青霉素的研究进展l论文Word格式文档下载.docx

1、青霉素的发现，引发了医学界寻找抗菌素新药的高潮，人类进入了合成新药的时代。本文主要对青霉素的发现、发展、结构和分类, 以及青霉素的作用机制、生产方法和使用现状等方面进行了介绍。关键词：青霉素；青霉素的结构、分类；抗菌作用机制；生产方法一、青霉素的开发历程1928年9月，细菌学家亚历山大弗莱明在英国伦敦圣玛丽医院的一间实验室里发现，青霉菌具有强烈的杀菌作用，而且就连其培养汤也有较好的杀菌能力。于是他推论，真正的杀菌物质一定是青霉菌生长过程的代谢物，并将青霉菌分泌的抑菌物质称为青霉素1。并于1929年在不列颠实验病理学杂志上，发表了关于霉菌培养的杀菌作用的研究论文，介绍了青霉素的杀菌作用等性质，由

2、当时提取的青霉素杂质较多，性质不稳定，疗效不太显著，人们没有给青霉素以足够的重视。1939年钱恩、弗洛里等人在检索文献时，意外地发现了弗莱明10年前发表的关于青霉素的文章。他们立刻把所有工作转到对青霉素的专门研究上来。到了年底，钱恩终于成功地分离出像玉米淀粉似的黄色青霉素粉末，并把它提纯为药剂。实验结果表面，黄色粉剂稀释三千万倍仍然有效且其抗菌作用比磺胺类药物还强9倍，比弗莱明当初提纯的青霉素粉末的有效率还高一千倍，而且没有明显的毒性。1940弗莱明动身赶到牛津会见钱恩和弗洛里，并毫不犹豫地把自己培养了多年的青霉素产生菌送给了弗洛里，利用这些产生菌，钱恩等人培养出效力更大的青霉素菌株。弗洛里等

3、人四处奔波，希望英国的药厂能投产这一大有前途的新药，遗憾的是多数药厂都借口战时困难而置之不理。最后，他们带着满身的疲惫和残存的希望，远涉重洋，来到了美国，在美国，弗洛里等人终于得到了自己需要的帮助。1941年12月美国军方宣布青霉素为优先制造的军需品。伊利诺斯州皮奥里亚的一家工厂生产了第一批青霉素，但产量少得可怜，因为青霉素的生产工艺十分复杂。直到1942年，人们发现了一种来源广泛又非常便宜的营养液、和一种生产速度很快的金菌青霉素青霉菌，而且找到了一种更为有效的培养方法，使得青霉素的大规模生产变为可能。到1942年末，有二十余家美国公司开始大量生产青霉素。青霉素应用之初，不仅一般人对它表示怀疑

4、，就连多数医务工作者也不相信它的药效。直到1944年，英美联军在诺曼底登陆，开始大规模地同德国法西斯作战，受伤士兵越来越多，对抗菌药物的需要尤为迫切。在这次战争中，磺胺药在医治重伤员时效果却不理想，而为数不多的青霉素填补了磺胺药的空白，显示了较大的威力，活生生的事实，使得医护人员不能不对青霉素刮目相看2。青霉素的发现是人类取得的一个了不起的成就，为表彰弗莱明等人对人类作出的杰出贡献，1945年的诺贝尔医学奖授予了弗莱明、弗洛里和钱恩三人。1953年5月，中国第一批国产青霉素诞生，揭开了中国生产抗生素的历史。目前，中国已成为世界上最大青霉素生产国，青霉素潜在产能10万吨，市场占有率达到80%以上

5、。二、青霉素结构的确定自从青霉素被广泛应用以来, 青霉素的结构便成为众多化学家追寻的问题，科学家相继从自然界中发现了6种青霉素（图一）。经过众多化学家的艰苦研究, 从各种结构中筛选出了3种最为可能的结构（图2）。它们分别是噻唑烷-噁唑酮结构、三环结构和-内酰胺结构。1949年将青霉素的结构确定为-内酰胺结构，青霉素结构的确定距离弗莱明发现青霉素已经有21年3。为了纪念弗莱明发现青霉素, 把他发现的青霉素命名为青霉素F。图1 自然界中6种青霉素及人工合成青霉素V 的结构图2 青霉素的3种可能结构三、青霉素结构特点与性质青霉素是发现最早、最卓越的一种-内酰胺类抗生素。青霉素分子中有一个游离的羟基和

6、酰胺侧链，氢化噻唑环与-内酰胺合并构成其母核，称为6-氨基青霉烷酸（6-aminopenicillanic acid,简称6-APA）。青霉素的分子结构由侧链RCO与母核6-APA两部分结合而成。-内酰胺环是青霉素的结构活性中心，性质活泼，是分子中最不稳定部分，易发生水解和分子重排，导致-内酰胺环的破坏而失去抗菌活性。青霉素分子中含有三个手性碳原子，故具有旋光性。青霉素中游离的羟基具有一定的酸性，能与无机碱或某些有机碱形成盐，青霉素几乎不溶于水但其盐极易溶于水。经过研究确定抗菌性能最好, 也是我们现在最常用的青霉素是青霉素G。青霉素G，其化学名称为（ 2S, 5R, 6R ） -3, 3-二甲

7、基-6-（ 2-苯乙酰氨基） -7-氧代-4-硫杂-1-氮杂双环 3. 2. 0庚烷-2-甲酸。英文名称为（ 2S, 5R, 6R ） -3, 3-dimethy l-7-oxo-6- （ 2-pheny lacetyl ） amino -4-thia-1-azabicyclo 3. 2. 0 heptane-2-carboxylic acid。分子式为C16H18N2O44S, 相对分子质量为334. 4, 比旋光度 D20 为+ 269（ c= 1, 甲醇）4，其结构式如图1所示。图3 青霉素G四、青霉素的分类1928年发现青霉素到现在, 已经过去了80多年， 截止目前青霉素可分为三代：第

8、一代青霉素指天然青霉素，如青霉素G、F、K等；第二代青霉素是指以青霉素母核6氨基青霉烷酸（6APA）改变侧链而得到半合成青霉素，如甲氧氨苄青霉素、苯青霉素、羧苄青霉素；第三代青霉素是母核结构，它带有与青霉素相同的内酰胺环，但不具有四氢噻唑环，如硫霉素、奴卡霉素。青霉素按其特点可分为6类5：1.青霉素G 类：如青霉素G 钾、青霉素G 钠、长效西林等。2.青霉素V 类：如青霉素V 钾等。3.抗假单胞菌青霉素：如羧苄西林、哌拉西林、替卡西林等。4.广谱青霉素：如氨苄青霉素、羟氨青霉素等。5.耐酶青霉素：如苯唑青霉素、氯唑青霉素等。6.氮咪青霉素：如美西林及其酯匹美西林等, 其特点为较耐酶, 对某些阴

9、性杆菌如克雷伯氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌有效, 但对绿脓杆菌效果较差。五、青霉素的合成1579年3月J.C.Sheehan和 R.K,Henrylogan发表了一篇题目为“ 青霉素v 的全合成”的报导6。1945年以前，多数化学家接受青霉素的结构式是四氢噻吩-噁唑酮结构式 ，如图4所示，第一次成功合成青霉素7是依据四氢噻吩-噁唑酮结构式设计的。图4 四氢噻吩-噁唑酮结构式青霉素（以苯甲基青霉素为代表）的一个主要降解反应是碱性水解, 先生成D -苯甲基青霉酸（D-benzylpenicilloic acid），此化合物不稳定，在室温脱羧成D-苯甲基脱羧青霉酸，再经过氯化高汞水溶液的处理，打开四氢噻

10、唑环，最后生成苯甲基青霉醛和青霉胺，过程如图5。图5 苯甲基青霉醛和青霉胺合成过程首次苯甲基青霉素的合成是用青霉胺与4甲氧甲亚基2苯甲基5（4）噁唑酮或4-乙氧甲亚基2苯甲基5（4）噁唑酮缩合而成。缩合分两步进行，首先在吡啶中和在三乙胺的存在下使Xa与在00缩合10min,再低温析离后，再在吡啶中，在微量的吡啶酸存在下，加入少量的二乙胺，在1300加热7min，在这样的条件下所得到的产物中含有不超过0.1%的苯甲基青霉素的活性，如图6所示8。图6 苯甲基青霉素的合成目前青霉素的生产方法主要是半合成法，利用微生物产生的青霉素酰化酶裂解青霉素G或V 得到6-氨基青霉烷酸（ 6-aminopenic

11、ilanic acid, 6APA ） （图7） , 以其为原料,用化学或生物化学等方法将各种类型的侧链与其缩合, 制成各类具有耐酶、耐酸或广谱抗菌性质的青霉素类抗生素。图7 6-氨基青霉烷酸的结构化学半合成法是先将各种前体羧酸转变为酰氯或酸酐, 然后与6-氨基青霉烷酸于低温下缩合得到青霉素（图8）。图8 青霉素的半合成法随着酶催化法合成青霉素工业发展日趋成熟，现在利用酰胺酶裂解青霉素成6-氨基青霉烷酸的逆反应, 在pH 5和适宜的温度下, 可使6氨基青霉烷酸和侧链缩合成相应的新青霉素9。六、青霉素的抗菌作用机制黏肽是细菌细胞壁的主要成分, 是细菌细胞壁中最坚硬的一层，它的存在可以维持细菌细胞

12、的外形,保持细菌细胞壁的通透性。黏膜是敏感细菌细胞壁的基础成分，青霉素的主要作用就是抑制黏膜的合成，使细菌不能形成黏肽，最终导致细胞壁不能形成，使细菌体无法生成保护屏障，内外渗透导致菌体肿胀、破裂而被杀灭。青霉素的结构同黏肽的末端结构丙氨酰丙氨酸相似, 青霉素通过取代丙氨酰丙氨酸与酶的活性中心结合（图9），使组成黏肽的多肽不能交联形成网状的黏肽, 从而导致细菌细胞壁不能形成，最终引起细菌被溶解而死亡10。由于细菌与哺乳动物的细胞壁有区别,而青霉素对菌体细胞壁的选择性很强,所以对人而言，青霉素的毒性不大，青霉素对真菌无效，因为真菌没有细胞壁。图9 青霉素的抗菌作用机制七、青霉素抗生素的耐药性青霉

13、素的药效高、毒副作用小且价格便宜, 成为人们杀菌治病的首选药物。在上个世纪的50年代，也就是青霉素开始大量在临床上使用时，一个病人每一次注射青霉素只需要20万单位，而到了90年代，一个病人每一次注射的青霉素需要80100万单位，青霉素用量几乎增加了近5倍，导致这种现象的原因是细菌对青霉素出现了耐药性1112。有些致病菌不仅能够耐药，而且还产生了破坏青霉素的能力，能够将青霉素的母核破坏，使其丧失杀菌活性。细菌对青霉素类抗生素产生耐药性主要表现在以下3个方面13：1.PBPS亲和力下降PBPS是与细菌细胞壁合成、维持以及肽聚糖结构特征的调节等有关的一组酶。某些细菌通过改变PBPS亲和力，改变菌体内

14、青霉素结合蛋白与药物的亲合力，使菌体内的青霉素结合蛋白参与细菌的正常分裂繁殖活动受到抑制，从而使其对-内酰胺类药物的敏感度降低，产生耐药性。2.-内酰胺酶细菌对青霉素类抗菌药的主要耐药机制还是-内酰胺酶胺酶，青霉素类药物在这类酶的作用下，使-内酰胺环水解开环，而-内酰胺环是与PBPS结合的活性功能部位，因此-内酰胺环的破坏使其失去了干扰细菌细胞壁合成的功能，细菌产生-内酰胺酶导致细菌对青霉素抗菌药物产生耐药性。3. 通透性某些细菌通过改变菌体外膜的通透性, 减少菌体内药物的蓄积，从而使自身产生耐药性。八、青霉素的结构改造随着细菌对青霉素类抗生素耐药性的产生，科学家们致力于青霉素结构的研究，希望

15、通过改变青霉素的化学结构从而减少细菌对青霉素的耐药性。在研究青霉素的化学结构与药效关系中，发现青霉素母核6-APA是由一个四元环与一个五元环并在一起所组成的分子活性部分，它是青霉素抗菌活性的关键部位，如果四元环被破坏，青霉素就失去了抗菌活性。另一部分是与之连接的侧链RCO，研究发现改变侧链的结构，可以增加耐受致病菌破坏的能力和增加母核的稳定性，通过对青霉素的侧链结构改造，可以达到提高青霉素药效和治疗作用的目的14。致病菌对经过改装的青霉素的破坏和耐受能力降低，容易被杀死，与原来的青霉素相比，因为侧链改变了，原来对青霉素有抗性的致病菌对它有些“面生”不怎么认得，于是被稀里糊涂地杀死了。九、青霉素

16、的生产方法天然青霉素主要通过发酵来生产，分为菌种发酵和提取精制两个步骤；半合成青霉素则是以6APA 为中间体与多种化学合成有机酸进行酰化反应，制得各种类型的半合成青霉素。发酵条件下的生长过程：第1期：分生孢子萌发，形成芽管，原生质未分化，具有小泡。第2期：菌丝繁殖，原生质体具有嗜碱性，类脂肪小颗粒。第3期：形成脂肪包涵体，机理贮藏物，没有空泡，嗜碱性很强。第4期：脂肪包涵体形成小滴并减少，中小空泡，原生质体嗜碱性减弱，开始产生抗生素。第5期：形成大空泡，有中性染色大颗粒，菌丝呈桶状，脂肪包涵体消失，青霉素产量最高。第6期：出现个别自溶细胞，细胞内无颗粒，仍然桶状。释放游离氨，pH上升。第7期：

17、菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。镜检：规定时间取样，显微镜观察7个时期的形态变化，控制发酵。14期为菌丝生长期，3期的菌体适宜为种子。45期为生产期，生产能力最强，通过工程措施，延长此期，获得高产。在第六期到来之前结束发酵。青霉素生产流程：发酵工艺过程（1）生产孢子的制备将砂土保藏的孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的培养基进行斜面培养，经传代活化。最适生长温度在2526 ，培养68天，得单菌落，再传斜面，培养7天，得斜面孢子。移植到优质小米或大米固体培养基上，生长7天，25，制得小米孢子。每批孢子必需进行严格摇瓶试验，测定效价及杂菌情况。（2）种子罐和发酵罐培养工艺种子培养要求产生大量健壮的菌丝体，

18、因此，培养基应加入比较丰富的易利用的碳源和有机氮源。青霉素采用三级发酵一级种子发酵：发芽罐.小罐，接入小米孢子后，孢子萌发，形成菌丝。培养基成分：葡萄糖，蔗糖，乳糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫剂等。通无菌空气，空气流量1：3（体积比）；充分搅拌300350r/min；4050小时；pH自然，温度271。二级发酵罐：繁殖罐.大量繁殖。玉米浆、葡萄糖等。1：11.5；250280r/min；pH自然，251；014h。三级发酵罐：生产罐。花生饼粉（高温），麸质粉、玉米浆、葡萄糖，尿素，硫酸铵，硫酸钠、硫代硫酸钠，磷酸二氢钠，苯乙酰胺及消泡剂，CaCO3等。接种量为1215%。青霉素的发酵对溶氧要

19、求极高，通气量偏大，通气比控制0.71.8；150200r/min；要求高功率搅拌，100 m3的发酵罐搅拌功率在200300 Kw，罐压控制0.040.05 MPa，于2526 下培养，发酵周期在200h左右。前60h，pH5.76.3，后6.36.6；前60h为26，以后24。发酵过程控制：反复分批式发酵，100m3发酵罐，装料80m3，带放610次，间隔24h。带放量10，发酵时间204h。发酵过程需连续流加补入葡萄糖、硫酸铵以及前体物质苯乙酸盐，补糖率是最关键的控制指标，不同时期分段控制。在青霉素的生产中，让培养基中的主要营养物只够维持青霉菌在前40h生长，而在40h后，靠低速连续补加

20、葡萄糖和氮源等，使菌半饥饿，延长青霉素的合成期，大大提高了产量。所需营养物限量的补加常用来控制营养缺陷型突变菌种，使代谢产物积累到最大。（1） 培养基青霉素发酵中采用补料分批操作法，对葡萄糖、铵、苯乙酸进行缓慢流加，维持一定的最适浓度。葡萄糖的流加，波动范围较窄，浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至引起自溶，葡萄糖浓度调节是根据pH，溶氧或CO2释放率予以调节。碳源的选择：生产菌能利用多种碳源，乳糖，蔗糖，葡萄糖，阿拉伯糖，甘露糖，淀粉和天然油脂。经济核算问题，生产成本中碳源占12以上，对工艺影响很大；糖与6-APA结合形成糖基-6-APA，影响青霉素的产量。葡萄糖

21、、乳糖结合能力强，而且随时间延长而增加。通常采用葡萄糖和乳糖。发酵初期，利用快效的葡萄糖进行菌丝生长。当葡萄糖耗竭后，利用缓效的乳糖，使pH稳定，分泌青霉素。可根据形态变化，滴加葡萄糖，取代乳糖。目前普遍采用淀粉的酶水解产物，葡萄糖化液流加。降低成本。氮源：玉米浆是最好的，是玉米淀粉生产时的副产品，含有多种氨基酸及其前体苯乙酸和衍生物。玉米浆质量不稳定，可用花生饼粉或棉籽饼粉取代。补加无机氮源。无机盐：硫、磷、镁、钾等。铁有毒，控制在30g/ml以下。流加控制：补糖，根据残糖、pH、尾气中CO2和O2含量。残糖在0.6左右，pH开始升高时加糖。补氮：流加酸酸铵、氨水、尿素，控制氨基氮0.05%

22、。添加前体：合成阶段，苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可为青霉素侧链的前体，直接掺入青霉素分子中。也具有刺激青霉素合成作用。但浓度大于0.19时对细胞和合成有毒性。还能被细胞氧化。策略是流加低浓度前体，一次加入量低于0.1%，保持供应速率略大于生物合成的需要。（2）温度一生长适宜温度30，分泌青霉素温度20。但20青霉素破坏少，周期很长。生产中采用变温控制，不同阶段不同温度。前期控制2526左右，后期降温控制23。过高则会降低发酵产率，增加葡萄糖的维持消耗，降低葡萄糖至青霉素的转化得率。有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间，生产阶段适当降低温度，以利于青

23、霉素合成。（3）pH合成的适宜pH6.46.6左右，避免超过7.0，青霉素在碱性条件下不稳定，易水解。缓冲能力弱的培养基，pH降低，意味着加糖率过高造成酸性中间产物积累。pH上升，加糖率过低不足以中和蛋白产生的氨或其他生理碱性物质。前期pH控制在5.76.3，中后期pH控制6.36.6，通过补加氨水进行调节。pH较低时，加入CaCO3、通氨调节或提高通气量。pH上升时，加糖或天然油脂。一般直接加酸或碱自动控制，流加葡萄糖控制。（4）溶氧溶氧30饱和度，产率急剧下降，低于10，则造成不可逆的损害。所以不能低于30饱和溶氧浓度。通气比一般为1：0.8VVM。溶氧过高，菌丝生长不良或加糖率过低，呼吸

24、强度下降，影响生产能力的发挥。适宜的搅拌速度，保证气液混合，提高溶氧，根据各阶段的生长和耗氧量不同，对搅拌转速调整。（5）菌丝生长速度与形态、浓度对于每个有固定通气和搅拌条件的发酵罐内进行的特定好氧过程，都有一个使氧传递速率（OTR）和氧消耗率（OUR）在某一溶氧水平上达到平衡的临界菌丝浓，超过此浓度，OUROTR，溶氧水平下降，发酵产率下降。在发酵稳定期，湿菌浓可达1520%，丝状菌干重约3%，球状菌干重在5%左右。另外，因补入物料较多，在发酵中后期一般每天带放一次，每次放掉总发酵液的10%左右。有丝状生长和球状生长两种。前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触，比生产率高，发酵粘

25、度低，气/液两相中氧的传递率提高，允许更多菌丝生长。球状菌丝形态的控制，与碳、氮源的流加状况，搅拌的剪切强度及稀释度相关。（6）消沫发酵过程泡沫较多，需补入消沫剂。天然油脂：玉米油；化学消沫剂：泡敌。少量多次。不适在前期多加入，影响呼吸代谢。青霉素的发酵过程控制十分精细，一般2 h取样一次，测定发酵液的pH、菌浓、残糖、残氮、苯乙酸浓度、青霉素效价等指标，同时取样做无菌检查，发现染菌立即结束发酵，视情况放过滤提取，因为染菌后pH值波动大，青霉素在几个小时内就会被全部破坏。在对青霉素合成途径研究时发现，青霉素的合成与赖氨酸合成有关系，赖氨酸生物合成的一个中间体-氨基己二酸参与青霉素合成，赖氨酸在

26、合成过程中，如果合成多了，会对其本身的高柠檬酸合成酶产生反馈抑制作用，从而减少-氨基己二酸的生成，间接地抑制青霉素的合成。所以在青霉素发酵过程中加入-氨基己二酸，可减少赖氨酸的抑制作用，而提高青霉素的产量。近十多年来，基因工程和代谢工程的发展，使青霉素产量得到很大的提高。目前青霉素合成途径与代谢途径的关系已经研究的十分清楚。人们可采用基因缺失的办法将消耗合成青霉素原料和干扰青霉素合成的代谢旁路的关键基因敲掉，或抑制相关基因的表达，提高青霉素原料的利用率，减少副产物的生成，进一步提高了青霉素的产量。也可用基因工程方法将控制青霉素合成途径的基因，和合成青霉素途径中的关键基因转移到青霉素生产菌中，使

27、合成青霉素的途径更顺畅，也可提高青霉素合成的产量。十、青霉素使用现状临床中较多研究显示15，青霉素类抗生素在各类抗生素应用中占有相当大的比例。青霉素类抗生素为广谱抗生素，治疗效果较佳且不良反应相对较小。本类药物主要作用于细菌的细胞壁，人类细胞无细胞壁故青霉素对人类影响较小，所以其在临床的应用范围较广，又本类药物的价格合理，故其临床应用率较高。由于抗生素的滥用导致细菌耐药性的增加，人们对抗生素使用的重视程度也提高，对于其应用的规范性措施也不断改进及实施，但是较多研究显示，抗生素滥用及应用不合理的情况仍然普遍存在，在我国，特别是儿童抗生素使用率很高，居高不下16。青霉素是人类发明的第一个抗生素，人

28、们把它连同原子弹、雷达，称为第二次世界大战中的三大发明。青霉素在第二次世界大战中拯救了千百万伤病员。感染就打青霉素，这是几代人的集体记忆。不过，近些年来，由于利润低等原因，青霉素在医疗机构中使用量大幅度减少，许多社区医院干脆弃用青霉素。有关调查显示，国内青霉素注射剂的用量已从1997年的第2位，退居到2010年的第13位。青霉素市场相对萎缩，但其在临床中的作用是不可替代的，青霉素类抗生素市场前景依然被看好。近年来，国家开始实施基本药物制度，医生开贵药和便宜药没有差别，斩断了医药之间利益链，随着基本药物制度的规范实施，青霉素或将成为基层临床用抗生素的首选。十一、结语自1928年弗莱明发现了青霉素以来，人类便同青霉素一起同细菌开始了斗争，在众多科学家的不懈努力下，越来越多的抗生素诞生了, 抗生素家族越来越壮大。在德国化学钱恩和英国病理学家弗洛里的努力下，实现了对青霉素的分离与纯化，并发现其对传染病的疗效，为青霉素工业化生产和利用奠定了基础。随着科学、技术的进步，特别是生物技术的广泛应用，使青霉素的生产达到前所未有的水平。尽管青霉素等抗生素具有良好的抗菌作用, 并且副作用比较低, 但随着青霉素的不断使用，细菌对青霉素的耐药性越来越强。因此对青霉素等抗生素的使用要科学合理, 不能随便滥用，以避免细菌耐药性日益加重。科学合理地使用抗生素，人类的抗菌斗争才会更加有效，健康才能有保证。