水产微生物微生物的培养和观察Word下载.docx

1、纯水w为1.00，溶液中溶质越多，w越小。微生物一般在w为0.600.99的条件下生长，对某种微生物而言，w过低时，微生物生长的迟缓期延长，比生长速率和总生长量减少。微生物不同，其生长的最适w不同（表2-1）。一般而言，细菌生长最适w较酵母菌和霉菌高，而嗜盐微生物生长最适w则较低。 表2-1 几类微生物生长最适w 微生物一般细菌酵母菌霉菌嗜盐细菌嗜盐真菌嗜高渗酵母w091088080076065060二、微生物的营养类型根据碳源、能源及电子供体性质的不同， 可将绝大部分微生物分为四种类型（表2-2）。表2-2 微生物的营养类型营养类型电子供体碳源 能源举例 光能无机自养型H2、H2S、S或H2

2、OCO2光能着色细菌、蓝细菌、藻类 光能有机异养型 有机物 有机物光能 红螺细菌化能无机自养型H2、H2S、Fe2+、NH3或NO2- CO2（无机物氧化） 化学能 氢细菌、硫杆菌、亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）、硝化杆菌属（Nitrobacter）、甲烷杆菌属（Methanobacterium）、醋杆菌属（Acetobacter）化能有机异养型化学（有机物氧化） 能 假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳酸菌属、真菌、原生动物 第二节 培养基培养基是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。无论是以微生物为材料的研究，还是利用微生物生产生物制品，都必须进行培养基的配制，它是微生

3、物学研究和微生物发酵工业的基础。一、 配制培养基的原则1、选择适宜的营养物质2、营养物质浓度及配比合适3、控制pH条件4、控制氧化还原电位5、原料来源的选择6、灭菌处理二、 培养基的类型及应用培养基种类繁多，根据其成份、物理状态和用途可将培养基分成多种类型。1、按成份不同划分（1） 天然培养基这类培养基主要以化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物组成，牛肉膏蛋白胨培养基和麦芽汁培养基就属于此类。（2） 合成培养基合成培养基是由化学成份完全了解的物质配制而成的培养基，也称化学限定培养基，高氏1号培养基和查氏培养基就属于此种类型。配制合成培养基时重复性强，但与天然培养基相比其成本较高，微生物

4、在其中生长速度较慢，一般适于在实验室用来进行有关微生物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌种选育及遗传分析等方面的研究工作。2、根据物理状态划分根据培养基中凝固剂的有无及含量的多少，可将培养基划分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基三种类型。（1） 固体培养基在液体培养基中加入一定量凝固剂即为固体培养基。琼脂是最理想的凝固剂；硅胶是由无机的硅酸钠（Na2SiO3）及硅酸钾（K2SiO3）被盐酸及硫酸中和时凝聚而成的胶体，它不含有机物，适合配制分离与培养自养型微生物的培养基。在实验室中，固体培养基一般是加入平皿或试管中，制成培养微生物的平板或斜面。固体培养基为微生物提供一个营养表面，单个微

5、生物细胞在这个营养表面进行生长繁殖，可以形成单个菌落。固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏等。（2） 半固体培养基半固体培养基中凝固剂的含量比固体培养基少，培养基中琼脂量一般为0.2-0.5%。半固体培养基常用来观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定等。（3） 液体培养基液体培养基中未加任何凝固剂。在用液体培养基培养微生物时，通过振荡或搅拌可以增加培养基的通气量，同时使营养物质分布均匀。液体培养基常用于大规模工业生产以及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究。3、按用途划分（1） 基础培养基尽管不同微生物的营养需求各不相同，但大多数微生物所需的基本营养物质是

6、相同的。基础培养基是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基。牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基。基础培养基也可以作为一些特殊培养基的基础成份，再根据某种微生物的特殊营养需求，在基础培养基中加入所需营养物质。（2） 加富培养基加富培养基也称营养培养基，即在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基，这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。加富培养基一般用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物，如培养百日咳博德氏菌（Bordetella pertussis）需要含有血液的加富培养基。加富培养基还可以用来富集和分离某种微生物，这是因为加富培养基含有某种微

7、生物所需的特殊营养物质，该种微生物在这种培养基中较其他微生物生长速度快，并逐渐富集而占优势，逐步淘汰其他微生物，从而容易达到分离该种微生物的目的。从某种意义上讲，加富培养基类似选择培养基，两者区别在于，加富培养基是用来增加所要分离的微生物的数量，使其形成生长优势，从而分离到该种微生物；选择培养基则一般是抑制不需要的微生物的生长，使所需要的微生物增殖，从而达到分离所需微生物的目的。（3） 鉴别培养基鉴别培养基是用于鉴别不同类型微生物的培养基。在培养基中加入某种特殊化学物质，某种微生物在培养基中生长后能产生某种代谢产物，而这种代谢产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征性

8、变化，根据这种特征性变化，可将该种微生物与其他微生物区分开来。鉴别培养基主要用于微生物的快速分类鉴定，以及分离和筛选产生某种代谢产物的微生物菌种。（4）选择培养基选择培养基是用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。第三节 微生物的分离和纯培养一、 无菌技术微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微

9、生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。在分离、转接及纯培养时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术，它是保证微生物学研究正常进行的关键。1、微生物培养的常用器具的灭菌试管、玻璃烧瓶、平皿等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前必须先行灭菌，使容器中不含任何生物。培养基可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采

10、用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。而平皿是由正反两平皿互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。2、无菌接种操作用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中最常用的基本操作。由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作，或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作。操作箱或操作室内的空气可在使用前一段时间内用紫外灯或化学药剂灭菌。有的无菌室通无菌空气维持无菌状态。用以挑取和转接微生物材

11、料的接种环及接种针，一般采用易于迅速加热和冷却的镍铬合金等金属制备，使用时用火焰灼烧灭菌。而移植液体培养物可采用无菌吸管或移液枪。二、用固体培养基分离和纯培养1、稀释倒平板法先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1,000、.），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。2、涂布平板法

12、由于将含菌材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。3、平板划线法用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，

13、可在平板表面得到单菌落。4、稀释摇瓶法用固体培养基分离严格厌氧菌有它特殊的地方。如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行，它是稀释倒平板法的一种变通形式。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。进行单菌落的挑取和移植，需先用一只

14、灭菌针将液体石蜡-石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。三、用液体培养基分离纯培养对于大多数细菌和真菌，用平板法分离通常是满意的，因为它们的大多数种类在固体培养基上长得很好。然而迄今为止并不是所有的微生物都能在固体培养基上生长，例如一些细胞大的细菌、原生动物和显微藻类等，这些微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。通常采用的液体培养基分离纯化法是稀释法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生

15、物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了，得到纯培养物的机率就会急剧下降。因此，采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。四、单细胞（孢子）分离法对于较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体，并在大量的灭菌培养基中转移清洗几次，除去较小微生物的污染。这项操作可在低倍显微镜，如解剖显微镜下进行。对于个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下进行。目前，市场上有售的显微操作仪种类很多，一般是通过机械、空气或油压传动装置来减小手的动作幅度，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细

16、胞或孢子以获得纯培养。在没有显微操作仪时，也可采用一些变通的方法在显微镜下进行单细胞分离，例如将经适当稀释后的样品制备成小液滴在显微镜下观察，选取只含一个细胞的液体来进行纯培养物的分离。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。第四节 显微技术微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术。一般必须借助显微镜放大系统的作用才能看到微生物的个体形态和内部构造。除了放大外，决定显微观察效果的还有二个重要的因素，即分辨率和反差。分辨率是指能辨别两点之间最小距离的能力，而反差是指样品区别于背景的程度，它们与显微镜的自身特点有关，但也取决于进行显微观察

17、时对显微镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术，这就是显微技术。一、显微镜的种类及原理1、普通光学显微镜现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。一般的显微镜都可配置多种可互换的光学组件，通过这些组件的变换可改变显微镜的功能，如明视野、暗视野、相差等。对任何显微镜来说，分辨率是决定其观察效果的最重要指标。光学显微镜在使用最短波长的可见光（l=450nm）作为光源时在油镜下可以达到其最大分辨率，0.18 mm（表3-1）。由于肉眼的正常分辨能力一般为 0.25 mm左右，因此光学显微镜有效的最高总放大倍数只能达到1,00

18、01,500倍，在此基础上进一步提高显微镜的放大能力对观察效果的改善并无帮助。表 3-1 不同显微镜物镜的特性比较物 镜 特性 搜索物镜 低倍镜 高倍镜 油镜 放大倍数数值孔径值焦深工作距离蓝光（450 nm）时可以达到的分别率40.1040 mm17-20 mm2.3 mm 100.2516 mm4-8 mm0.9 mm 40-450.55-0.654 mm0.5-0.7 mm0.35 mm 90-1001.25-1.41.8-2.0 mm0.1 mm0.18 mm 2、荧光显微镜有些化合物（荧光素）可以吸收紫外线并转放出一部分为光波较长的可见光，这种现象称为荧光。因此，在紫外线的照射下，发

19、荧光的物体会在黑暗的背景下表现为光亮的有色物体，这就是荧光显微技术的原理。由于不同荧光素的激发波长范围不同，因此同一样品可以同时用二种以上的荧光素标记，它们在荧光显微镜下经过一定波长的光激发发射出不同颜色的光。荧光显微技术在免疫学、环境微生物学、分子生物学中应用十分普遍。3、透射电子显微镜1933年，德国人E. Ruska 制成了世界上第一台以电子作为“光源”的显微镜-电子显微镜。在理论上，电子波的波长最短可达到0.005 nm，所以电子显微镜的分辨能力要远高于光学显微镜。几十年来，电子显微技术发展很快，应用也日益广泛，对包括微生物学在内的许多学科的进步都起了巨大的推动作用。4、扫描电子显微镜

20、扫描电镜主要被用于观察样品的表面结构。由于电子束孔径角极小，扫描电镜的景深很大，成像具有很强的立体感。与扫描电镜相比，透射电镜景深较小，一般只能观察切成薄片后的二维图象。二、显微观察样品的制备样品制备是显微技术的一个重要环节，直接影响着显微观察效果的好坏。一般来说，在利用显微镜观察、研究生物样品时，除要根据所用显微镜使用的特点采用合适的制样方法外，还应考虑生物样品的特点，尽可能地使被观察样品的生理结构保持稳定，并通过各种手段提高其反差。1、光学显微镜的制样光学显微镜是微生物学研究的最常用工具，有活体直接观察和染色观察二种基本使用方法。（1）活体观察可采用压滴法、悬滴法及菌丝埋片法等在明视野、暗

21、视野或相差显微镜下对微生物活体进行直接观察。其特点是可以避免一般染色制样时的固定作用对微生物细胞结构的破坏，并可用于专门研究微生物的运动能力、摄食特性、及生长过程中的形态变化如细胞分裂、芽孢萌发等动态过程。压滴法：将菌悬液滴于载玻片上，加盖盖玻片后立即进行显微镜观察；悬滴法：在盖玻片中央加一小滴菌悬液后反转置于特制的凹玻载片上后进行显微镜观察。为防止液滴蒸发变干，一般还应在盖玻片四周加封凡士林；菌丝埋片法：将无菌小块玻璃纸铺于平板表面，涂布放线菌或霉菌孢子悬液，经培养，取下玻璃纸置于载玻片上，用显微镜对菌丝的形态进行观察。（2） 染色观察一般微生物菌体小而无色透明，在光学显微镜下，细胞体液及结

22、构的折光率与其背景相差很小，因此用压滴法或悬滴法进行观察时，只能看到其大体形态和运动情况。若要在光学显微镜下观察其细致形态和主要结构，一般都需要对它们进行染色，从而借助颜色的反衬作用提高观察样品不同部位的反差。染色前必须先对涂在载玻片上的样品进行固定，其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上，二是增加其对染料的亲和力。常用酒精灯火焰加热和化学固定二种方法。固定时应注意尽量保持细胞原有形态，防止细胞膨胀和收缩。2、电子显微镜的制样生物样品在进行电镜观察前必须进行固定和干燥，否则镜筒中的高真空会导致其严重脱水，失去样品原有的空间构型。此外，由于构成生物样品的主要元素对电子的散射与吸收的能力均较

23、弱，在制样时一般都需要采用重金属盐染色或喷镀，以提高其在电镜下的反差，形成明暗清晰的电子图象。（1） 透射电镜的样品制备电子的穿透能力有限，因此透射电镜采用覆盖有支持膜的载网来承载被观察的样品。最常用的载网是铜网，也有用不锈钢、金、银、镍等其它金属材料制备的载网。而支持膜可用塑料膜（如火棉胶膜、聚乙烯甲醛膜等），也可以用碳膜或者金属膜（如铍膜等）。尽管微生物的个体通常都极其微小，但除病毒外，微弱的电子束仍无法透过一般微生物如细菌的整体标本，需要制作成100nm以下厚度的超薄切片，方能看清其内部的细微结构。此外，从细菌、立克次氏体、螺旋体、病毒等病原体与宿主细胞的关系，对宿主细胞引起的超微形态的

24、改变，以及如病毒对宿主细胞的吸附、进入、繁殖等机理的研究，也都需要将宿主的组织或培养细胞制作超薄切片后才能用透射电镜观察。可以说，超薄切片技术是生物学中研究细胞及组织超微结构的最常用、重要的电镜样品制备技术，其基本操作操作步骤如下：取样固定脱水浸透与包埋切片捞片染色观察。（2） 扫描电镜的样品制备扫描电镜的结构特点是利用电子束作光栅状扫描以取样品的形貌信息。因此，其样品制备方法比透射电镜要简单，它主要要求样品干燥，并且表面能够导电。对大多数生物材料来说，细胞含有大量的水分，对表面不导电，所以观察前必须进行处理，去除水分，对表面喷镀金属导电层。在这过程中必须始终保持样品不变形，这样，最后的观察才

25、能反映样品本来面目。保持样品形状的主要关键是样品干燥。干燥方法有自然干燥、真空干燥、冷冻干燥和临界点干燥等。其中临界点干燥的效果最好，其原理是利用许多物质，如液态CO2，在一个密闭容器中达到一定的温度和压力后，气液相面消失（即所谓的临界点状态）的性质，使样品在没有表面张力的条件下得到干燥，很好地保持样品的形态。干燥、喷镀金属层后的样品便可用于观察。第五节 微生物菌种的保藏菌种保藏是指在广泛收集实验室和生产菌种、菌株的基础上，将它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不污染以便于研究、交换和使用的目的。而狭义的菌种保藏的目的是防止菌种退化、保持菌种生活能力和优良的生产性能，尽量减少、推迟负变异、防止死

26、亡，并确保不污染杂菌。一、传代培养保藏传代培养与培养物的直接使用密切相关，是进行微生物保藏的基本方法。常用的有琼脂斜面、半固体琼脂柱及液体培养等。采用传代法保藏微生物应注意针对不同的菌种而选择使用适宜的培养基，并在规定的时间内进行移种，以免由于菌株接种后不生长或超过时间不能接活，丧失微生物菌种。在琼脂斜面上保藏微生物的时间因菌种的不同而有较大差异，有些可保存数年，而有些仅数周。经过移接、培养后的斜面，置于4冰箱保藏。每隔13个月后移接一次，继续保藏。移接代数最好不超过34代。每次移接时，斜面数量可以多一些，以延长使用期。二、冷冻保藏将微生物处于冷冻状态，使其代谢作用停止以达到保藏的目的。大多数

27、微生物都能通过冷冻进行保存，细胞体积大者要比小者对低温更敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。其原因与低温会使细胞内的水分形成冰晶，从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。进行冷冻时，适当采取速冻的方法，可因产生的冰晶小而减少对细胞的损伤。当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会长大，故快速升温也可减少对细胞的损伤。冷冻时的介质对细胞的损伤也有显著的影响。例如，0.5mol/L左右的甘油或二甲亚枫可透入细胞，并通过降低强烈的脱水作用而保护细胞；大分子物质如糊精、血清蛋白、脱脂牛奶或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）虽不能透入细胞，但可通过与细胞表面结合的方式而防止细胞膜受冻伤。因此，在采用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各种保护剂以提高培养物的存活率。三、干燥保藏法水份对各种生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥，尤其是深度干燥是微生物保藏技术中另一项经常采用的手段。沙土管保存和冷冻真空保藏是最常用的二项微生物干燥保藏技术。前者主要适用于产孢子的微生物，如芽孢杆菌、放