齐口裂腹鱼GtHRⅡ基因的克隆及其序列分析毕业设计论文Word格式.docx

1、无规则卷曲结构占23.33%。【讨论】试验得出齐口裂腹鱼GtH-R基因的保守性高，为进一步研究齐口裂腹鱼的繁殖调控机制提供了一些基础数据。关键词：齐口裂腹鱼；促性腺激素；促性腺激素受体；序列分析Cloning and sequence analysis GtH-Rgene in the Schizothorax prenantiAnimal science and technology of college Aquaculture education Liu YongGuiGuidance teachers: Jiang DongMei Experimental teachersAbstrac

2、t: Objective By cloning and sequence analysis GtH-R gene of Schizothorax prenanti pituitary tissue , study of Schizothorax prenanti gonadotropin hormone receptorgene sequence features and functional properties. Method The total RNA was extracted and amplified by reverse transcription PCR, the amplif

3、ied product recovery to complete for cloning and sequencing. Results Schizothorax prenanti GtH-R objective fragment length obtained in this experiment is 696 bp, the nucleic acid sequence similarity with Danio rerio as 93%, while the amino acid sequence compared to Danio rerio, similarity is as high

4、 as 97%; protein sequence analysis showed: 61.43% alpha helix structure of GtH-R II protein; beta folding structure for 15.24%; random coil structure accounted for 23.33%. Conclusion The results show Schizothorax prenanti GtH-Rgene conservative high, also provides some basic data for further study o

5、f Schizothorax prenanti reproductive regulation mechanism.Key words: Schizothorax prenanti; gonadotropin hormone; gonadotropin hormone receptor ; sequence analysis 早期研究认为，鱼类中只有一种类似LH的促性腺激素，直到20世纪70年代中期，加拿大学者Idferlz等人在改进促性腺激素（Gonadotropin Hormone,GtH）的纯化技术后，从鲤鱼、大麻哈鱼等鱼的脑垂体中发现了两种不同类型的GtH，即GtH和GtH，功能研究表

6、明，GtH和GtH分别对应于哺乳动物的FSH和LH1；而到1999年Yuichi Oba等用纯化的GtH和GtH证明大麻哈鱼的性腺存在着两种类型的GtH受体（Gonadotropin Hormone Receptor, GtH-R），分别称为GtH-R和GtH-R2,3，随后的研究进一步证实了鱼类GtH-R的二元性，结构和功能分析显示，它们分别对应于哺乳动物的促卵泡激素受体（FSH-R）和促黄体素受体（LH-R）4-8。LH在鱼类称为促性腺激素（Gonadotropin Hormone, GtH），它的主要功能是促进卵母细胞的成熟、排卵和卵巢类固醇激素的合成；参与调控精巢中类固醇激素的生成及间

7、质细胞的分化，在精子发生的最后几个时期起主要作用9-11。对其它鱼的研究表明，GtH在体内的重要生理功能由促性腺激素受体（Gonadotropin Hormone Receptor ,GtH-R）介导，性腺中GtH主要在排卵前期滤泡的膜细胞层和颗粒细胞层以及精巢的间质细胞中表达12-14。目前，编码FSH和LH这两种受体的基因已经从一些硬骨鱼类的性腺中得到克隆，例如罗非鱼（Oreochromis niloticus）、斑点叉尾鮰（Letulurus pinctatus）、非洲鲶鱼（Clarias gariepinus）、斑马鱼（Danio rerio）、日本鳗鲡（Anguilla japoni

8、ca）、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）和鳙鱼（Hypophthalmichthys nobilis）等15。令人感兴趣的是，鱼类中GtH基因除了在性腺中有丰富的表达外，在非性腺组织中也有少量或微量表达3,16；但迄今为止还尚未见有对齐口裂腹鱼GtH-R基因的克隆及序列研究，因此，本试验通过对齐口裂腹鱼GtH-R基因的克隆及序列分析，阐明促性腺激素受体在齐口裂腹鱼生殖周期的生理作用, 以期为阐明齐口裂腹鱼繁殖调控机制提供科学依据。1 材料与方法1.1 试验材料选取的齐口裂腹鱼平均体长为3040cm； 平均体重为0.51.0kg。采集齐口裂腹鱼垂体样品，置于液氮中速冻，然

9、后转移至-80超低温冰箱中保存备用。1.2 试剂和仪器DNA回收试剂盒、pMD18-T载体、DL2000 bp DNA Marker，反转录酶和Taq酶购自宝生物公司；-80低温冰箱（Thermo）、PCR仪（Bio-Rad）、高速冷冻离心机（Thermo）、凝胶成像系统（Bio-Rad）、DYY-III-68型稳压流电泳仪、紫外分光光度计（Shimadzu）。Typtone、Yeast Extract、NaCK琼脂糖、琼脂粉、氨节青霉素、IPTG、X-Gal、DEPC及其他生物试剂均为进口或国产分析纯试剂。本实验引物由华大基因有限公司合成。1.3 总RNA的提取 用Trizol法按照试剂盒说

10、明书的步骤提取总RNA，本实验所用离心管、枪头和水均经0.1 %焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）过夜处理，高压灭菌后烘干处理。用DEPC处理水配置溶液。提取时取出样品后立即在低温下研磨裂解组织，本实验提取RNA的过程要求快速准确，避免总RNA的过度降解，试验操作过程中要保证无菌，带上口罩，手套确保RNA不被核酸酶降解。1.4 引物设计与合成根据NCBI上斑马鱼GtH-R的cDNA序列，选取保守区序列，运用Premier 5.0 软件设计引物。GtH-R基因上游引物为5CATCCGTCGAGGACACTTTCGGTA3，下游引物为5ACACATAGCATCCG

11、CAAATCACGAG3，PCR产物长度为696 bp。委托华大基因科技有限公司进行特异性引物合成。1.5 反转录反应 反转录按Invitrogen公司的反转录试剂盒要求进行，得到的cDNA置于-20 冰箱中保存备用或直接用于PCR扩增；此次采用Invitrogen公司生产的MMLV进行反转录反应。1.6 PCR扩增目的基因片段 以cDNA为模板，进行PCR扩增。电泳检测扩增产物，根据检测结果对扩增条件作进一步调整，以获得最佳的目的片段。最终确认PCR产物后，将扩增效果最好的样品产物用于胶回收。1.7 PCR产物回收及克隆测序用Omega凝胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，将稀释的DNA保存在-

12、20冰箱中备用。将PCR回收产物导入到pMD18-T载体中，将其转入大肠杆菌中进行复制，经酶切、PCR鉴定，然后将克隆的产物送华大基因公司测序。1.8 序列分析测序产物经NCBI网站上的VecScreen软件修剪载体序列，获得GtH-R基因编码区序列，应用Blast软件进行相似性比对。利用BioEdit软件进行蛋白质组成、疏水性以及抗原决定簇等相关分析；利用HNN在线软件分析预测氨基酸的二级结构；应用NetPhos2.0分析预测蛋白质的磷酸化位点。2 结果与分析2.1 总RNA提取以齐口裂腹鱼垂体组织提取齐口裂腹鱼垂体组织基因组总RNA采用常规酚-氯仿抽提法，1%琼脂糖凝胶下电泳抽提产物，并于

13、紫外透射仪上进行观察，然后在凝胶成像系统上进行扫描，从图1可见齐口裂腹鱼垂体组织基因组总DNA条带明亮、整齐无拖带。其中28S RNA和18S RNA的条带亮度比值约为l2:1，表明28S的条带比18S的条带亮度高，总RNA降解较少；抽提基因组RNA的纯度和浓度均满足PCR扩增要求。图1 齐口裂腹鱼垂体组织总RNA 1%琼脂糖凝胶电泳图Fig. 1 Total RNA 1% agarose gel electrophoresis of Schizothorax prenanti pituitary tissue2.2 RT-PCR产物检测图2 齐口裂腹鱼GtH-R基因PCR电泳检测图Marke

14、r: DL2000 GtH-R基因引物PCR扩增产物Fig. 2 Electrophoresis pattern of Schizothorax prenanti GtH-Rgene DL2000 GtH-Rgene primer PCR products经1%琼脂糖凝胶电泳检测GtH-R基因引物PCR扩增结果，之后采用凝胶成像系统扫描结果可见图2，显示目的扩增片段长度为696 bp，与引物设计的产物大小一致并且特异性较好；可以满足后续实验的要求。2.3 GtH-R核酸序列比对齐口裂腹鱼斑马鱼鲤鱼图3 齐口裂腹鱼GtH-R基因cDNA部分编码序列及序列分析Fig. 3 The coding s

15、equence analysis of Schizothorax prenanti GtH-Ra part cDNA应用生物信息学软件Lasergene对GtH-R基因编码核酸序列的测序结果与Genbank上斑马鱼序列进行相似性分析，相似性达93.0%；与鲤鱼的相似性为92.6%。2.4 氨基酸相似性比对 图4 齐口裂腹鱼GtH-R氨基酸序列及序列分析Fig. 4 Amino acid sequence analysis of Schizothorax prenanti GtH-R应用生物信息学软件Lasergene对GtH-R基因编码氨基酸序列的测序结果与Genbank上斑马鱼的序列进行相似

16、性分析，相似性达97%以上。2.5 GtH-R氨基酸组成分析图5 齐口裂腹鱼GtH-R基因编码的氨基酸组成Fig. 5 Amino acid of Schizothorax prenanti GtH-R gene encoding 由图5可知在齐口裂腹鱼GtH-R基因编码的氨基酸组成中，其中亮氨酸（Leu）含量为最高，达到了16.45%，赖氨酸（Lys）含量最低，只有0.87%；其它具体的氨基酸组成类型及酸值见下表1。表1 齐口裂腹鱼GtH-R基因编码的氨基酸组成Table 1 Amino acid of Schizothorax prenanti GtH-R gene encodingAmi

17、no AcidSingle letter abbreviationsAcid NumberMol%AlaA187.79MetM62.60CysC114.76AsnN41.73AspDProPGlu E73.03Gln Q104.33PheFArgRGly G156.49SerS166.93HisHThrT135.63IleI208.66ValVLys K20.87Trp WLeuL3816.45TyrY2.6 GtH-R的氨基酸疏水性分析图6 齐口裂腹鱼GtH-R氨基酸的平均疏水性比例X轴表示氨基酸残基数，Y轴表示代表疏水性平均值基线为疏水性平均值，基线以上为疏水区；基线以下为亲水区Fig.

18、6 The average hydrophobicity scale of Schizothorax prenanti GtH-R amino acidX axis represents the number of amino acid residues,Y axis Represents of the average hydrophobicity The baseline for the average hydrophobicity,Above the baseline for the hydrophobic region,Baseline following for hydrophilic

19、 region 由上图可知，本试验获得的GtH-R基因编码的氨基酸疏水性中存在4个疏水区，分别位于第3776、76104、119144、和164207氨基酸残基区间，分别位于第57、90、132和186氨基酸残基附近。2.7 抗原决定簇预测图7 齐口裂腹鱼GtH-R蛋白抗原决定簇预测Fig. 7 Protein epitope prediction of Schizothorax prenanti GtH-R 由上图可知，本试验获得的GtH-R基因编码的氨基酸序列中存在4个抗原决定簇，分别位于第2529、3138、105118、和153166氨基酸残基区间，分别位于第27、34、112和159

20、氨基酸残基附近。2.8 蛋白质二级结构的预测图8 齐口裂腹鱼GtH-R蛋白质二级结构预测h表示螺旋；e表示折叠；c表示无规则卷曲Fig. 8 protein two level structure prediction of Schizothorax prenanti GtH-RH is the alpha helix;E is the beta sheet;C is the random coil对氨基酸序列进行二级结构预测。如上图所示，GtH-R蛋白质中螺旋结构占61.43%；2.9 蛋白质磷酸化位点分析图9 齐口裂腹鱼GtH-R蛋白磷酸化位点预测Fig. 9 Protein phosph

21、orylation site prediction of Schizothorax prenanti GtH-R 由上图可知，GtH-R蛋白中含有4个磷酸化位点，其中Ser（Serine丝氨酸）位点有4个，没有Thr（threonine苏氨酸）、Tyr（tyrosine酪氨酸）的磷酸化位点。3 讨论3.1 齐口腹裂鱼GtH-R的序列特征 应用设计引物对GtH-R基因进行PCR扩增，GtH-R目的片段长度显示为696 bp。试验获得的GtH-R基因编码的氨基酸疏水性中存在4个疏水区，分别位于第57、90、132和186氨基酸残基附近；GtH-R基因编码的氨基酸序列中存在4个抗原决定簇，分别位于第

22、27、34、112和159氨基酸残基附近。无规则卷曲结构占23.33%；只有4个丝氨酸（Ser）的磷酸化位点；齐口裂腹鱼GtH-R基因CDS区序列编码的氨基酸由20种组成，其中赖氨酸（Lys）酸值最低，亮氨酸（Leu）含量为最高。3.2 齐口腹裂鱼GtH-R的功能预测此次试验得到的结果显示：齐口腹裂鱼GtH-R核酸序列与Genbank上斑马鱼序列进行相似性分析，相似性达93.0%，与鲤鱼的相似性为92.6%；说明齐口腹裂鱼促性腺激素受体基因（GtH-R）具有典型的G-蛋白偶联受体结构，包含N-末端序列，GpHR家族特有的7次跨膜螺旋区和C-端胞外区。对齐口腹裂鱼GtH受体基因即GtH-R进行编

23、码氨基酸序列的测序，将GtH-R编码氨基酸序列的测序结果与斑马鱼的序列进行相似性分析，相似性达97%以上具有较高的保守性，说明了促性腺激素受体基因在齐口裂腹鱼进化的过程中以及在调控繁殖性能的过程中都具有重要的作用和相对的稳定性。另外通过氨基酸和蛋白质分析显示：齐口裂腹鱼的GtH-R基因编码的氨基酸组成中，其中亮氨酸（Leu）含量为最高，达到了16.45%，赖氨酸（Lys）含量为最低，只有0.87%；说明亮氨酸在GtH-R形成的过程中可能起重要的作用。氨基酸序列中存在4个抗原决定簇，分别位于第2529、3138、105118、和153166氨基酸残基区间；说明GtH-R蛋白可能是油溶性受体蛋白较

24、大。GtH-R蛋白质中螺旋结构占61.43%，折叠结构占15.24%，无规则卷曲结构占23.33%；说明GtH-R蛋白柔性较好，作为膜受体蛋白，较好的柔性能够使GtH-R蛋白在膜上更好的流动，以确保细胞膜的流动性。试验得出齐口裂腹鱼GtH-R基因的保守性高，同时为进一步研究齐口裂腹鱼的繁殖调控机制也提供了一些基础数据，而具体的繁殖调控机制有待进一步研究。参考文献1 Kraak GVD, Suzuki K, Peter RE, et al. ProPerties of common carp gonadotroPin I and gonadotroPin J. General and ComPa

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27、, Trant J M. Molecular biology of the channel catfish gonadotropin receptors:1. Cloning of a functional luteinizing hormone receptor and preovulatory induction of gene expressionJ. Biol Reprod, 2001,64（3）:1010-1018.5 Kumar R S, Ijiri S, Trant J M. Molecular biology of the channel catfish gonadotropi

28、n receptors: 2. Complementary DNA cloning,functional expression,and seasonal gene expression of the follicle-stimulating hormone receptorJ. Biol Reprod, 2001,65（3）:710-717.6 Swanson P, Dittman A. Pituitary gonadotropins and their receptors in fishC / Advances in Comparative Endocrinology.Italy:Bologna,1997. 841-856.7 Vischer H F, Bogerd J. Cloning and functional characterization of a gonadal luteinizing hormone receptor complementary DNA from the African catfish （Clarias gariepinus）J. Biol Reprod, 2003, 68（1）: 262-271.8 Bojerd J, Blomenrohr M, Andersson E, et al. Dis