噬菌体随机肽库 中文说明书 phage display汇总Word文档格式.docx

1、蛋白酶底物的鉴定可通过在随机肽区域的上游加一段亲和tag，然后选用特异性的介质来区分切割和未切割的噬菌体（16）。另外，大的蛋白质分子如：抗体（17）、激素（18）、蛋白酶抑制剂（19）、酶（20）和结合蛋白（21）也可展示在噬菌体上，通过对随机突变文库的筛选，分离出各种具有亲和力或特异性改变的变异株。Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒将随机十二肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白（pIII）上，因而是一个组合文库。所展示的十二肽表达在pIII的N末端，即：成熟蛋白的第一个氨基酸就是随机十二肽的第一个氨基酸, 十二肽后面是一段短小的间隔多肽，由Gly-Gly-Gly-Ser组成，然后是野生型pI

2、II蛋白。该文库含有2.7109个电转化序列，用10 l本品提供的噬菌体进行扩增，每个序列一次可产生55个拷贝，对原始文库进行大量测序（见附录）表明该文库序列具有广泛的多样性，无明显的残基位置偏嗜。建议不要扩增原始文库来进行另外的淘选试验，因为一旦再扩增便会出现序列偏嗜现象。NEB应用本品分别鉴定出了与链霉亲和素和单克隆抗体相结合的共有结合肽序列（见图2）。大量实验证明，任何情况下该文库的复杂度都足以产生多个可编码相同肽基序的DNA序列。图2用Ph.D.-12肽库测定抗原决定簇。用抗?-内啡肽单克隆抗体对Ph.D.-12展示肽文库进行液相淘选，然后用ProteinA-琼脂糖（第1和第3轮淘选）

3、或Protein G-琼脂糖（第2轮淘选）亲和捕获抗体-噬菌体复合物。每轮淘选所选到的结合序列与R-内啡肽的前12个氨基酸残基序列比较列于上图内，共有序列元件用方框示出。结果清楚地显示该抗体的抗原决定簇序列落在R-内啡肽的前四个氨基酸残基（YGGF）处，在第三位有一定的可变性。第三轮筛有一个筛选到的克隆无插入子。培养基和溶液LB培养基：每升含：10 g Bacto-Tryptone，5 g yeast extract, 5 g NaCl。高压灭菌，室温贮存。LB/IPTG/Xgal平板： LB培养基 + 15 g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70时，加入1 ml IPTG/Xgal*，混匀倒

4、平板。平板4避光贮存。顶层琼脂：10 g Bacto-Tryptone，5 g yeast extract, 5 g NaCl, 1 g MgCl26H2O, 7 g琼脂粉。高压灭菌，分成50 ml等份。固体培养基室温贮存，用时微波炉融化。四环素贮液：以20 mg/ml的浓度溶于乙醇中。-20避光贮存。用前摇匀。LB-Tet平板：LB培养基 + 15 g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70时，加入1 ml四环素贮液，混匀倒平板。平板4避光贮存，如果平板显棕色或黑色请勿用。封阻缓冲液：0.1 M NaHCO3 （pH 8.6）, 5 mg/ml BSA, 0.02% NaN3。过滤除菌，4贮存。

5、 TBS: 50 mM Tris-HCl （pH 7.5）, 150 mM NaCl。PEG/NaCl: 20% （w/v） PEG-8000, 2.5 M NaCl。碘化物缓冲液：10 mM Tris-HCl （pH 8.0）, 1 mM EDTA, 4 M NaCl。室温避光贮存。链霉亲和素贮液：将1.5 mg链霉亲和素冻干粉（本试剂盒提供）溶于1 ml 10 mM磷酸钠（pH7.2）、100 mM NaCl、0.02% NaN3溶液中。4或-20贮存，避免反复冻融。*IPTG/Xgal配方：将1.25 g IPTG （isopropyl D-thiogalactoside）和1 g Xg

6、al（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside）溶于25 ml二甲基甲酰胺中。溶液-20避光贮存 常规M13方法M13不是一个裂解性噬菌体，噬菌斑的形成不是由于菌体裂解而是由于细胞生长力减弱所致，因此其噬菌斑是浑浊的而不是清亮的。菌株保存1. 本试剂盒提供的宿主菌是一个强F+菌株，生长迅速，特别适合于M13噬菌体的增殖。尽管ER2738是一个recA+菌株，但我们在使用M13或噬菌粒载体的过程中从未发现有体内重组现象发生。其他F+的商品菌株如：DH5F和XL1-Blue或许可以代替ER2738应用,但未曾用本系统检验过。2. 由于M13是一个雄性特异性大

7、肠杆菌噬菌体，建议用于M13增殖的所有菌液都是从F因子正向选择培养基上挑菌接种的，而不是直接从本试剂盒提供的甘油菌接种培养的。ER2738的F因子上含有一个小转座子，赋予该细胞四环素抗性，因此可以在含四环素的平板上铺板筛选含F因子的细胞。3. 从随产品提供的ER2738甘油菌划线接种LB-Tet平板，倒置平板37培养过夜。用封口膜封闭平板后4避光保存，最长可达一个月。4. 用于感染噬菌体的ER2738菌液既可以在LB也可以在LB-Tet培养基中生长。只要不对培养物进行连续稀释，在非选择性培养基中F因子的丢失并不严重。避免噬菌体污染M13噬菌体的衣壳蛋白pIII通过与受体菌的F性纤毛相结合而介导

8、感染。与野生型噬菌体相比，外源蛋白或多肽融合在pIII蛋白的N端展示明显降低了文库噬菌体的感染力。因此，当有任何野生型噬菌体污染时，每轮淘选试验之间的扩增步骤会强烈倾向于扩增野生型噬菌体，如果同时没有一个强有力的体外噬菌体结合选择程序来避免，即使痕量水平的污染也会在三轮淘选后使淘选出的噬菌体多数为野生型。1. 在本手册所述的所有步骤中均使用带滤芯吸头，可以使污染外界环境中噬菌体的可能性大大降低。2. 由于文库噬菌体源于常规克隆载体M13mp19，其含有lacZ基因，当铺在含IPTG和Xgal的平板上时，噬菌斑将呈蓝色。而外界污染的丝状噬菌体在同样的平板上将呈白色噬菌斑，同时这些噬菌斑还会比文库

9、噬菌体的噬菌斑更大更模糊。因此所有的滴度检测步骤，建议一定要在LB/IPTG/Xgal培养基上铺板，如果有白色噬菌斑，则只挑取蓝色噬菌斑进行测序。测定噬菌体滴度只有当噬菌体的感染复度MOI （multiplicity of infection）值远低于1时（即细胞过量时），噬菌斑的数量才会随着加入噬菌体的量而呈线性增加。正因如此，建议检测噬菌体贮液的滴度时，在感染前进行稀释，而不是在高MOI值的情况下稀释被感染的细胞。低MOI值有助于确保每个噬菌斑仅含一个DNA序列。1. 接种ER2738单菌落于5-10 ml LB培养基中，摇床培养至对数中期（OD600 0.5）。2. 细胞生长时，微波炉融

10、化上层琼脂，分成3 ml等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管。保存于45备用。3. 37预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。4. 在LB中准备10倍系列稀释的噬菌体。 建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108-1011；未扩增的淘选洗脱物：101-104。每个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染。5. 当菌体培养物达对数中期，分成200 l等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。6. 每管加入10 l不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5 min。7. 将感染细胞加入45预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37预

11、温的LB/IPTG/Xgal平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。8. 待平板冷却5 min后，倒置于37培养过夜。9. 检查平板，计数有102个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10 l噬菌体的空斑形成单位（pfu）滴度。淘选程序最简单直接的淘选方法有：直接将靶分子包被于塑材表面（通过非特异的疏水作用或静电相互作用），洗去过量的未吸附分子，然后将噬菌体库覆盖在已包被的靶分子的表面。根据靶分子的不同，直接包被法偶尔会导致配体结合位点难以进入，这或许是由于分子的立体封阻或许是由于靶分子表面的部分变性而引起。在这些情况下，可先将噬菌体库在液相中与靶分子进行预结合，然后将噬菌体

12、-靶分子复合物亲和捕获于链霉亲和素包被的表面（见15页）或其他亲和介质上（见16页）。由于直接包被法相对简单，建议先按以下步骤试用此方法。如果没有淘选到明显的共有结合序列，再进行上述液相结合试验中的一种。第一天 根据需同时在其上进行文库淘选的靶分子的数量和种类不同，淘选试验可以在单个灭菌聚苯乙烯培养皿、12-或24-孔板、96孔微量板中进行。每种靶分子至少包被一个板（或一个孔）。下述方法中给出的量是6015 mm培养皿的用量，括号中为微孔板的用量，其他中等尺寸的孔相应地调整此用量。但每种情况下，加入的噬菌体数量都是相同的：1.51011个病毒子。1. 准备100 g/ml的靶分子溶液（溶于0.

13、1 M pH 8.6的NaHCO3）。 如果需要稳定靶分子，也可使用其他相似离子强度的缓冲液（含金属离子等）。2. 每板（孔）加入1.5 ml（微孔板每孔150 l）上述溶液，反复旋转直到表面完全湿润（小心不要使溶液溅出）。3. 在增湿容器（如：排列有湿纸巾的可封口塑料盒）中4轻微震荡，孵育过夜。平板可在此容器中4贮存备用。第二天 4. 挑ER2738单克隆（噬菌体滴度测定时铺的板）于10 ml LB液体培养基中。如果同一天扩增洗脱的噬菌体，也可将ER2738接种于20 ml LB液体培养基，这时请用250 ml三角瓶（不要用50 ml锥形管）。37剧烈震荡培养。5. 倒掉每板中的包被液，板倒

14、置在干净的纸巾上用力拍甩以除去残余溶液。每板（或孔）加满封阻液，4作用至少1 hr。6. 按5中所述方法除去封阻液。再用TBST （TBS+0.1% v/v Tween-20）缓冲液快速洗板6次。每次均旋转以使板或孔的底部及边缘均被洗到，倾去缓冲液，倒置在干净纸巾上拍甩以除去残余溶液（或使用自动洗板机）。此操作要快以避免板干燥。7. 用1 ml（微孔板则用100 l）的TBST缓冲液稀释41010的噬菌体（即10 l的原始文库），然后加到已包被好的板上，室温温和摇动10-60 min。8. 倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液。9. 按6中所述方法用TBST缓冲液洗板10

15、次，每次换一干净纸巾以避免交叉污染。10. 根据所研究的分子间相互作用，用1 ml（微孔板则用100 l）适当的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体。一般情况下，是将靶分子的已知配体以0.1-1 mM的浓度溶于TBS溶液中或者用游离靶分子溶液（100 g/ml溶于TBS中）从固定靶分子上将结合的噬菌体竞争性洗脱下来。室温温和摇动10-60 min，将洗脱液吸入另一干净微量离心管中。10a.另外，也可用非特异性缓冲液如0.2 M Glycine-HCl （pH 2.2）, 1 mg/ml BSA来分离已结合的分子：温和摇动10 min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中。然后再用150 l（微量孔则用15 l

16、）1M HCl（pH 9.1）中和上述洗脱液。11. 按上述常规M13方法中的程序测定少量（1 l）洗脱物的滴度。如需要，可对第一或第二轮洗脱物滴度测定所得的噬菌斑进行测序，方法见下述。（必要时可将剩余洗脱物4贮存过夜，第二天扩增。这时，可将ER2738在LB-Tet培养基中过夜培养，第二天将培养物1:100稀释于20 ml LB中（用250 ml三角瓶盛装），加入未扩增洗脱物。37剧烈摇动培养4.5 hr，继续第13步）。12. 剩余洗脱物应当被扩增：将洗脱物加入到20 ml ER2738培养物中（菌体应当处于对数前期），37剧烈摇动培养4.5 hr。13. 将培养物转入一离心管中，然后，4

17、 10,000 rpm离心10 min。上清液转入另一离心管中，再离心。14. 将上清的上部80%转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。让噬菌体4沉淀至少60 min，最好过夜。第三天 15. 410,000 rpm离心PEG沉淀15 min。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。16. 沉淀物重悬于1 ml TBS中，悬液转入微量离心管中，4离心5 min使残余细胞沉淀。17. 上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育15-60 min。 4离心10 min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清。18. 沉淀物重悬于200 l TBS,

18、 0.02% NaN3中。离心1 min，沉淀任何残余的不溶物。上清转入新鲜管中。此即为扩增后的洗脱物。19. 根据上述常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物。4贮存。20. 再包被一个板或孔准备第二轮淘选时用，见第8页步骤1-3。第四和第五天 21. 计数板上蓝斑数确定滴度。用这个值来计算相应于1-21011 pfu的加入量。如果滴度太低，接下来的几轮淘选可用低至109 pfu的噬菌体加入量进行试验。22. 进行第二轮淘选：用第一轮淘选扩增的洗脱物中1-21011 pfu的噬菌体量重复步骤4-18，在清洗步骤中将Tween的浓度增至0.5% （v/v）。23. 在LB

19、/IPTG/Xgal平板上测定第二轮淘选所得洗脱物扩增后的滴度。24. 再包被一个板或孔准备第三轮淘选时用，见第8页步骤1-3。第六天25. 进行第三轮淘选：用第二轮淘选扩增的洗脱物中21011 pfu的噬菌体量重复步骤4-11，清洗步骤中同样用0.5% （v/v）的Tween。26. 在LB/IPTG/Xgal平板上测定第三轮淘选所得洗脱物未扩增时的滴度。第三轮洗脱物不必再扩增，除非还要进行第四轮淘选（可选步骤，见附录）。滴度测定时得到的噬菌斑可做测序用：只要注意平板培养时间不要超过18小时，培养时间过长容易出现缺失。其余洗脱物4贮存。27. 挑一ER2738单克隆于LB-Tet培养基中培养

20、过夜（不要接种稀释后的铺板培养物）。对照淘选试验按照上述程序，以链霉亲和素作为靶分子，在封阻液中加入0.1 g/ml的链霉亲和素以结合BSA中混有的少量生物素。用0.1 mM的生物素（溶于TBS中）洗脱结合噬菌体，至少作用30 min。经三轮富集/扩增后，得到的链霉亲和素结合肽的共有序列应当含有如下基序： His-Pro-Gln （HPQ） （8）。图3随机十二肽-gIII融合蛋白的N末端序列。融合蛋白表达时N端有一段信号肽前导序列，蛋白分泌后前导序列被切除，使随机肽直接位于成熟蛋白的N末端，下箭头指示前导序列的切割位点。-28和-96引物的互补位置也在图中标出。图4精简遗传密码表。文库的随机

21、序列区域仅用32个密码子编码所有20种氨基酸。这使单密码子氨基酸的出现频率相对较高，同时排除了三个终止密码子中的两个。在构建该文库的菌株中，琥珀终止子TAG（*）可被Gln抑制。结合克隆的特征鉴定噬菌斑的扩增 1. 将ER2738过夜培养物按1:100稀释接种于LB培养基，分1 ml到培养管中。每个要鉴定的克隆一管。一般情况下，由第三轮淘选物中取10个克隆便足以检测结合肽中的共有序列。 2. 用灭菌牙签或吸头，挑一蓝色噬菌斑到上述1 ml培养管中。注意：要从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选，以便保证每个被挑的噬菌斑仅含一个DNA序列。3. 37摇床培养4.5-5 hrs（不要过长）。4. 备

22、选步骤。除测序单个克隆外，也可以对整个被选噬菌体集合进行测序。这样只通过一个步骤就可以得到共有结合序列，但这种情况只是当公有序列元件出现在每个克隆的12残基“框架”内相同位置的时候。加10 l未扩增的洗脱物到1 ml稀释的过夜培养物中，37摇床培养4.5-5 hrs。5. 培养物转入微量离心管中，离心30 sec。上清转入以新鲜管中，再离心。用移液器将80%的上清转入新鲜离心管，此即为扩增噬菌体贮液，可以4贮存几个星期而对滴度影响不大。长期贮存应用灭菌甘油1:1稀释后，-20贮存。测序模板的快速纯化（22）本方法非常快速，无需酚或层析，可以产生足够纯的模板进行手工或自动双脱氧测序。1. 按上述

23、方法进行噬菌斑扩增，在第一步离心后，将500 l含噬菌体上清转入一新鲜离心管。2. 加200 l PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10 min。3.离心10 min，弃上清液。4. 短暂离心，小心吸去残余上清。5. 沉淀物彻底重悬于100 l碘化物缓冲液中，加入250 l乙醇。室温温育10 min。短时间的室温温育使单链噬菌体DNA沉淀而大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。6. 离心10 min，弃上清。用70%的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。7. 沉淀重悬于30 l TE 10 mM Tris-HCl （pH 8.0）, 1 mM EDTA中。8. 5 l的上述模板溶液足够进行35S或33P标记的

24、手工双脱氧测序, 或染料标记的自动循环双脱氧测序。根据测序方法的不同, 适当增减模板用量。测序指南1. 建议用-28引物进行手工双脱氧测序，而-96引物应用于自动测序。2. 所读序列相应于模板的反义链。然后将互补链写出，与图3中的上链对照进行检查。检查随机区域内每个密码子的第三位是否为G或T。根据图4所列的遗传密码表由此链翻译得到氨基酸序列。3. 本文库的宿主菌为ER2738 （supE）, 在此菌株中，终止密码子TAG被谷氨酰胺（Gln）所抑制。因此翻译时，应将TAG翻译为谷氨酰胺（见图4）。用ELISA检测所选多肽对靶分子的结合1. 在扩增噬菌斑进行DNA测序（见12页）时，将所剩余的含噬

25、菌斑上清4保存。2. 对每一个要鉴定的噬菌斑克隆，接种一管ER2738于20 ml LB培养基中，37培养至稍微浑浊。或者，也可以将过夜培养的ER2738按1:100的比例稀释于20 ml LB培养基中。3. 于每管ER2738培养液中加入5 l噬菌体上清，37通气培养4.5hrs。4. 上述培养物转入离心管中，10,000 rpm离心10 min。上清移入新鲜离心管，再离心。5. 取80%上清于新鲜离心管中，加1/6体积的PEG/NaCl。4沉淀至少1 hr或过夜。6. 4 10,000 rpm 15 min离心沉淀，弃上清，再进行短暂离心，吸去残余上清。7. 沉淀重悬于1 ml TBS中，

26、悬液转入微量离心管，4离心5 min除去沉淀中的残留细胞。 8. 上清转入新鲜微量离心管，加1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上作用15-60 min。 4离心10 min，弃上清，再进行短暂离心，吸去残余上清。9. 沉淀重悬于50 l TBS中，按6-7页常规M13方法中所述测定噬菌体滴度。10. 用100-200 l 100 g /ml的靶分子（溶于0.1 M pH 8.6 NaHCO3中）包被ELISA板的每个孔，每个待鉴定克隆一排包被孔。在密封的湿盒（如：排有湿纸巾的封口塑料盒）中4包被过夜。11. 甩出多余靶分子溶液，并倒置平板在纸巾上拍甩除去残液。每孔加满封阻液。另外，每个待鉴

27、定克隆的一排未包被孔也加入封阻液，以检测所选序列对BSA包被塑料板的结合力。在将噬菌体加入靶分子包被板前，还要再准备一个微量滴定板进行噬菌体的系列稀释，这个板也要封阻。单独在另外一个封阻板中进行稀释是为了避免稀释过程中有噬菌体吸附到靶分子上。最后，所有封阻板4封阻1-2 hrs。12. 甩出封阻液，用1TBS/Tween洗板6次，每次均倒置平板在干净纸巾上拍甩去洗液，Tween浓度应当与淘选清洗步骤中所用浓度相同。13. 在单独的封阻板中每孔预先加入200 l TBS/Tween，由每排第一孔加入1012个病毒子开始对噬菌体进行4倍系列稀释至第12孔2105个病毒子。14. 用多通道移液器将每排稀释好的噬菌体加入包被有靶分子的板中。室温震荡作用1-2 hrs。15. 用1TBS/Tween洗板6次（同