基因抗体05Word文档下载推荐.docx

1、轻链的种类有两种，即和。在同一Ig分子中，两条轻链是同型（isotype）的。重链的种类有5种，即、和。根据重链的种类不同，可将免疫球蛋白分子分为5类：IgM（链）、IgD（链）、IgG（链）、IgE（链）和IgA（链）。相同的两条重链轻链间二硫键（disulfide）连接呈“Y”型。相同的两条轻链也分别由链间的二硫键与“Y”型重链的双臂相连。2、免疫球蛋白分子的区域结构V（variable region, V）区C（constant region, C）区 绞链区（hinge region）Fv区：轻链和重链的可变区相互作用形成Fv，为抗原结合部位。可变区因氨基酸序列较多变异而得名。但事实上

2、氨基酸序列的变异并非随机均匀地分布在整个可变区，而是集中在几个较小的区域被成为高变区或超变区（hypervariable region），在一个完整的Ig分子内，L链的3个超变区和H链的3个超变区共同形成一个三维空间的抗原面。由于超变区在结构上与抗原互补，因此也称互补决定区（complementarity determining region, CDR）。在立体构象中，它们位于Fv的末端，直接参与抗体与抗原的结合。3、免疫球蛋白分子的空间构象 图1 人Ig轻链多肽折叠示意图从图1 可以看出，免疫球蛋白分子的空间构象是由组成Ig分子的多肽链折叠而成的。图中白色箭头表示-折叠结构内的多肽排列，黑色

3、条带表示链内二硫键，数字表示从N端起的氨基酸的位置。浅黑色条带表示V区CDR1、CDR2和CDR3环，它们一起形成轻链的抗原结构。轻链折叠成VL和CL两个Ig区，即免疫球蛋白折叠（IG fold）或抗体折叠。每个Ig区肽链长度为原来的1/2，各含110个氨基酸。Ig区为二层反向平行多肽组成的-折叠片层结构。其中一层含有三条反向平行肽链，另一层则由四条反向平行的肽链组成。两个-折叠片层间通过二硫键相连。V区的折叠主要决定于各CDR之间框架区内氨基酸序列的保守性。如V区序列中含有的约90个氨基酸构成的内二硫环（internal disulfide loop）。V区折叠之后，CDRS则突出于N端表面

4、形成抗原结合部位。轻链C区的羧基端也形成一个Ig区。三、抗体的功能1、与抗原特异性结合2、激活补体3、Fc受体介导的效应功能第二节 免疫球蛋白的基因结构一、免疫球蛋白基因的染色体定位所研究过的物种中，它们的胚系Ig基因基本相同。编码Ig分子的Ig、Ig和IgH基因为三个不连锁的基因，分别定位于不同的染色体上。目前已知，人的上述三个基因座分别定位于第2、22和14号染色体上；小鼠的则分别定位于第6、16和12号染色体上。Ig轻链和重链基因座分别由编码V区和C区的一些基因组成，各基因分别被非编码DNA序列隔开。二、免疫球蛋白基因结构和重排1、重链基因结构和重排（1）V区基因H链V区基因由V、D、J

5、三种片段经重排后组成。人的VH基因片段100个，小鼠的为2501000个。L1为转录起始信号。VH编码V区N端的98个氨基酸残基，CDR1和CDR2也包括在内。D和J基因片段位于V、C基因片段之间，长度共3050bp。D基因只存在于H链，L链则无。小鼠的DH为12个片段，人的则多于20个。小鼠的JH有4个片段，人的有9个，其中6个为功能性基因，3个为伪基因。DH和JH共同编码V区的羧基端和CDR3。H链V基因座有100200个基因片段，共同组成多基因家族。每个家族成员有70%80%的核苷酸序列是相同的。人类有6个VH基因家族，每一家族有260个成员。（2）C区基因H链C区基因位于3端，呈串联排

6、列，每一基因由34个长度相同的外显子组成。人H链C区基因共有9个，另外还有两个假基因C2和C。 从5端到3端的排列顺序为C-C-C3-C1-C2-C1-C-C2-C4-C1-C2。小鼠C区基因片段为C-C-C3-C1- C2b-C2a-C-C。2、轻链基因结构和重排L链可变区基因片段重排发生在IgH链基因重排之后，其间，链基因先发生重排。如果基因为无效重排，之后便引起基因的重排。V或V基因片段编码L链的CDR1、CDR2和CDR3的大部分。J或J基因片段编码CDR3的其余部分和第四骨架区。V编码95个氨基酸残基，J编码从96位至108位氨基酸。L链不含D基因片段（1）链基因结构和重排基因是由V

7、、J和C3个基因片段经重排后组成的。V与C之间的重排为随机方式。人V基因片段约有100个，J基因片段有5个，C仅为一个。小鼠V基因片段约为250个，J5个（其中4个为功能基因），C也仅有1个。（2）链基因结构和重排链基因同样有V、J和C3个基因片段经重排后组成。人链基因重排的确切情况至今还不清楚，但已知其V约有100个，C的数目至少有6个，每个C与各自的J基因片段相连。小鼠链的基因重排比较复杂。V基因片段有3个（V1、V2、VX），J和C各有4个基因片段，可分为两组。即，J2C2、J4C4、和J3C3、J1C1。第三节 单克隆抗体1975年Milstein和khler首次成功地将绵羊红细胞免疫

8、的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过筛选、克隆化培养等步骤，制备出小鼠抗绵羊红细胞单克隆抗体。这一技术的问世，在医学生物学领域产生了重大的影响。一、单克隆抗体制备的基本原理致敏的B淋巴细胞能分泌特异性抗体，但这些细胞不能在体外存活。骨髓瘤细胞可在体外大量繁殖，但不能分泌特异性的抗体，若将小鼠的骨髓瘤细胞与这些能够分泌某种抗体的B淋巴细胞融合，则融合的杂交瘤细胞既具有肿瘤细胞易繁殖的特性，又具有B淋巴细胞能分泌特异性抗体的能力。由于每个致敏的B淋巴细胞只针对单一的抗原决定簇产生抗体，所以克隆化的杂交瘤细胞能够分泌针对单一抗原决定簇的单克隆抗体，这就是单克隆抗体制备的基本原理。二、小鼠小鼠B淋巴

9、细胞杂交瘤小鼠小鼠B淋巴细胞杂交瘤技术是应用最广泛的杂交瘤技术，其优点在于：小鼠骨髓瘤细胞比较稳定，容易获得，容易培养；使用小鼠作为免疫动物所需抗原量较少，操作简便，并容易获得好的免疫效果；融合成功的杂交瘤细胞属于同种属杂交细胞，传代较稳定，不容易发生变异。这一技术不足之处在于：鼠源的单克隆抗体不能直接用于临床治疗，目前只限于基础研究及体外诊断试剂。1、小鼠骨髓瘤细胞（1）稳定，易培养；（2）自身不分泌免疫球蛋白；（3）融合率高；（4）是HGPRT缺陷株。2、免疫B淋巴细胞 （1）免疫动物：用目的抗原刺激机体，使机体产生致敏的B淋巴细胞，免疫成功的标志是在融合时脾脏能提供大量处于增殖状态的特异

10、性B淋巴细胞。（2）免疫效果检测：免疫23次后，可从眼眶取血检测血清效价。3、细胞融合（1）收集骨髓瘤细胞（2）收集B淋巴细胞（3）细胞融合：聚乙二醇（polythylene glycol）4、融合细胞的接种与选择培养5、杂交瘤细胞的检测6、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养7、单克隆抗体性质的鉴定8、单克隆抗体的生产9、单克隆抗体的提纯三、人人B淋巴细胞杂交瘤研究与制备单克隆抗体的主要目的之一是应用单克隆抗体治疗人类疾病。因此，人单克隆抗体比鼠单克隆抗体优越。人单克隆抗体的制备可以采用人人B淋巴细胞杂交瘤技术，也可采用人小鼠B淋巴细胞杂交瘤技术，还可以采用EB病毒转化结合细胞克隆技术。1、人骨髓瘤细

11、胞株和B淋巴母细胞瘤株2、人免疫B淋巴母细胞的制备4、人单克隆抗体的产生人人B淋巴细胞杂交瘤技术从理论上说是制备人单克隆抗体最理想的办法，但难度较大。主要困难在于：缺乏好的亲本骨髓瘤细胞株； 难于获得大量的抗原特异性人B淋巴细胞； 人单克隆抗体的大量生产问题四、人小鼠B淋巴细胞杂交瘤 早期制备人抗克隆抗体采用的是人-小鼠杂交瘤技术，即用人的免疫B淋巴细胞与小鼠的骨髓瘤细胞融合。采用这一技术的优点是小鼠骨髓瘤细胞比较好，融合率高，相应的后继工作完善。但这一方法有一个致命的缺点，即种属间杂交后代不稳定，杂交瘤传代后，很快丢失人的染色体，丧失分泌抗体的能力。最近几年一些新的医学生物学技术被引入人单克

12、隆抗体的制备。这些新技术大致有两类：一是利用转基因小鼠或某些新品系小鼠如SCID小鼠（severe combined immuno- deficient disease）来制备人单克隆抗体；二是制备各种基因工程抗体。第一种途径是希望通过转基因小鼠或某些新品系小鼠进行各种抗原免疫，在小鼠体内产生人的免疫B淋巴细胞，在通过经典的小鼠-小鼠杂交瘤技术制备出能分泌人单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株。SCID小鼠是CD-17纯系小鼠16号染色体上的基因发生了突变，破坏了免疫球蛋白基因和T细胞受体基因的重排，从而导致缺乏成熟的功能性T和B淋巴细胞所形成的联合免疫缺陷症。这种缺陷决定了它可以接受人体器官和组织转

13、移物，形成人-鼠嵌合体，即hu-SCID小鼠。转基因鼠是将人的胚系免疫球蛋白基因插入小鼠受精卵染色体中，使小鼠具备产生人抗体的能力，并传给子代。这一技术的难点在于如何使目的基因（人抗体重链和轻链基因）在小鼠体内正确表达。这一技术的有效应用有赖于转基因动物技术的提高与发展。第二条途径是希望通过基因工程手段，改造鼠单克隆抗体或重建人单克隆抗体。基因工程抗体在下一节详细介绍。第四节 基因工程抗体血清多克隆抗体、杂交瘤单克隆抗体技术以及DNA重组技术的发展，促进了基因工程抗体技术的产生，从而使抗体的研制进入了第三阶段，研究也从细胞水平进入到分子水平。基因工程抗体是指利用DNA重组技术和蛋白质工程技术对

14、编码抗体分子基因按不同需要进行加工改造和重新装配，再转染到合适的受体细胞所表达的抗体分子。基因工程抗体技术，包括人鼠嵌合抗体 （chimeric antibody）、人改型抗体（reshaped human antibody）、双特异性抗体（bispecific antibody）、小分子抗体及抗体融合蛋白等基因水平改造的单克隆抗体技术及近年来发展起来的抗体库技术。基因工程抗体可以对抗体的单区抗体（H链V区肽链）、最小识别单位（CDR3）、Fv、Fab，甚至对完整的抗体分子进行改造，大大降低了鼠单克隆抗体的异源性，同时还可以根据需要在抗体分子上连接治疗或诊断运用的药物及其他分子，使单克隆抗体在

15、临床治疗中具有广阔的应用前景。构建的抗体基因载体可以在B淋巴细胞系或其他哺乳动物细胞系（如COS细胞）、大肠杆菌、昆虫细胞及植物等表达体系中表达，还可以设计为细胞内表达（intrabody）或分泌表达。一、抗体基因库的构建和基因筛选的表面呈现技术外源性段基因片克隆到丝状噬菌体的基因组DNA中，与噬菌体基因III（g3）连接，外源性因基蛋白与基因III融合蛋白呈现在噬菌体表面，外源蛋白保持了原来的构象。立体构象这一技术方法为构建抗体基因库、cDNA文库和突变基因文库，筛选目的基因提供了快速高效的手段，标志着基因工程抗体发展的质的飞跃。1、丝状噬菌体的生物学 丝状噬菌体（filamentous p

16、hage）包括M13、f1、fd等突变体，是一种长丝状病毒颗粒，直径为6.5nm。其基因组是一个单链环状DNA，编码10种蛋白质，其中gp3、gp6、gp7、gp8和gp9 5种蛋白质组成外壳蛋白，基因VIII（gp8）是噬菌体颗粒的主要结构蛋白，由大约700个形态亚单位围绕病毒基因组呈管状蛋白外壳，其余4种外壳蛋白分别由基因III、VI、VII、IX编码，各有5个拷贝，均参与噬菌体的组装。在噬菌体的一端还含有数拷贝的次要衣壳蛋白（gp3）。2、噬菌体呈现中噬菌体外壳蛋白的应用 在基因III 蛋白和基因VIII蛋白未端插入外源蛋白，表达的融合蛋白可呈现在噬菌体表面，不影响噬菌体的功能，因而gp

17、3和gp8被应用于噬菌体展示（phage display）。基因VIII蛋白在噬菌体颗粒外壳上有2700个拷贝，N-端15个氨基酸暴露于噬菌体表面，可插入外源蛋白，但外源肽段多于十肽时会影响蛋白VIII的功能。基因III蛋白在噬菌体颗粒外壳上有3-5个拷贝，将外源基因紧靠基因III上游，在噬菌体表面表达融合蛋白，不影响噬菌体的功能（图2）。接头DNAVLVH VL V VL 图2 噬菌体表面呈现的小分子抗体3、噬菌体抗体文库 利用噬菌体表面呈现技术，将抗体分子片段基因与外壳蛋白基因（基因III或基因VIII）连接，构建表达性基因文库，即为噬菌体抗体展示文库（phage antibody dis

18、play repertoire）。经筛选可获得特异性抗体基因。（1）噬菌体抗体的构建：抗体Fab和ScFv均可在噬菌体中表达，并呈现在噬菌体表面。在Fab表达呈现时，可将L链基因和Fd段基因构建于一个载体上，转染大肠杆菌。Fd段或L链基因与噬菌体外壳蛋白基因（基因III或基因VIII）相连，融合蛋白锚定在细菌细胞内膜上，与另一条链（游离状态）结合可形成抗原结合特异性的抗体。在ScFv表达时，利用PCR技术和DNA接头（linker），可将L链和H链的V区基因随机重组在一起，再克隆到载体中去表达ScFv抗体分子片段（ScFv基因与基因III或VIII连接），并呈现在噬菌体表面利于筛选。将特异性抗

19、原固相化，用文库的噬菌体与其反应，经过洗涤、洗脱、收获和纯化表达特异性抗体的噬菌体。（2）噬菌体抗体的表达载体：用于噬菌体抗体表达的载体包括噬菌体载体和噬粒（phagemid）。将抗体片段基因与野生型噬菌体基因III的5端连接，可表达与蛋白III N端融合的抗体片段分子，呈现在噬菌体的表面。噬粒是含噬菌体基因间隔区（）的质粒载体，本身不含噬菌体蛋白编码基因，在导入大肠杆菌后不产生子代噬菌体。当用辅助噬菌体感染时，辅助噬菌体编码的噬菌体蛋白，可将单链噬粒DNA包装成噬菌体病毒颗粒释放出来，其外壳蛋白呈现抗体分子片段，同时含有gp3和gp8，并能再次感染大肠杆菌而繁殖。噬粒具有质粒特性，带有抗药性

20、基因和复制起点，便于筛选含目的片段的克隆和在大肠杆菌内的扩增。（3）噬菌体抗体分子的亲和力成熟：如同模拟体内B 细胞经抗原多次刺激后产生的抗体亲和力增加一样，由于抗体基因库的容量大，基因的随机组合及CDR区的碱基突变（可采取PCR错配、随机突变等），可获取高亲和力的抗体基因片段。（4）抗体分子基因片段的可溶性表达：在噬菌体抗体呈现中，抗体分子片段在融合蛋白的N端呈游离状态，可正确的折叠，形成具有功能的蛋白分子。如果抗体片段基因和外壳蛋白基因（III或VIII）间放置amber终止密码子（TAG），则在不带琥珀抑制基因（amber suppressor）的宿主菌中，TAG为终止密码子，合成的抗体

21、分子蛋白多肽穿过细胞内膜，以可溶蛋白的形式分泌表达；而在带有琥珀抑制基因的宿主菌中，合成的抗体分子多肽以融合蛋白的形式锚定在细菌膜上。二、基因工程抗体 1、基因工程抗体常规技术 抗体基因可用适当的探针从抗体细胞基因组文库中获得，也可以从分泌抗体的细胞中分离mRNA，用RT-PCR方法获得。用已知基因的片段或寡核苷酸片段作为探针，从分泌特异性抗体的杂交瘤细胞基因文库中分离DNA（含VDJ重排基因），筛选出V区基因。通过DNA印迹（Southern blotting）区分重排和未发生重排的克隆，所获得的基因含有转录调控元件及mRNA加工信号，易于在真核表达系统中表达。最常用的是PCR扩增方法。从杂

22、交瘤细胞中分离mRNA，反转录为cDNA库。在抗体基因中保守的第一骨架区序列/前导序列和J基因区段/C区序列设计引物进行PCR扩增。2、抗体的改型（1）抗体的人源化：随着对抗体结构和功能的关系的足够认识，另一个挑战是如何改造鼠单克隆抗体适当的基因，综合人鼠单克隆抗体的优点，获取特异性高、异源性小的具有临床应用价值的抗体。相对人杂交瘤系统，鼠杂交瘤生长快，产生的抗体量大。然而鼠单克隆抗体用于人体，因其免疫原性和相对缺乏C区依赖的功能效应，它的应用受到了一定的限制，对鼠单克隆抗体进行基因工程改造是十分必要的。1）鼠单克隆抗体C区的人源化：抗体分子与大抗原结合特异性由L链和H链V区决定，抗体C区可作

23、为异源蛋白诱发免疫反应，产生抗小鼠抗体（human anti-mouse antibody, HAMA）。将小鼠单克隆抗体C区用人抗体C区代替而拼接成嵌合抗体（chimeric antibody）， 它既具有抗原结合特异性，又极大地降低了鼠单克隆抗体的异源性。人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略主要包括：（1）从鼠杂交瘤中克隆V区基因。（2）选择合适的人C区基因。（3）构建载体并在一定表达系统中表达（图3）根据嵌合抗体H链和L链基因是否克隆、表达与同一载体与否，可将基因工程嵌合抗体的表达分为共转染表达模式（co-transfection model）和单载体转染表达模式（single vector

24、transfection model）。V区基因的克隆：从鼠杂交瘤抗体分泌细胞中提取mRNA， 经PT-PCR扩增某一类别的所有抗体V区基因，并插入适当的表达载体中，用特异性抗原从克隆文库中选出特异的V区基因；也可以用探针的方法钓取基因组DNA。鼠VH鼠VL人CL人CH 图3 共同转染模式嵌合抗体C区基因类别的选择：在体内免疫系统中，抗体的Fc段和效应细胞相互作用，发挥特异的生物学功能。因为不同的免疫求蛋白类别的Fc受体结合能力和激活补体的能力是不同的，如选择IgG嵌合抗体可用于ADCC或激活补体，IgG2/IgG可用来激活或阻断某一种受体，IgE可介导炎症反应等。C区基因比较保守，易于获得和

25、构建。嵌合抗体的表达：由于抗体分子需经正确的糖基化和V区正确的折叠、链内二硫键形成，以及H链和L链相互作用形成正确的立体构象，因此常用哺乳类细胞表达嵌合抗体，结合相应的选择标志，表达目的基因。2）人改型抗体（CDR移植）鼠单克隆抗体V区的人源化：尽管嵌合抗体Fc段换成了人源化，但V区保留的鼠源性保守序列仍能诱发HAMA，因此嵌合抗体不能彻底地消除鼠免疫原性，还需进一步对鼠源抗体的V区进行改造。抗体V区由CDR和骨架区组成。CDR是抗体识别和结合抗原的区域，直接决定了抗体的特异性，而骨架区序列及其立体结构较为保守，是嵌合抗体诱发HAMA的主要原因，因此将鼠单克隆抗体CDR移植到人单克隆抗体的V区

26、框架上，使人单克隆抗体获得鼠单克隆抗体结合特异性，并减少异源性。然而简单地移植CDR序列到人的抗体中很难恢复抗体的特异性和有效性，甚至完全丧失亲和力，因此解决骨架区对CDR的影响，对CDR序列和框架结构进行分析和加工是十分重要的。V区CDR移植的设计原则是：（1）以Kabat的方法为基础选择顶端环状结构序列和紧邻CDR两侧的骨架序列：（2）对骨架区中影响抗原结合部位的氨基酸残基改为亲本鼠单克隆抗体的残基；（3）对抗体V区氨基酸序列数据库分析，选择与亲本鼠单克隆抗体同源性高的序列；（4）保留V区N末端氨基酸序列，尤其是L链V区N末端序列。将人改型V区基因与人Ig C区基因连接，构成完整的人免疫球

27、蛋白基因即可进行表达（图4） CDR序列 CDR序列鼠单克隆抗体 人抗体人源化抗体（该型抗体）图4 鼠单克隆V区人源化（CDR移植）（2） 抗体的小分子化：能与抗原结合的抗体小分子Fv片段称为小分子抗体，包括Fab、Fv及单链抗体（Sc Fv）、双特异性抗体、单区抗体（H链V区单链）等。1） Fab抗体：Fab片段由H链Fd段和完整L链通过二硫键形成的异二聚体，仅含一个抗原结合位点。用木瓜水解酶消化抗体可获得2个Fab片段。在Fab基因表达时，5端带上细菌蛋白信号肽基因的Fd基因和L链基因，可在大肠杆菌细胞壁的周质腔内分泌型表达，形成完整的立体折叠和链内、链间二硫键，保持Fab片段的功能。Fd

28、基因片段和L链基因可以分别构建在2个载体上，然后共转染细胞，也可以构建在一个载体上转染细胞进行表达（图5）。2）Fv抗体：Fv是由L链和H链V区组成的单价小分子，是与抗原结合的最小功能片段。在Fv的基因工程技术中，可以分别构建含VH和VL基因的载体，共转染细胞，使之各自表达后组装成功能性Fv分子；或者载体中的VH和VL之间设置终止码，分别表达2个小分子片段（图6）。H链和L链的V区可由非共价键结合在一起形成Fv，并能保持特异结合抗原的能力。 图5 Fab 抗体分子的制备3）单链抗体：用适当的寡核苷酸接头将L链和H链的V区连接起来，使之形成单一的多肽链，称为单链抗体（single chain F

29、v, ScFv）。多肽链能自发折叠成天然构象，保持Fv的特异性和亲和力，它的稳定性大大提高了。ScFv中连接DNA（linker DNA）的设计原则是DNA接头编码的氨基酸不干扰VH和VL的立体构象和妨碍抗原结合部位，其氨基酸组成应当为亲水性和侧链少，便于折叠和减少抗原性。一般由丝氨酸组成（Gly4Ser）n，它的长度至少含10个氨基酸残基，通常是14或15个氨基酸残基（如图7）。ScFv的优点是分子量小，免疫原性弱、渗透力强，并可用于药物导向、中和毒素等功能。缺点是无抗体C区，不能介导抗体的其它生物学效应。另外，利用单价的Fv片段和ScFv还可构建双价抗体，即双价单特异性抗体和双价多特异性抗体（bispecific）。3、基因工程抗体的表达 蛋白质的表达系统有很多，其中主要包括大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物类细胞、昆虫细胞及植物等表达系统。抗体分子表达使用最多的是大肠杆菌和哺乳类细