明剂彻底清洗，不能有任何石蜡的残留。负压可以增强渗透的效果，但是在处理活检样本的 时候，负压和加热都必须慎用。另外还需要注意，即便有些脱水机增加到了4个蜡缸，总的渗透时间不能延长。在确保渗透效果的基础上 ，组织在石蜡中停留的时间越短越好。1.5石蜡包埋 包埋是将正确定位的组织包裹在一种介质中（此处以石蜡为例）然后固化。每个实验室都会创建一套特有的处理方法，这就决定了样品在 处理后的硬度。用来包埋的石蜡必须能够和样品的硬度相匹配，这样才能确保进行切片的蜡块质地尽可能均匀。 另外有两点对于切片也至关重要：温度和样品的定位。组织包埋机已被广泛使用，机器最大的优点

10、就是能够在每个步骤上都达到确的温控 。石蜡熔化并保持熔化状态的这个温度非常重要，必须确保一些添加剂完全溶解入石蜡。模具，样品和石蜡之间的温差必须控制在几度以 内，这样才能确保石蜡充分包围并支撑样品。已经包埋的模具最好放置在包埋机的冷台上而不是冰块上，这样可以使石蜡固化且不产生裂 缝。 样品必须进行正确定位，从而保证正确的面被切到，但是对于样品和刀刃接触的方式必须要经过考虑。对于不同类型的样品，有很多种方 法可供参考，用来正确定位样品。1.5.1提高包埋效果的技巧有些石蜡特别适合用于渗透，有些更适合用于包埋，而有些都适合。可以向供应商查询。石蜡应当在高于其熔点2C至 4C的温度下进行熔化和储存，

11、这样其中的添加剂才能溶解入液体。如果温度太低，其中一些较重的添加剂，比如聚合物就会沉在底部 ，然后最先流出。熔化的石蜡在流出以前最好先进行搅拌。设定包埋机的参数，确保石蜡流出口过夜的时候处于保温状态。经常清空并清洗流出口。始终确保流出蜡缸的石蜡是过滤后的。和以往的观点相反，将石蜡设定在高温（大约85C）持续数星期，反而是无害的。尽管石蜡中添加了稳定剂，在氧化作用下，石蜡仍然会变质。最初的征兆就是颜色转变为草黄色直到黄色。随后可能有异味产生。选择尺寸恰当的模具，确保样品的四周都被石蜡包围，样品置于中心。用压平装置或者弯头镊子的背部轻柔地将样品展平（易碎样品可能 会被压碎）。不要让样品在模具中撑太

12、满。大或硬的样品必须按照一定角度放置在模具中。如果同一个样品包含多种不同密度的成分，则包埋的时候要确保样品最硬的部分必须最后 接触到锋利的刀刃。皮肤往往带有毛发，则包埋的时候必须保证毛发最后才被切到。 动物样本中，如果组织的来源不同但是切片的性状相似则可以包埋在同一个蜡块中，比如肝脏和脾脏，脑组织和脊髓。脱钙的骨组织必须包埋在“硬”石蜡中，样品最窄的一端必须位于蜡块的底边，从而在切片的时候，最先接触到刀刃。（见下图）为了切片的稳定性，模具中必须添加足够的石蜡，确保包埋盒至少充盈一半。如果石蜡漏出，那么在蜡块完全固化之前，必须添加石蜡。1.5.2石蜡添加剂：绝大多数市售的用于组织学的石蜡是含有添

13、加剂的，目的在于改善切片的质量，改变硬度或者有利于连片。常见的添加剂如下：蜂蜡降低结晶的大小，增加粘度和附着力。橡胶降低脆性，增加粘度，有助于连片其他石蜡降低结晶大小，使质地更平滑，可以在不改变熔点的前提下提高硬度。塑料增加硬度，对硬组织起到很好的支撑作用，得到更薄的切片DMSO（二甲基亚砜）增强渗透（警告！腐蚀性）1.5.3熔点和凝固点： 绝大多数用于组织学的石蜡是多种石蜡的混合物，这样可以确保的硬度和指定的凝固点。“凝固点”是制造商使用的术语，其实相当于“ 熔点”。这个温度是指在石蜡中插入小木棒后，石蜡开始在木棒上凝固的那个温度。凝固点和熔点温度往往是同一个温度或者在两个温度 之间。市售石

14、蜡的特性往往根据其添加物和熔点的不同而有一定差异。56C 到 58C这个范围被常规实验室中普遍应用。较低熔点的石蜡(50C 到 53C)往往有其特殊的应用。一般情况，低熔点的石蜡往往比较柔软，因此更适合包埋较软的组织。进行较薄的切片比较困难，但是很容易连片。（可以选购质地较硬 但是熔点较低的石蜡。）相反的，高熔点的石蜡一般比较硬。对于质地较硬的样品，这样的石蜡有更好的支撑效果，而且很容易得到薄切片，但是连片就比较困难 了。1.5.4样品夹具在切片以前，完成包埋的蜡块必须固定到切片机的样品夹具上。夹持力必须确保样品能被完全固定，因此蜡块往往会附着在一个支持物上 ，比如塑料包埋框或者环行样品夹。在

15、不使石蜡变形且避免造成切片形状不规则的前提下，用最大的力量夹持支撑物。请注意，石蜡块必 须牢固附着于支撑物（例如，在包埋盒中必须有足够的石蜡充填），并且支撑物的背后必须接触实心物体的表面。 塑料 最常用的支撑物就是简单并独立使用的一次性包埋盒。与市售的模具配套使用，蜡块的平面会很平整，且边缘能在X和Y轴向上保持平行 。用相同方法包埋的一批组织块不需要对表面进行调节或仅需要很小的调节。 环行模具也偶尔会用到，其中必须充填足够的包埋剂，而且不能夹持太紧。圆形的支撑物经常在塑料包埋时使用。木块： 这是廉价的包埋盒替代物。尽可能使用硬质木材（避免使用松软的松木）并进行切割以适合夹具的形状。木块的表面可以开槽，从而增加 黏附力。注意：木制的支撑物在水中浸泡后会膨胀，导致在样品夹上固定效果欠佳。 金属： 金属支撑物在塑料包埋时使用较多。金属支撑物可以重复使用，但是相对比较贵，在使用时需要进行X/Y向的定位调节。而且调节这个 平面有一定的难度。如果组织块附着恰当，这种夹具的稳定性非常好。 使用切片机必须遵从最佳的工作秩序，无论使用钢刀还是一次性刀片，切缘必须