癌症研究概览Word下载.docx

1、未来的研究将采用更大的样本群，以提供统计学上可靠的关联，并逐步构建完整的突变数据库。剩下的挑战将是学习如何阐释标志物，这样医生就能够在合适的时间为合适的患者提供合适的药物。癌症是一种基因组水平的疾病，新一代测序技术可潜在影响癌症治疗的每一步。综述:Longo, D. L. （2012） Tumor heterogeneity and personalized medicine. N Engl J Med 366: 956-957Weigelt, B., Pusztai L., Ashworth A. and Reis-Filho J. S. （2012） Challenges translat

2、ing breast cancer gene signatures into the clinic. Nat Rev Clin Oncol 9: 58-64Green, E. D., Guyer M. S. and National Human Genome Research I. （2011） Charting a course for genomic medicine from base pairs to bedside. Nature 470: 204-213McDermott, U., Downing J. R. and Stratton M. R. （2011） Genomics a

3、nd the continuum of cancer care. N Engl J Med 364: 340-350Stricker, T., Catenacci D. V. and Seiwert T. Y. （2011） Molecular profiling of cancer-the future of personalized cancer medicine: a primer on cancer biology and the tools necessary to bring molecular testing to the clinic. Seminars in oncology

4、 38: 173-185癌症研究概览2：风险预测关于癌症生物标志物的发现已发表了很多文章。随着新一代测序的出现，新发现的生物标志物数量会呈现爆炸式增长。国际相关联盟正在收集更为全面的标志物与癌症突变列表，如癌症基因组图谱（TCGA）、国际癌症基因组联盟（ICGC） 和癌症体细胞突变目录（COSMIC）。关于癌症生物标志物的发现已发表了很多文章。风险标志物或遗传易感性是在生殖细胞系中找到的。生殖细胞系指的是个体遗传自父母，反过来又会传递给子女的遗传物质。一些癌症的易感性可以遗传，而这些癌症通常可在发病早期确定。一些类型的乳腺癌 和结肠癌 就是个例子。基于芯片的全基因组关联研究（GWAS）或连锁研

5、究可以有效捕获这些标志物所在的区域。然而，测序通常是发现致病基因所必需的。在人的一生中，生殖细胞系标志物只需确定一次，是早期筛查的良好候选标记。预后标志物是以疾病发展过程中肿瘤所获得的体细胞突变为基础的。因此，个体在治疗过程中可能需要检测数次，以筛查新突变的发生。此外，由于晚期肿瘤的异质性，在同一个肿瘤的不同区域可能存在好的和差的预后标志物。 治疗过程中的重新检测对确定复发可能和耐药性特别有用。定向或全基因组测序有着各自的优点和缺点。在迄今为止发现的数千个癌症突变中，成功纳入常规临床实践的癌症标志物是少之又少。检测标志物的技术和科学上的挑战将在后文中论述，但必须明确一点，只有突破财务和监管的障

6、碍，才能为临床实践开发出成功的标志物。Brooks, J.D. （2012） Translational genomics: The challenge of developing cancer biomarkers. Genome Res 22: 183 - 187在这篇综述中，作者讨论了癌症生物学标志物的挑战和未来。一个有趣的现象是，许多癌症经过几年甚至几十年才发展到致命。这表明转化细胞的检测和根除还是有很多机会。尽管这一机会之窗为检测提供了充裕的时间，但这些肿瘤在转移时的平均直径大小为9mm。更重要的是，为了让卵巢癌死亡率下降50%，必须在肿瘤直径为5 mm时就被检测到。但对于一位体重6

7、0kg的妇女来说，现有的蛋白检测技术的灵敏度远远不足以从其体内5L血液中检测到被稀释的5mm肿瘤组织的蛋白。其他非技术因素也有影响，例如癌症检测方法需要大量、昂贵的随机临床试验来显示患者发病率或死亡率的改善。癌症研究概览3：测序方法比较从长远来看，随着我们对基因组的了解日益加深，且处理和解释海量数据能力的改善，全基因组测序无疑是最好的方法。在不远的将来，靶向基因测序可帮助患者在市场上选择适合的成品药物，让他们立即受益。检测癌症基因组中的体细胞突变通常有三种方法：全基因组测序、全外显子组测序和靶向基因测序。下表简要介绍了每种方法的优点和缺点。在Chapman等人所做的全基因组测序与外显子组测序的

8、比较中，注意到多发性骨髓瘤中一半的蛋白编码突变都是通过染色体畸变（如易位）而发生的，故大部分突变都无法被单独的外显子组测序所发现。从长远来看，随着我们对基因组的了解日益加深，且处理和解释海量数据能力的改善，全基因组测序无疑是最好的方法。注意：此表假定所有方法的测序深度相同References :Roychowdhury, S., Iyer M. K., Robinson D. R., Lonigro R. J., Wu Y. M., et al. （2011） Personalized oncology through integrative high-throughput sequencin

9、g: a pilot study. Sci Transl Med 3: 111ra121Lizardi, P. M., Forloni M. and Wajapeyee N. （2011） Genome-wide approaches for cancer gene discovery. Trends Biotechnol 29: 558-568实验设计上的注意事项：肿瘤可以是高度异质化的，往往需要几次活检才能得到代表晚期肿瘤的所有标志物。一些研究在发现阶段使用全基因组测序来发现新突变。在第二阶段，使用全外显子组或定向测序来验证新发现的突变，并在大的群体中确定它们的丰度。癌症体细胞突变不发生在

10、生殖细胞系的正常参考基因组序列中。因此，很难从实验背景噪音、正常和污染细胞混合的背景下准确地检测到新的体细胞突变。如果要确信地检测新的体细胞突变，需要一定的测序深度。目前，通常建议是正常基因组最少40倍覆盖度，癌症基因组80倍覆盖度。对于不同的癌症类型或灵敏度要求，最佳读取深度也将有所不同。癌症研究概览4：全基因组测序肿瘤细胞和正常细胞配对进行全基因组测序可以完整得到关于肿瘤中存在的所有独特突变的信息。目前，全基因组测序正变得越来越便宜和快捷，它已成为无预定假设的研究发现的极佳选择。肿瘤细胞和正常细胞配对进行全基因组测序可以完整得到关于肿瘤中存在的所有独特突变的信息。Zhang, J., Di

11、ng L., Holmfeldt L., Wu G., Heatley S. L., et al. （2012） The genetic basis of early T- Cellprecusor acute lymphoblastic leukaemia. Nature 481: 157 - 163早期前体T细胞的急性淋巴细胞白血病（ETP-ALL）是一种罕见且侵袭性强的恶性肿瘤，其遗传基础未知。作者对12个ETP-ALL病例的正常和白细胞样品配对进行了全基因组测序，并在另一个独立的包括52个ETP病例和42个非ETP T-ALL儿童病例的人群中确定了体细胞突变的频率。测序得到的ETP-A

12、LL突变谱与髓系肿瘤相似，其基因组转录图谱也与正常和髓系白血病的造血干细胞相似。这些发现说明以骨髓为目标的定向治疗方法，比如能够抑制细胞因子受体和JAK信号作用的高剂量“阿糖胞苷”定向疗法，对于治疗ETP-ALL也许会有效。在诸如此类的研究中，大多样品很少且遗传变异未知，全基因组测序是发现遗传变异的很好工具。Illumina测序技术: GAIIx for 101 bp paired end readsWelch, J. S., Westervelt P., Ding L., Larson D. E., Klco J. M., et al. （2011） Use of whole- genome

13、 sequencing to diagnose a cryptic fusion oncogene. JAMA 305: 1 577 - 1584在这篇文章中，作者报道了末端配对读取全基因组测序在实时肿瘤诊断方面的应用。在25天内，他们完成了文库制备、测序和数据分析。新型插入融合的正交验证又花了27天，此融合产生了一个经典的PML-RARA bcr3变异。患者复杂的细胞遗传学预示着不利的预后，因此有必要确定患者是否有公认的PML-RARA融合基因，但传统的基于FISH和PCR的诊断方法不能明确地诊断该患者。最终，测序结果改变了该患者的医疗方案，她接受了全反式维甲酸巩固治疗，而不是异体造血干细胞

14、移植。15个月后患者的症状首次缓解。尽管其他的实验室方法也被用于潜在致病性RARA重排的检测，但这些技术往往费时费力，且需要大量起始材料、个性化设计和反复的问题排查。相比之下，使用末端配对文库的全基因组测序可利用低至10 ng起始DNA来完成，适合自动化的“流水线”策略，能够始终如一地发现单核苷酸变异（SNVs）、小的插入缺失、结构变异和克隆拷贝。此外，这种方法不需要定制试剂和对基因组区域的预先了解，而这是准确诊断所必需的。Illumina 测序技术: HiSeq 2000 系统Chapman, M. A., Lawrence M. S., Keats J. J., Cibulskis K.,

15、 Sougnez C., et al. （2011） Initial genome sequencing and analysis of multiple myeloma. Nature 471: 467 - 472这篇文章是一个有趣的癌症突变发现实验案例。作者对23名患者进行全基因组测序，对16名患者进行全外显子组测序（164,687个外显子），其中一名患者被两种方法同时分析。每个肿瘤序列都与其对应的正常组织序列相比较。此方法实现了新突变和基因组重排的无假设筛查。分析多个基因组序列就能够区分直接导致肿瘤发生的“司机突变”和与疾病发生无直接关系的“乘客突变”。作者注意到，全外显子组测序揭示了大

16、部分明显突变的基因；然而，一半的蛋白编码突变通过染色体畸变（如易位）而发生，其中大部分都不能单独通过外显子组测序找到。Illumina 测序技术：GAIIx，101bp paired-end reads （全基因组测序），76bp paired-end reads（全外显子组测序），30x coverage成功应用全基因组测序的研究案例：Bass, A. J., Lawrence M. S., Brace L. E., Ramos A. H., Drier Y., et al. （2011） Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas id

17、entifies a recurrent VTI1A-TCF7L2 fusion. Nat Genet 43: 964968癌症研究概览5：靶向重测序靶向重测序依据先前已得到的知识聚焦有限的一组基因癌症相关基因，因此结果相对而言容易解释且更具操作性。包含适当基因的分析试剂盒可用于不同类型癌症，并简化了实验室操作和数据解释。未来更大规模的研究可以展示这一方法具有根据疾病发展、遗传图谱分析、环境影响或其他因素来对患者进行划分的潜质。迄今为止的研究表明，这种方法极有潜力成为一种诊断工具。外显子组测序外显子组测序仅仅聚焦1-2%的基因组（编码蛋白的那一部分），因此运行起来没那么昂贵，且更易分析。在孟德

18、尔遗传病上使用这种方法已有许多知名的成功案例。 尽管它产生的序列只有全基因组序列的1/50，但需加入昂贵且费时的DNA富集步骤，费用节省仅为一半左右。在癌症研究中，当基因组重排很普遍时，外显子组测序可能会错过关键突变。靶向重测序依据先前已得到的知识聚焦有限的一组基因癌症相关基因，因此结果相对而言容易解释且更具操作性。Lipson, D., Capelletti M., Yelensky R., Otto G., Parker A., et al. （2012） Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and

19、lung cancer biopsies. Nat Med在这项研究中，作者靶定了145个癌症相关基因，并以此做成分析试剂盒在40个结肠直肠癌和24个非小细胞肺癌FFPE样品中进行检测。结果显示59%样品包含此分析试剂盒中的突变，而剩下的患者则不含该分析试剂盒内含的基因突变。后者将成为全基因组测序的良好候选，以扩展癌症相关的基因的分析试剂盒。一小组基因代表了主要的基因突变，但剩余突变的多样性是显著的，这恰恰凸显了分子诊断在对每位患者个性化治疗上的优势。Illumina测序技术：HiSeq 2000系统，36 bp paired-end reads，229x coverageHarismendy

20、, O., Schwab R. B., Bao L., Olson J., Rozenzhak S., et al. （2011） Detection of low prevalence somatic mutations in solid tumors with ultra - deep targeted sequencing. Genome Biol 12: R124作者利用超深度靶向测序筛查了71.1 kb的序列，这段序列包含了42个癌基因的突变位点。在混合DNA样本实验中，对于低丰度突变，灵敏度和特异性分别大于94%和99%。他们将此应用于临床癌症及小鼠异种移植样品的突变谱研究，以评估

21、该方法的分析性能和实效。基于Sanger测序方法，复杂DNA混合样品中检测到的突变丰度被限制在超过20%，而本文展示的分析方法能够轻松检测以5%丰度存在的突变。这将实现异种移植或质量不佳样品的检测，包括带稀有突变克隆、低细胞量或被基质及免疫细胞污染的样品，所有这些在临床样品中都很常见。癌症研究概览6：预后和对治疗的反应理想的癌症治疗是只靶定肿瘤的特殊分子机制且患者耐受性良好的方案。相同的临床表现可能代表了一些不同的分子机制，且患者对癌症疗法的耐受性相差很大。随着癌症的发展，它积累了大量的体细胞突变和基因组重排，导致耐药性或转移的风险提高，这将大大影响患者的预后。理想的癌症治疗是只靶定肿瘤的特殊

22、分子机制且患者耐受性良好的方案。越来越多的证据表明，富含信息的生物标志物可协助作出治疗决策，以定制针对特定患者的治疗方案。治疗过程中的不断监控也能测定对治疗的反应以及复发的风险。Ding, L., Ley T. J., Larson D. E., Miller C. A., Koboldt D. C., et al. （2012） Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole- genome sequencing. Nature 481: 506 - 510这项研究弄清了急性骨髓性白血病（AML）的

23、复发原因。作者发现了两个一般机理：（1）原发肿瘤中的细胞获得突变，进化成复发克隆，（2）原发肿瘤细胞的一个亚克隆挺过了初次治疗，获得了更多突变并在复发时扩增。在一个病例中，在原发肿瘤中仅占5.1%的亚克隆在复发后成为主要的克隆。对于所有病例，化疗并不能根除原发细胞克隆。这项研究强调了在诊断后和初次治疗后检测和根除小的细胞群体的重要性。新一代测序检测极小细胞群体中de novo突变的能力让它特别适合此类应用。GAIIx，1 01bp paired-end readsGerlinger, M., Rowan A. J., Horswell S., Larkin J., Endesfelder D.

24、, et al. （2012） Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med 366:883892在这项研究中，作者使用全外显子组测序来研究多个样品，这些样品来自两名患者体内的原发肾癌区域及相关转移部位。他们在原发肿瘤中发现了广泛的异质性，并且每个肿瘤区域内有63-69%的体细胞突变是无法在肿瘤的所有部位都检测到。他们还检测了相同肿瘤不同区域内预后良好和不良的基因表达特征。这突出了在突变积累之前早期诊断的重要性，以及较大肿瘤需要多个活检位点。同一名

25、患者的多个样品的测序让作者能够重建疾病的发展。这是一种极为强大的方法，它不仅能说明引发事件，还能指明表现出平行进化的基因。平行进化通常是进化压力的一种表现，它暗示那些基因可能成为有效的治疗靶点。GAIIx 和 HiSeq 2000系统转移转移是一个复杂的过程，期间癌细胞脱离原发肿瘤并通过血液或淋巴系统循环到身体的其他部位，在新部位癌细胞继续繁殖，最终形成更多肿瘤。肿瘤（如胰腺癌或葡萄膜恶性肿瘤）的转移能力大大增加了它们的致命性。目前肿瘤研究的主要解决的问题仍集中于：转移肿瘤的克隆结构、转移瘤之间的系统发育关系、转移和原发部位的平行进化规模以及肿瘤扩散机制。Hsieh, A. C., Liu Y

26、., Edlind M. P., Ingolia N. T., Janes M. R., et al. （2012） The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis. Nature作者证明了前列腺癌基因组通过致癌mTOR信号传导的特殊转化路径，该过程产生了一个异常特殊的基因群，它们参与了细胞增殖、代谢和侵袭。随后他们对一类转化控制的促侵袭信使RNA进行了功能鉴定，正是这些mRNA精心安排了癌症侵袭和转移。GAIIx，m RNA-Seq和ribo-Seq抗癌药物开发从药物

27、开发的前景来看，癌症带来独特的挑战。首先典型的肿瘤样品包含两个基因组：遗传自父母的生殖细胞系和疾病发展过程中积累的体细胞突变，而且肿瘤基因组也是非常动态的，可快速积累de novo突变，形成耐药性。肿瘤通常是异质性的，单个肿瘤可能包含几种细胞类型，而每一种都有其自身的药物敏感性或耐药性。动态的癌症基因组意味着癌症本身就是一种个性化的疾病，这从根本上对从大规模的人群上开发和测试药物的治疗模式发起了挑战。基于新一代测序技术能够无假设、高分辨率地分析基因组，其快速融入肿瘤药物的发现和开发进程也就不足为奇了。癌症研究概览7：癌症生物学大规模并行测序的出现为我们带来了一个前所未有的工具，让我们有望解开癌

28、症的病因和机制。对整个基因组测序是发现癌症中所有变异的终极方法。假如覆盖度足够深，研究人员可以确定没有突变会被漏掉，而且宝贵的样品也无需在未来重新测序。全基因组测序的数据还能与ChIP-Seq测序数据相整合，大大扩展分析范围。大规模并行测序的出现为我们带来了一个前所未有的工具，让我们有望解开癌症的病因和机制。mRNA-Seq提供了一种强大的互补技术，以确定遗传改变是否影响关键基因的表达水平，或融合基因是否转录，检测基因融合是一种假设驱动的研究方法，它具有一些独特的优势。首先与全基因组测序相比，mRNA-Seq产生的序列数据要少得多；其次其测序文库不包含许多难以测序的元件，如重复区域和多聚核苷酸序列区域。这种方法也有潜在的不足，即只有抽样时融合基因表达才能被检测到，这对那些受激素刺激的癌症（如乳腺癌）特别重要。在药物靶点的研究发现中，当我们假设只有表达的基因才会影响疾病后果时，这将是一种筛查大量患者的高效经济的方法。S