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1、将5个大方格内数得的红细胞数换算成1个大方格的红细胞数。 10 ：将1个大方格红细胞换算成1ul血液内红细胞。106：1L106ul200：为血液的稀释倍数。【注意事项】1 采血时不能过分挤压采血部位，针刺部位深度必须适当。2 采血应顺利、准确，采血部位不得有水肿、发绀、冻疮、炎症等。红细胞数量增高时可适当加大稀释倍数。3 大小方格内压线细胞的计数遵循数上不数下、数左不数右的原则。避免多数或漏数。4 稀释液要过滤，小试管、计数板均须清洁干燥，以免杂质、微粒等被误认为是细胞。5 如无上述稀释液时，也可用新鲜配制的等渗盐水代替。6 将细胞悬液充入计数池时要一次完成，不能产生满溢、气泡、或充池不足的

2、现象。7 红细胞在计数池中若分布不均，每个方格之间相差超过20个以上时要重新充池计数。正常数值范围内，2次红细胞计数相差不得超过5%。【方法学评价】 目视计数法是传统的的红细胞计数法，不需要特殊设备，但操作复杂、费时。【质量控制】1计数评价在细胞计数的评价中，多采用两差比值（r）评价。2稀释造成稀释倍数不准确的常见原因有：稀释液或血液加样不准确。吸血时吸管内有气泡。未檫去吸管外血。血液加入稀释液时使上清液浑浊，血液被吸管带出。稀释液放置的时间过长，蒸发浓缩。【参考值】 成年男性：（4.05.5）1012。成年女性：（3.55.0）新生儿： （6.07.0）实验二 血红蛋白测定氰花高铁血红蛋白测

3、定法【目的】 掌握氰化高铁血红蛋白（HiCN）测定方法。【原理】 在血红蛋白转化液中，除硫化血红蛋白外，其余血红蛋白均可被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白，再与氰离子（CN-）结合，生成稳定的复合物氰化高铁血红蛋白（hemoglobin cyanide，HiCN）。棕红色的氰化高铁血红蛋白在波长540nm处有吸收峰，可用校正的高精密分光光度计进行直接定量测定，或用HiCN参考液进行比色法测定，根据标本的吸光度即可求出血红蛋白浓度。【器材】 一次性消毒采血针，微量吸管，试管。5ml移液管，75%（V/V）乙醇棉球，无菌干棉球，分光光度计，试管。【试剂】1HiCN转化液（文齐液）氰化钾（KCN）50m

4、g，高铁氰化钾K3Fe（CN）6200mg，无水磷酸二氢钾（KH2PO4）140mg，Triton X 100 1.0ml，蒸馏水加至1000ml，纠正pH至7.07.4。此液淡黄色透明溶液，用蒸馏水调零，比色杯径1.000cm，波长540nm处的吸光度应0.001。贮存在棕色有塞玻璃瓶中，放4冰箱保存，一般可保存数月。如发现试剂变绿、浑浊不能使用。2HiCN标准液（200g/L）商品试剂。【标本】 外周血。【操作】1直接定量测定（1）加转化液：试管内加5mlHiCN转化液。（2）采血与转化：取全血20ul，加到盛有转化液的试管底部，用上清液反复冲洗吸管3次，充分混合，静置5min。（3）测定

5、：以符合WHO标准的分光光度计（常规测定时带宽应小于6cm）。波长540nm处，光径（比色杯内径）1.000cm，HiCN转化液或蒸馏水调零，测定吸光度（A）。（4）计算：根据标本的吸光度（A）直接计算出血红蛋白浓度（g/L）。血红蛋白（g/L）=A64458/44000251+A367.7A： 540nm处测定管吸光度。64458：目前国际公认的血红蛋白平均相对分子量。44000：1965年国际血液学标准化委员会（ICSH）公认的血红蛋白摩尔消光系数。251：稀释倍数。2HiCN标准液比色法测定（1） 标准曲线绘制和K值计算。用HiCN标准液倍比稀释后（50g/L、100g/L、150g/L

6、、200g/L），在所用的分光光度计上（相当540nm处）分别测定各稀释度的吸光度，以标准品血红蛋白含量为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。或求出此换算常数K。（2） 标本的血红蛋白转化和比色同直接测定，得到标本的吸光度（A）。（3） 通过标准曲线查出待测样本的血红蛋白浓度或用K值来计算血红蛋白浓度，即Hb（g/L）=KA例，如倍比稀释后HiCN标准液50g/L、100g/L、150g/L、200g/L，分别测得540nm处的吸光度为0.13、0.27、0.41、0.54，标本的吸光度为0.32。先求K值，再计算出标本的血红蛋白浓度（g/L）。 K=Hb/A=50+100+150+200/

7、0.13+0.27+0.41+0.54=370.37Hb=370.370.32=118.52（g/L） 【注意事项】1 血红蛋白测定方法很多。但无论采用何种方法，都必须以HiCN法为标准，绘制标准曲线。标准曲线或K值应定期检查，并与分光光度计相配。2 标准微量吸管必须经过水银称重法校正。加液必须准确，血液与转化液充分混匀。可用血红蛋白代替抗凝血进行鉴定。3 HiCN转化液不能贮存在塑料瓶中，否则会使CN-丢失，测定结果偏低。HiCN转化液应贮存在棕色他塞是玻璃瓶中，4冰箱保存一般可用数月，但不能在0以下保存，因为结冰可引起高铁氰化钾还原，使转化液褪色失效。HiCN转化液是一种低离子强度而pH又

8、近中性的溶液，遇到白细胞过多或异常球蛋白增高的血液标本，HiCN比色液会出现浑浊。若因白细胞过多引起的浑浊，可离心后去上清液比色；若因球蛋白异常增高（如肝硬化者）引起的浑浊，可向比色液中加如少许固体氯化钠或碳酸钾，混匀后可使溶液澄清。氰化钾是剧毒品，配置转化液时要按剧毒品管理程序操作。配制好的HiCN转化液中因氰化钾含量低，又有高铁氰化钾存在。毒性不是很大。若进入人体宁日，高铁氰化钾氧化血红蛋白，生成高铁血红蛋白。后者结合CN-，起到一定的解毒作用，但仍应妥善保管。测定后的废液不能与酸性溶液混合，因为氰化钾遇酸可产生剧毒的氰氢算气体。为防止氰化钾污染环境，比色测定后的废液集中于广口瓶中。按没升

9、HiCN废液加次氯酸钠溶液（安替福民）40ml，充分振摇混匀，敞开容器，置室温3h。【方法学评价】 HiCN法操作简便，试剂单一，除SHb外所有血红蛋白均可迅速转化为HiCN，显色快且稳定（显色后若保存得当可达6年不褪色），可以根据吸光度直接计算结果，因此被列为国际血红蛋白测定的参考方法，也是我国推荐的首选方法，但其试剂中氰化钾为剧毒药品，须妥善保存，处理。另外，高铁蛋白血症和白细胞明显增高的标本可导致反应液浑浊而影响结果。【质量控制】 若用分光光度计作精密定量测定，分光光度计的波长和吸光度需要校正，带宽应小于1nm，比色杯光径1.000cm，允许误差为0.5%（即1. 9951.005），测

10、定温度为2025。仪器的校正是测定中的关键。校正大致分为以下几个步骤。1波长 将100150g/L的HiCN标准液放在待检分光光度计中，从500600nm分几个波段测定H iCN标准液的吸光度，如所测最大吸收凤在540nm，表示分光光度计波长准确；实际工作中对波长偏差不大的分光光度计可把吸收峰波长（如在536nm）当作540nm进行测定。2HiCN吸收光谱峰值在540nm，峰谷在504nm。杂光的增加使HiCN在吸收峰处吸光度下降，而对峰谷处吸光度影响不大。设Q值为反映杂光水平的参数，Q=A540/A504，合格的分光光度计Q值应为1.591.63。杂光可使吸收光谱的Q值减低。3比色杯 用Hi

11、CN试剂作空白，波长710800nm，比色杯光径1.000时，吸光度应小于0.002。4 敏度和线性 用HiCN标准液倍比稀释（应包括高，低病理浓度）后，在数用的分光光度计上相当540nm分别测定各稀释度的吸光度，以标准液血红蛋白含量为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制曲线。观察各点连线是否为直线，如有个别点不在直线上，作图时应使直线通过尽量多的点。也可用直线回归法计算回归曲线（y=bx+a）后作图。将直线以外的实测吸光度与直线上理论吸光度比较，如两者之差在5%以内则可认为仪器符合线性的要求。直线的最低点即为该仪器HiCN法的灵敏度；最低与最高点间的范围即为仪器HiCN法的测定线性范围。此外，引起测

12、定值增高的常见误差是稀释倍数不准确，因红细胞溶解不当引起标本浊度增加，血浆中脂质或蛋白量增加。【参考值】 成年男性：120160g/L；成年女性：110150g/L。 70岁以上老年男性：94.2122.2g/L；女性：86.5111.8g/L。 新生儿：170200g/L。实验三 白细胞计数【目的】 掌握显微镜法白细胞计数的原理及方法。【原理】 用白细胞稀释液将血液稀释一定的倍数，同时破坏溶解红细胞。将稀释的血液注入血细胞计数板，在显微镜下计数一定体积内的白细胞数，经换算即可求出每升血液中的白细胞数量。【器材】 显微镜、改良Neubauer计数板、试管、吸管、微量吸管、滴棒。【试剂】 白细胞

13、稀释液：2%冰乙酸溶液中加入10g/l结晶紫（或亚甲蓝）3滴。【标本】 新鲜全血或末梢血。1 加稀释液 哟拗不过吸管吸取白细胞稀释液0.38ml于小试管中。2吸取血液 用微量吸管吸取新鲜全血或末梢血20ul，查去管尖外部余血。将吸管插入小试管中白细胞稀释液的底部，轻轻放出血液，并吸取上层白细胞稀释液清洗吸管23次。3混匀 将试管中血液与稀释液混匀，待细胞悬液完全变为棕褐色。4充池 再次将小试管中的细胞悬液混匀。用滴棒蘸取细胞悬液1滴，充入改良Neubauer计数池中，室温静置23min，待白细胞完全下沉。5 计数 在低倍镜下计数四角4个大方格内的白细胞总数。6 计算 白细胞= 4个大方格内白细

14、胞数（N）20106/4=N/20109/L1 吸管、微量吸血管、血细胞计数板均为计量工具，使用前需经过严格的校正，否则将直接影响计数结果的准确。2 是用标本可为由静脉穿刺采取的新鲜全血，也可为静脉末梢血。采集末梢血时，应注意采血部位不得有冻疮、水肿、发绀、炎症等，以免标本失去代表性；同时也注意不能过度挤压，以免组织液混入引起血液凝固或造成计数结果不准确。3 在充池时，如充液不足、液体外溢、断续充液，或产生气泡、充液 后移动盖玻片等，均会使细胞分布不均匀，造成计数结果不准确。4 计数池内的细胞分布应均匀，一般情况下各大方格间的细胞数相差不超过10%。若相差太大应重新充池。5 计数大小方格内的压

15、线细胞时，应遵循数上不数下，数左不数右的原则。6 白细胞数量过多时，可采用加大稀释倍数的方法。如20ul血加入到0.78ml稀释液中或10ul血加到0.38ml稀释液中。7 白细胞数量过少时，可采用扩大计数域的方法，计数8个或9个大方格；也可采用减少稀释倍数的方法。8 白细胞稀释液不能破坏有核红细胞，它可使白细胞计数结果偏高，此时应计算白细胞校正值（公式中的有核红细胞是指分类100个细胞时所遇见的有核红细胞）。 白细胞校正值/L=100/（100+有核红细胞）校正前白细胞数【方法学评价】 显微镜目视计数法是传统的白细胞计数法，简便易行，不需昂贵的仪器，可用于校正血液分析仪。可根据公式计算固有误

16、差总变异系数。 CV=1002/nb+4.62/nc+4.72/np式中，为所数白细胞总数；n为计数板使用的次数；np所用吸管使用的次数；因此，用于标准血液分析仪时，应在严格规范的田间下进行。如操作人员的选择、同一标本使用多只吸管、多个计数板、计数细胞数量达到一定的程度、多次重复等。这样才能避免计数板的固有误差、计数板和吸管的系统误差和操作随机误差的影响，使计数结果接近真值。在实际工作中，显微镜目视计数法由于微量吸管、血细胞计数板、细胞分布状态、人为因素等影响因素，其精密度和重复性欠佳。因而目前在临床工作中，多应用血液分析仪进行白细胞计数。经校准后的血液分析仪由于其计数细胞多，易于标准化，逼供

17、内在严格质量控制和规范的操作步骤等条件下进行，因此，计数的精确性及准确性均较高。血液分析仪检测速度快，适合大规模健康人群的普查，但需要特殊仪器，某些人为或病理情况（如外周血出现有核红细胞、巨大血小板和血小板凝集等）可干扰白细胞计数。【质量控制】 显微镜目视白细胞计数法质量控制的关键在于掌握误差规律，严格遵守操作规程，减少误差，以期获得准确的结果。根据白细胞计数结果与血涂片上白细胞分布密度是否相符来粗略判断计数结果准确性的方法，是人们在实际工作中总结出来纯经验控制方法。另外还有几种方法可以用来进行一般的质量控制与考核：常规考核标准（routine checking standard，RCS）：根

18、据白细胞在计数池内四个大方格里的分布情况而规定。变异百分率评价法：以测定值和靶值差值的和绝对值来表示。两差比值评价法：两差比值是同一标本或同一患者在短时间内2次计数细胞数之差与2次计数细胞之和的标准之比。双份计数标准差评价法：选1020份标本，每份重复2次计数，用双份之差计算标准差（s），然后求得变异系数（CV）及质量得分。 成人：（410）109/L 初生儿：（1520） 6个月2岁：（1112）109/L。实验四 白细胞分类计数【目的】 掌握显微镜外周血白细胞分类计数的方法及白细胞的在正常形态，【原理】 将血液制成分布均匀的血涂片，用瑞氏染液染色，根据各类细胞的形态特点和颜色差异将白细胞进

19、行分；类并计数。通常分类100个白细胞，计算得出各种白细胞所占的百分率。【器材】 显微镜、分类计数器、香柏油、拭镜纸、清洁液。【试剂】 瑞氏染液、磷酸盐缓冲液（pH6.46.8）。【标本】 制备良好的血涂片。1 染色 将血涂片用瑞氏染液染色，冲洗干净，自然干燥后待用。2 低倍镜观察 低倍镜下观察白细胞的分布和染色情况。3 油镜观察 选择涂片体尾交界处细胞分布均匀、着色良好的区域，按一定的方向顺序对所见到的每一个白细胞进行分类，并用白细胞分类记数器作好记录，共计数100个白细胞。4 计算 求出各类白细胞所占百分率。1由于各种白细胞体积大小不等、体积较小的淋巴细胞在血涂片的头、体部较多，而尾部和两

20、侧以中性粒细胞和单核细胞较多，因此分类最佳区域为体、尾交界处。2分类时要有秩序地、沿一定方向地连续进行。既不重复亦不遗漏，避免主观选择视野。3分类计数结果的记录也可采用手工画“正”或“+”的方法。4白细胞总数在（3.015.0）109/L之间者，分类计数100个白细胞。总数在15.0109/L以上时，应计数200个白细胞，而总数低于3.0109/L时。则应选用2张涂片计数50100个白细胞。5白细胞所占百分率，乘以白细胞总数，即可求出每升血液中各类白细胞数量的绝对值。6分类中如见血涂片上有幼红细胞，应逐个计数但不计入100个白细胞内，以分类100个白细胞见到幼红细胞多少个来报告，并应注明其所属

21、阶段。7分类中还应注意观察成熟红细胞和血小板的形态、染色及其分布情况，注意有无寄生虫（如虐原虫）及其他异常所见。【方法学评价】 显微镜法白细胞分类是经典、传统的血细胞分类法，目前还无任何仪器可以完全取代。它能够准确得根据细胞形态特征进行分类计数，并可及时发现异常细胞。血液分析仪进行细胞分类主要是从细胞的体积大小、细胞核形、细胞化学染色等方面进行检测，检测速度快，分析细胞多，适宜于大批量标本的筛检。对其筛检出来的异常标本，要准确识别细胞类别及确认病理改变还必须以显微镜检查为准。【参考值】 见下表表：正常成人外周血白细胞分类参考值白细胞分类百分率（）分数数绝对值（109）中性杆状核粒细胞150.0

22、10.050.040.50中性分叶核粒细胞50700.50.727嗜酸性粒细胞0.550.0050.050.020.50嗜碱性粒细胞0100.01淋巴细胞20400.200.400.84.0单核细胞380.030.080.120.80实验五 血小板计数【目的】 掌握血小板的显微镜目视技术方法。【原理】 血液经稀释液按一定比例稀释和破坏红细胞后，充入血细胞计数板内，在显微镜下计数一定范围内的血小板数量，经过换算求出每升血液中血小板的数量。【器材】 显微镜，血细胞计数板，采血针，血红蛋白吸管，试管【试剂】 10g/L草酸铵稀释液（草酸铵10g，EDTANa20.12g溶于1000ml蒸馏水中，混匀

23、）【标本】 外周血1 吸取稀释液 准确吸取10g/L草酸铵稀释液0.38ml置于清洁小试管中。2 采血 常规消毒无名指，穿刺后，让血液自然流出，准确采血20ul置于含有草酸铵的稀释液中，立即充分混匀。3 稀释静置 待完全溶血后再混匀1min，置室温10min。4 充液静置 取混匀的血小板悬液1滴充入血细胞计数板内，静置1015min，使血小板充分下沉。空气干燥的季节应将血细胞计数板置湿盒内。5 计数 用高倍镜计数血细胞计数板中央大方格内的四角和中央共5个中方格内血小板数量。6 计算 每升血小板数5个中方格内血小板数1稀释液要清洁，无细菌、尘埃等污染。存放时间较长后应过滤后再使用。2毛细血管采血

24、时，针刺应达3mm深，使血液流畅。拭去第一滴血后立即采血，以防止血小板聚集和破坏。如果同时做白细胞和血小板计数时，应先采血做血小板计数。3血液加入血小板稀释液内要充分混匀，但不可过度振荡，以免导致血小板破坏和聚集。4血小板悬液充入血细胞计数板内需要静置1015min，使血小板完全下沉后再计数。但应注意保持湿度，避免水分蒸发而影响计数结果。5计数时光线不可太强，注意微有折光性的血小板与尘埃等的鉴别，附着在血细胞旁的血小板也要注意，不要漏计。6应在1小时内计数完毕，否则结果偏低。7所用计量器材必须标准化。8检查前，患者应避免服用含有阿司匹林及其他抗血小板药物。【方法学评价】 目前血小板计数方法主要

25、有两大类，血小板分析仪法和目视显微镜计数法（普通光学显微镜和相差显微镜目视计数法）。显微镜血小板计数法以草酸铵法为参考方法。草酸铵稀释液为首选的稀释液（其对红细胞破坏力强，血小板清楚）。血液分析仪法由于重复性好目前逐渐普及。但由于血液分析仪不能完全将血细胞与其他类似大小的物质区别开来，因此计数结果有时仍需目视显微镜计数法作校正，因而国内外仍将目视显微镜计数法（特别是相差显微镜计数法）作为参考方法。1 定期检查稀释液的质量，检测前先作稀释液空白计数，计数值为零时方可充液计数。2 在充液之前，必须轻轻摇动标本2min或200次以上，但用力不宜造成血小板破坏或产生气泡，引起计数误差。3 血小板如成族

26、分布，应重新采血复查。溶血欠佳时，应更换稀释液或用200倍稀释法计数整个中间大方格内的全部血小板数，最后计算出每升血液中的血小板数量。4 如果血小板悬液冲入计数板后时间较长，血小板会失去光泽而不易辨认，因此应掌握好计数时间。5 每份标本最好计数2次，若计数之差在10以内，取其均值报告。若计数之差大于10，应作第3次计数，取2次相近结果的均值报告。6 草酸铵质量必须是AR级或GR级，若用CP级溶血效果差。（100300）第二章 尿液常规检验综合评价实验【检验流程】尿液有形成分检查尿液化学检查尿液理学检查检验结果综和平价及临床意义探讨实验一 尿葡萄糖定性检查一班氏法【目的】 掌握尿葡萄糖定性的班氏

27、（Benidict）法。【原理】 葡萄糖或其他还原糖的醛基在热碱性溶液中，能将班氏试剂的兰色硫酸铜还原为黄色的氢氧化亚铜，进而形成红色氧化亚铜沉淀。【器材】 试管架、中试管（12mm100mm）、滴管、试管夹、酒精灯。1甲液 枸橼酸钠（Na3C6H5O72H2O）8.5g，无水碳酸钠76.4g，蒸馏水700ml，加热助溶。2乙液 硫酸铜（CuSO45H2O）13.4g，蒸馏水100ml，加热助溶。冷却后，将乙液缓慢加入甲液中，不段混匀，冷却至室温后补充蒸馏水1000ml/、。如溶液不透明则需要过滤，煮沸后出现沉淀或变色则不能应用。【标本】 新鲜尿液。1鉴定班氏试剂质量 取中号试管1支，加入班氏试剂2.0ml，摇动试管徐徐加热至沸腾，观察试剂有无颜色及性状变化，若试剂仍为透明蓝色，可进行以下实验。2尿液 向班氏试剂中加离心后的尿液0.2ml（约4滴），混匀。3加热煮沸 继续煮沸12min，或置沸水浴5min。自然冷却。4判断结果 判断结果见下表表 班氏法糖定性实验结果判断 反应现象报告方式葡萄糖含量（mmol/L）蓝色不变 5.6蓝色中略带绿色，但无沉淀 +- 5.611.2蓝色，伴少许黄绿色沉淀 + 28较多黄绿色沉淀，以黄为主 + 2856土黄色浑浊，有大量沉淀 + 57112大量棕红色或砖红色沉淀