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1、 RNA-seq.1. 引言 32. 研究背景综述 3 大麦的耐盐机理 3 大麦与水稻的耐盐性比较 4 转录组及其测序技术（RNA-seq） 43. 材料与方法 4 实验材料 5 植株处理与取样 5 元素含量测定 6 RNA提取与RNA-Seq分析 6 数据分析 84. 文献综述 9 大麦和水稻耐盐性比较 9 盐胁迫对大麦及水稻元素含量的影响 10 盐胁迫下转录组分析 145. 讨论 22 响应基因的表达与耐盐性的关系 22 大麦和水稻耐盐性差异的基因组层面的探讨 23 研究展望及不足之处的改进 23参考文献 241. 引言土地盐渍化是全球农业生产所面临的严峻挑战之一，盐害的产生来源多种多样，

2、最普遍的是植物蒸腾作用引发的地下矿质资源上升到土表，这一趋势随着全球变暖和精耕细作进一步加剧。目前，全球大约有亿 hm2 的土地已受到盐渍化的威胁，而我国盐渍土面积约为3600万 hm2 3。盐害对植物的毒害作用主要有渗透抑制、矿质营养失调和离子毒害等2。水稻是我国种植面积最大、单产最高粮食作物，总产目前位居我国第二。作为主要粮食，稻米在全国居民粮食消费中占65以上。水稻的年种植面积约占全国粮食作物的30，总产量则要占40以上，建国以来，我国稻米生产有了较大的发展，总产量不断增加，为我国粮食生产做出了重大的贡献 3,29。耐盐性作为水稻品种改良方向之一，备受关注 6。水稻对于土壤盐分具有极大的

3、敏感性，这严重威胁到了我国粮食供应，影响了农业生产，经济损失预计超过120亿 4-5。大麦是禾本科耐盐作物的代表之一，且资源分布与适应性广6。因此，研究大麦的耐盐性与水稻的盐敏感性可为揭示植物耐盐机理提供重要的参考和指导；对大麦耐盐相关基因组的研究及其与水稻的同源基因比较，将对克隆耐盐基因与培育耐盐水稻新品种提供重要的理论依据和技术支持。2. 研究背景综述 大麦的耐盐机理 大麦适应性广，耐盐性强，其野生抗逆种质资源丰富大麦作为一种耐盐作物 1。近年来，一些研究者对青藏高原一年生野生大麦开展了遗传多态性分析和干旱、酸铝及盐害等非生物胁迫耐性鉴定和优异种质的发掘，发现青藏高原一年生野生大麦具有丰富

4、的遗传多态性和耐非生物胁迫的遗传变异 2,4。浙江大学大麦课题组从西藏野生大麦材料中鉴定到耐盐性具有明显差异的种质资源，如XZ16、XZ26、XZ169等，其中XZ26具有优异的耐盐性 3,23。 普遍认为，渗透胁迫、离子毒害和次生胁迫是盐胁迫对植物造成危害的主要机制 1,2。如一些植物受盐胁迫时，Cl-的毒害作用往往表现在抑制植物的光合作用 6，而细胞中过多的Na+积累将导致离子失衡并产生特异性损伤。目前，渗透调节、离子平衡和抗氧化作用被认为是植物的主要耐盐机制 29。如植物在胁迫下产生大量的活性氧自由基（ROS），造成一系列次生胁迫，植物通过体内的抗氧化系统清除掉一部分的ROS，转基因植物

5、实验研究中，过量表达抗氧化酶相关基因可增强转化植株对渗透和氧化胁迫的耐性 9。大麦耐盐机制涉及到多种生理途径与调节 2，最主要的是离子转运平衡，包括渗透调节的改善、根部Na+的摄入与Na+回流根际土壤的调节、木质部离子运输的调控、细胞中K+、Na+的置换与保留、细胞内Na+的区隔以及对氧化胁迫的耐受等 31。总体而言可被分为以下几方面：（1）Na+排出机制；（2）K+保留；（3）氧化胁迫耐性；（4）渗透调节 27,31。阐明各个机制的作用原理及其在大麦耐盐性上的相对作用，对于指导大麦及其它作物的耐盐性研究无疑具有重要的意义。 大麦与水稻的耐盐性比较 相比较而言，大麦与水稻大约在5000万到1亿

6、年发生分化，具有相当悠久的历史，但在其基因组的构成乃至RNA修饰、蛋白结构乃至功能上仍然具有较高的相似性。基因若不受功能约束，其表达形式很容易变化，长久以来使萌发调节规律得以保持的水稻、大麦基因，表达序列与形式较恒定，在萌发中具有功能显着性和等效性，有较高的研究价值 23。此外，大麦中还存在特有的保守基因序列。鉴于大麦具有较强的耐盐性，而这从根本上又是由基因进行调控的，因而将耐盐性的差异划归为基因组的比较也是十分必要的。水稻栽培种的耐盐性普遍低于大麦，以水稻在盐处理下的生长状况作为参考指标，研究表明水稻幼苗期对盐碱较敏感，同一品种在发芽期和幼苗期的耐盐性存在一定差异，整个营养生长阶段，水稻耐盐

7、性逐渐增强 5。此外，相关研究 17指出在盐碱胁迫下，水稻成熟期的株高和秆长不能很好地反映品种间耐盐性强弱，最佳取样期在分蘖期结束前，而单株分蘖数等是衡量水稻耐盐碱强弱的良好指标 4。相关研究表明，在检测到的大麦、水稻结构与功能基因中，同源数量达到57661个，大麦特有基因为4650个，即在漫长进化史中，大麦分化出少部分具有特异性的基因 2。而水稻与大麦在同源基因的蛋白质序列和表达形式上具有很高的相似性 23。基于同源基因组和大麦特异基因组的研究价值，分析特有基因在表达过程中的调控机理，比较同源基因调控差异，从中找出耐盐相关基因的可能性较高。这些基因组的分析以及文库制备等也能够成为耐盐水稻开发

8、的一项技术储备。 转录组及其测序技术（RNA-Seq） 转录组是特定细胞或组织在特定时间或状态下转录出来的所有RNA的集合。通过对转录组的研究可以揭示生物体的基因表达、研究结构变异及发现新基因等。转录组分析的研究方法、研究平台发生着日新月异的变化，同时生物信息学分析的内容也在逐渐完善。分子生物学技术的快速发展极大地提高了人们对转录组（Transcriptome）的分析能力，特别是随着高通量测序技术的发展，RNA-Seq分析已经逐渐成为一种常用的实验手段 7。作为一种新的转录组研究手段，RNA-Seq利用新一代测序技术能够更为快速、准确地为人们提供更多的生物体转录信息，并在生物信息学分析等相关领

9、域得以不断应用 10。3.材料与方法实验材料本实验所用的水稻和大麦分别选取日本晴和西藏野生大麦XZ26作为实验材料。各取200粒左右具有活性的休眠种子。 植株处理与取样 种子萌发 水稻种子发芽：取2个500mL的锥形瓶用去离子水洗净，各加入200mL蒸馏水，供试的的日本晴种子分别放入锥形瓶中，并标记名称，放入培养箱25饱和湿度进行暗室培养，每隔8小时换水一次，并注意轻摇混匀。48 h后，用同温去离子水冲洗一次，取2个发芽盒，标记水洗后，垫上3层用蒸馏水浸润的发芽纸，将种子均匀摆在发芽纸上，加蒸馏水至浸没。再另用滤纸加水浸湿，覆盖在发芽盒底部，发芽盒置于25培养箱中。恒温箱暗培养3 d，出芽后补

10、光培养。 大麦种子发芽：水稻种子播种7 d后进行大麦种子发芽。供试的XZ26种子用3% H2O2表面灭菌处理20 min，用去离子水冲洗4次后在发芽盒中发芽，播种方法同水稻种子。发芽盒放置在25的生长室中暗培养3 d，出芽后补光培养。 苗期盐胁迫处理大麦发芽9天后，将水稻和大麦幼苗各自移栽到6个盛有营养液的6*8孔塑料黑箱（15 L）中进行水培，水稻、大麦各分为2个处理组与1个实验组。每处理（箱）各设置4 6 = 24个重复，每个重复取2粒发芽状况良好的种子在海绵固定下种1个孔。大麦的水培箱用气泵连续充气。所有处理在温室中培养，培养条件为光照14 h，黑暗10 h，昼夜温度设置为22/18，营

11、养液pH控制在左右。定期更换营养液，配方如表1，其中大麦使用的营养液编号H1到H6，水稻使用的营养液编号R1到R3及H1到H3 2。元素种类营养液编号化学成分浓度（g/L）每10L营养液用量（mL）大量元素（大麦）H1KNO310110Ca（NO3）24H2O236H2MgSO47H2O2464H3NH4H2PO41152微量元素H4H3BO31MnCl2（NH4）6Mo7O24ZnSO4H5CuSO45H2OH6Fe（）-EDTA大量元素（水稻）R1KH2PO45R2（NH4）2SO4R3表1 水稻与大麦营养液配方水培8 d起进行盐胁迫处理，每个基因型的3组处理分别将营养液中NaCl的浓度设

12、定为0 mM（对照）、100 mM（处理）、150 mM（处理）；所有营养液每3 d更换一次，加缓冲液以控制pH在左右，实验组开始时NaCl浓度每次换营养液增加50mM，直到达到目标浓度，使植株逐渐去适应高盐环境。 取样方法盐处理7 d（播种第33d）后对材料进行取样，取样品种为XZ26、日本晴，浓度为0mM、100mM，共4组处理。每组处理各收取生长状况最好的6个重复，每个重复分别剪取地上和地下共2部分，各自作为1个样本。地下部的根用自来水冲洗3 次，连续冲洗1 min，洗去吸附在根表面的离子，地上部剪去除生长状况不佳的老叶片。取样时就将6个重复先后分2批收取，每批随机3个重复。第一批样品，

13、编号地上部S1-S12，地下部R1-R12，在80下烘干72 h称干物重，烘干后称重。烘干后的样品用于短期盐处理的金属元素含量测定。第二批样品同为3个样本，编号地上部S1-S12，地下部R1-R12，立即放于液氮冷冻烘干，-80保存备用于代谢含量测定（RNA-seq）2,31。元素含量测定 取样后，将地上部和地下部的第一批烘干后样品，研碎后称取重量。将样本加入试管，冷却后再加入10 ml HNO3:H2O（1:1），用试管加热器以160消煮约2h，直至消煮液只剩试管半球部分。用滤纸过滤，收集提取液并定容至20mL，保存于试管并标记。各样本Na、K、Ca、Mg、Cu、Fe、Mn和Zn离子含量用电

14、感耦合等离子体发射光谱仪ICP-OES（iCAP 6000型号，美国赛默飞世尔科技公司）测定。 RNA提取与RNA-Seq分析 总RNA 提取 将第二批样品送样，每组取液氮冷却后的样本约，其中地上部取第三完全展开叶，采用QIAGEN的RNeasy Plant Mini Kit（50）试剂盒提取总RNA，于-80冷库备用。 mRNA分离和纯化通过两次纯化，使用结合有poly-T寡核苷酸的磁珠从总RNA中分离纯化出含有poly-A的mRNA 。步骤如下：确保总RNA起始量有1ug-5ug，加Nuclease free Water补齐到50ul；取15ul NEBNext Oligo d（T）25

15、beads到另一个新的PCR管中；取100ul 2X RNA Binding Buffer洗磁珠两次；往磁珠中加入50ul 2X RNA Binding Buffer和第一步中50ul RNA，吸打混匀；放入PCR仪，65 5min；当PCR仪的温度达到4时，就拿出PCR管，室温放置5min，使mRNA充分绑定到磁珠上；将PCR管放到磁珠板上2min，使已绑定到磁珠上的mRNA分离出来；吸走上清液，加入200ul Wash Buffer 洗掉未绑定的RNA；置于磁珠板上2min，吸走上清液，再洗一次；往磁珠中加入50ul Elution buffer ，吸打混匀；放入到PCR仪中，80 2mi

16、n，25保存；当PCR仪温度达到25，立即拿出PCR管，往PCR管中加入50ul RNA Binding Buffer，吸打混匀；室温放置5min，使mRNA充分绑定到磁珠上；按以上步骤加200ul Wash Buffer洗两次；往磁珠中加入10ul Nuclease free Water混匀，置于PCR管中80 2min；立即将PCR管放到磁珠板上分离，等液体变澄清后，吸出到新的PCR管中，即为mRNA。 mRNA热打断 加入纯化后的的 mRNA、2ul First Strand Synthesis Reaction Buffer、 Random Primers， 混匀后放到PCR仪中，94

17、 11min，时间一到立即拿出置于冰上。 mRNA反转录往上一步结束的反应中加入 Murine RNase Inhibitor、 ProtoScript II Reverse Transcriptase，混匀后按以下程序进行反应合成第一条cDNA链： 25 10min 42 15min 70 15min 4 hold 往合成的第一条连中加入24ul Nuclease free water、4ul Second Strand Synthesis Reaction Buffer、2ul Second Strand Synthesis Enzyme Mix放到PCR仪中，16 1h ，热盖温度40

18、cDNA纯化（1）往上述结束的 ds cDNA中加入72ul AMPure XP beads（2）吸打混匀，室温放置5min（3）放置于磁珠板上，等液体变澄清（大约5min），小心吸除上清（4）往PCR管中加入200ul 80%的酒精，洗30s，吸除上清，洗两次（6）往已晾干的磁珠中加入30ul的Nuclease free Water，吸打混匀磁珠（7）将PCR管放到磁珠板上分离（8）等液体变澄清后，吸出到新的PCR管中 末端修复 通过切除或者补平3和5突出端，得到平末端。对5端磷酸化后，再对3 端加A，使其能与下一步含有T的Adapter互补连接 加入 NEBNext End Prep En

19、zyme Mix、 NEBNext End Repair Reaction Buffer （10x）、纯化后 ds cDNA，混匀后将PCR管放入PCR仪中，按以下程序运行： 20 30min 65 30min 保存于4 接头连接 在双链cDNA 片段上加上Adapter，使其能杂交到flow cell上 往末端修复结束的PCR管中加入 Blunt/TA Ligase Master Mix、 Diluted NEBNext Adaptor、 Nuclease free water，混匀后将PCR管放于PCR仪中，设置为20 15min，时间到立即加入 USER enzyme，混匀后放置于PCR

20、仪中，设置为37 15min。 磁珠筛选 用 AMPure XP beads 抓取600bp以上的DNA片段，再用的浓度对600bp以下的DNA片段进行300bp以上片段的抓取，筛选出300-600bp的范围富集PCR，步骤如下：（1）往接头连接结束的PCR管中加入 Nuclease free Water ，补齐到45ul（2）加入27ulAMPure XP beads，吸打混匀，室温放置5min（3）放置于磁珠板上，等液体变澄清（大约5min），吸取上清到新的PCR管中（4）再次加入9ul AMPure XP beads，吸打混匀，室温放置5min（5）放置于磁珠板上，等液体变澄清（大约5m

21、in），吸除上清（6）往PCR管中加入200ul 80%的酒精，洗30s，吸除上清，洗两次（7）将PCR管放置于磁珠板上，打开盖子晾干，使其完全龟裂（大约5min）（8）往已晾干的磁珠中加入13ul的Nuclease free Water，吸打混匀磁珠（9）将PCR管放到磁珠板上分离（10）等液体变澄清后，吸出到新的PCR管中 PCR富集 PCR选择性的富集两端含有接头的DNA片段，放大 cDNA文库。向文库中引入检索引物以用于多样本测序。加入筛选后的DNA片段 、 NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix、 Index（X）Primer、 Univers

22、al PCR Primer，混匀放入PCR仪中，按以下程序进行： 预变性 98 30s 1个循环 变性 98 10s 退火 65 30s 15个循环 延伸 72 30s 终延伸 72 5min 1个循环 保存 4 胶回收纯化 用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，切取350-450bp之间的片段，用QIAGEN胶回收试剂盒进行回收，剩余2ul用Qubit测RNA浓度。 文库接头效率测定 使用Aglient Technologies 2100 Bioanalyzer仪器对每个文库进行条带大小的确定，然后再用KAPA的文库定量试剂盒进行文库接头效率的测定，以确保数据的准确性。 数据分析 采用Excel（Mi

23、crosoft Office Excel 2013）进行相对干物重的计算，先用 t检验去除偏差值较大的样本组数，剩余数据求平均值。对2个品种的实验组、对照组的各个元素含量的数据进行处理。按元素分类，计算均值、标准差，绘制图表。采用Blast2go 软件对RNA-seq检测到的各品种地上部、根部及根部的mRNA序列文库进行检索及注释。计算表达上调或下调倍数（Fold change）。X1X3是实验组三个重复的表达量，日本晴：S1S3，R1R3，XZ26：S7S9，R7R9Y1Y3是实验组三个重复的表达量，日本晴：S4S6，R4R6，XZ26：S10S12，R10R12筛选出FDR，相对表达Fol

24、d Change2或的差异表达基因（mRNA序列），将同一基因表达出的转录组进行归纳，合并为单个基因，列出各品种各部位差异基因表。从差异基因表中选出水稻和大麦中具有高度序列相似性的共同表达基因，再从中选出在一对多或多对一中评估成绩较高的基因，列出共同差异基因表，以待进一步比较分析。4. 结果与分析 大麦和水稻耐盐性比较图1 三种盐浓度处理下大麦与水稻表现型的差异如图1，与对照组相比，在100和150 mM 浓度的NaCl 处理条件下，大麦组、水稻组的生长情况均受到一定影响。图1为在盐处理7d取样时，各组的生长形态。对照组水稻生长状况良好，叶片正常呈现绿色、挺直；对照组大麦的生长状况良好，叶片宽

25、大茂密，但基部老叶倒伏较严重，部分叶片有发黄，这与预期有所不符。在盐浓度100mM下，大麦总体长势与对照组相比变化不大，叶片疏密适宜，呈绿色，叶宽减小；而水稻组则开始呈现一定影响，主要表现在新叶生长速率减缓，老叶开始发黄，根系生长减缓，部分叶片叶尖下垂。150mM NaCl 处理下，大麦生长受到一定影响，但并不明显，仅生长速率稍减缓；与之相对，水稻所有品种的生长均受到严重影响，从株高来看，生长速率缓慢，部分植株基本停止生长，接近死亡，叶片窄小、蜷缩萎蔫。 以XZ26和日本晴分别作为大麦、水稻的代表品种，第一次取样所测得干物重结果如表2。可见去除水分后与对照相比，XZ26和日本晴在100mM下干物重呈基本不变或减小趋势，由相对干物重可见变化幅度不大，大约在至之间，日本晴根部及XZ26地上部干物重对盐处理较为敏感。就整珠而言，高浓度盐含量时，XZ26的相对干物重随浓度增加减少更明显。表2 盐处理前后大麦与水稻根和地上部干物重比较编号“S”为地上部，“R”为根部，干物重为差异显着性分析