胡椒中抑菌成分提取及工艺优化Word文件下载.docx

1、1.1 实验材料 51.1.1 原材料 51.1.2 菌种 51.1.3试剂 51.2仪器设备 51.3 实验方法 51.3.1 样品预处理 51.3.2 提取方法选择 61.3.3 提取溶剂选择 61.3.4 提取时间选择 61.3.5 浸泡时间选择 61.3.6 乙醇溶解液配制 61.4抑菌试验 61.4.1 试验前准备 61.4.2 抑菌试验 72 结果及分析 72.1 白胡椒结果分析 82.1.1 白胡椒提取方法选择结果 82.1.2 提取溶剂选择结果 82.1.3 提取时间选择结果 82.1.4 浸泡时间选择结果 92.1.5 白胡椒的工艺优化 102.2 黑胡椒结果分析 132.2

2、.1 黑胡椒提取方法选择结果 132.2.2 提取溶剂选择结果 142.2.3 提取时间选择结果 142.2.4 浸泡时间选择结果 142.2.5 黑胡椒的工艺优化 153 结论 18参考文献 19致谢.20前 言 胡椒属胡椒科常绿藤本植物胡椒的接近成熟或成熟果实，它只能生长在年降水量2500mm的热带地区，生长期中还需要一段干热的间隔期，现广泛栽培于热带国家1。胡椒可精深加工胡椒碱、胡椒油树脂等系列产品，在食品工业和医药工业上具有很多十分重要的用途2。胡椒一般加工成胡椒粉，用于烹制内脏、海味类菜肴或用于汤羹的调味，具有祛腥提味的作用。胡椒因采收期和处理方法的不同分为黑胡椒和白胡椒，两者都是食

3、物的调味品，然而白胡椒的味道较不刺激3。胡椒已成为全球进出口贸易最大和最有潜力的特种香料油料产业作物，胡椒碱和胡椒油树脂产业在美国、欧盟各国、日本、韩国等许多发达国家已形成成熟的市场，并且主宰着全球胡椒产业的发展1。胡椒在中医上属辛热纯阳之物，适合肠胃寒湿人士服用，能健胃及驱除肠道积气。另一方面胡椒亦可治疗肠胃温热、胃寒、痰多、肚痛反胃、食欲不振、牙痛等症状，以至解热、利尿及解除虾蟹等所引起之食物中毒4 。胡椒（碱）对蛛网膜下腔出血后迟发性脑血管痉挛有预防作用，其抗血管痉挛作用可能与胡椒碱抑制血浆内皮素-1（ET-1）、促进一氧化氮合成酶（NOS-1）活性有关5 。胡椒具有持久的辛辣味和芳香的

4、挥发油两大优势，在漫长的寒冬里可以减少肉类的腐烂并掩盖住因长期储存而产生的不受人欢迎的味道6。1 实验材料与方法1.1 实验材料1.1.1 原材料白胡椒、黑胡椒，以上香辛料均购自百佳汇超市中兴店。1.1.2 菌种大肠杆菌、黑曲霉、酵母菌，以上菌种为海南大学食品学院微生物实验室提供。1.1.3试剂名称标准厂家无水乙醇分析纯广州化学试剂厂氯化钠氢氧化钠化学纯广东汕头市西陇化工厂蛋白胨食品级北京市海淀区微生物培养基制品厂牛肉浸膏上海蓝季科技发展有限公司琼脂1.2仪器设备仪器名称型号超声波清洗机CQ-10广州经济技术开发区明珠电器有限公司电热恒温水浴锅LSY北京市医疗设计厂数显恒温水浴锅B-200上海

5、亚荣生化仪器厂循环水式真空泵SHZ-D（）巩义市英峪予华仪器厂生化培养箱南京实验仪器厂电热恒温鼓风干燥箱101-1-BS上海跃进医疗器械厂立式压力蒸汽灭菌器LS-B50L上海医用核子仪器旋转蒸发仪RE5CS电子天平PL303梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司1.3 实验方法1.3.1 样品预处理将白胡椒和黑胡椒分别置于5060非鼓风烘干1天，待冷却后，粉碎，过40目筛，取筛下物留作样品7。1.3.2 提取方法选择在250mL三角瓶中加入 5.000g样品，然后按料液比 1：20g/mL加入 100mL 95%乙醇，浸泡 4h后分别用超声波提取法7和回流提取法8提取1h。提取结束后用真空泵抽滤，

6、然后置于 60水浴锅中浓缩蒸干，冷却后称重并计算提取率。提取率（%） = %1.3.3 提取溶剂选择在 250mL三角瓶中加入 5.000g样品，然后按料液比1：20g/mL分别加入 100mL 95%乙醇，80%乙醇，60%乙醇，40%乙醇，水，浸泡 4h后黑胡椒及白胡椒分别用各自最佳的提取方法提取1h。1.3.4 提取时间选择在 250mL三角瓶中加入 5.000g样品，然后按料液比 1：20g/mL分别加入最佳提取溶剂，浸泡 4h后黑胡椒及白胡椒分别用各自最佳的提取方法提取 20min、40min、60min、80min、100min、120min。1.3.5 浸泡时间选择20g/mL分

7、别加入最佳提取溶剂，分别浸泡0h、4h、8h、10h、16h，然后黑胡椒及白胡椒分别用各自最佳的提取方法提取。1.3.6 样品溶液液配制将样品提取物用 95%乙醇配制成 3%的样品溶液液，备用。1.4抑菌试验1.4.1 试验前准备制备牛肉膏蛋白胨培养基 9配方：牛肉膏 10.0g、蛋白胨 20.0g、氯化钠 10.0g、琼脂40.0g、水2000mL，pH 7.0。步骤：称取牛肉膏 10.0g、蛋白胨 20.0g放入小铝锅，加入 100mL水置电炉上加热搅拌至牛肉膏和蛋白胨完全溶解。向铝锅内加入 1000mL水， 10.0g 氯化钠和洗净的琼脂，继续搅拌，加热至琼脂完全溶化，补水至 2000m

8、L。用玻棒沾少许液体，测定pH值，用 10%氢氧化钠或 10%盐酸调至pH 7.0。用分装漏斗分装于 3支 18mm180mm试管中，塞好棉塞并用报纸包好，其余的装入 500mL的三角瓶中并用报纸包好。生理盐水配制将 0.9g氯化钠溶于100mL蒸馏水，制成 0.9%的生理盐水，按每管10mL分装于若干试管中，塞好棉塞并用报纸包好，备用。灭菌将已配制的培养基与生理盐水放入121，0.1Mpa的灭菌锅中灭菌20min。试管培养基灭菌后趁热摆放斜面，以备菌种活化时使用。菌种活化 将供试菌种接种于斜面试管内，大肠杆菌置于 37恒温培养箱内培养24h左右，黑曲霉及酵母菌置于 28恒温培养箱内培养 44

9、-48h。菌悬液配制供试菌种于斜面活化后，加入 10ml生理盐水制成含菌数为 106107个/ml的菌悬液，备用10。1.4.2 抑菌试验平板打孔法是固体平板扩散法的其中一种，可以在平板上打一定大小的圆孔，然后把被测物滴入孔内。经培养后在物质扩散所及的范围内出现抑菌圈（或生长圈），测量圈的直径，即可知道被测物的抑菌能力11。每个平板中加入适量培养基，冷却后加入 0.3ml菌悬液涂布均匀，然后用直径为 11cm 的打孔器打孔，吸取 0.1mL样品溶液注入已打好的圆孔中（以95%乙醇为空白），大肠杆菌于 37下培养 24h，黑曲霉和酵母菌于 28下培养 44-48h，测抑菌直径。抑菌直径（mm）

10、= 样品抑菌直径-空白抑菌直径2 结果及分析2.1 白胡椒结果分析2.1.1 白胡椒提取方法选择结果由 1.3.2 的试验操作，结果见下表。表 1 白胡椒不同提取工艺的提取效果及抑菌效果提取方法提取率 （%）抑菌直径（mm）大肠杆菌黑曲霉酵母菌回流法5.863.663.681.01超声波法5.084.387.620.24由表 1 表明，白胡椒用回流法提取，提取率较高，但是用超声波法提取的抑菌效果较好，故白胡椒选择用超声波法进行提取。由于白胡椒的提取物均对酵母菌没有明显的抑菌效果，因此以下试验不进行对酵母菌进行抑菌实验。2.1.2 提取溶剂选择结果根据 1.3.2 的实验结果，白胡椒以超声波提取

11、法进行1.3.3 的试验操作，实验结果见表 2。由表 2可知白胡椒提取率最高的是80%的乙醇溶液，在对大肠杆菌的抑菌试验中，用80%的乙醇溶液提取的抑菌效果最好；对黑曲霉的抑菌效果最好是60%的乙醇溶液。表 2 不同浓度溶剂白胡椒的提取效果及抑菌效果乙醇浓度（%）提取率（%）959.125.385.208010.905.585.95609.207.325.14404.848.813.952.885.691.592.1.3 提取时间选择结果表 3 不同提取时间对白胡椒的提取效果及抑菌效果提取时间（min）208.665.109.109.588.725.9610.266.3910.187.279.

12、666.159.627.641009.326.179.528.441209.426.239.984.50根据 1.3.3 的实验结果，以60%的乙醇溶液为黑曲霉抑菌试验的提取溶剂，以80%乙醇溶液为大肠杆菌抑菌试验的提取溶剂进行 1.3.4 的试验操作，结果见表 3。由表 3 可知白胡椒提取60min时，对大肠杆菌有最佳的提取率和抑菌效果；提取100min时对黑曲霉有最佳的抑菌效果。2.1.4 浸泡时间选择结果根据 1.3.4 的实验结果，以60%的乙醇溶液为黑曲霉抑菌试验的提取溶剂提取100min，以80%乙醇溶液为大肠杆菌抑菌试验的提取溶剂提取60min进行 1.3.5 的试验操作，结果见

13、表 4。由表 4 可知在白胡椒对大肠杆菌的抑菌试验中，浸泡720min时提取率最高的，但抑菌效果最好是浸泡240min；在对黑曲霉的抑菌试验中，提取率最高的是浸泡720min，但抑菌效果最好也是浸泡240min。表 4 不同浸泡时间对白胡椒的提取效果及抑菌效果浸泡时间（min）8.706.128.465.8724010.727.058.846.914809.806.376.6572014.7410.406.779606.2110.346.642.1.5 白胡椒的工艺优化 根据以上单因素实验结果，分别将溶剂浓度X1、浸泡时间X2、提取时间X3对抑菌效果的综合影响，采用DPS数据处理系统设计三因素

14、二次通用旋转组合试验设计，对白胡椒进行工艺优化。试验结果分析均在DPS数据处理软件下运行12。编码因子见表 5，设计方案及结果见表 6。表 5 白胡椒的二次通用旋转组合设计因子水平及编码编码因子水平溶剂浓度%（v/v）X1 X2提取时间（min） X31.68218962392-17133768-1.68265表 6 白胡椒提取条件的三元二次通用旋转组合设计方案及结果试验号x1x2x39.605.235.1929.645.435.16311.445.4145.265.03511.145.375.34611.025.2176.105.28810.365.835.1599.945.84108.30

15、5.225.30119.546.021210.206.13139.885.64148.744.615.79154.905.66164.825.65179.684.875.73189.464.75194.899.344.735.70白胡椒对黑曲霉抑菌效果的回归分析采用DPS系统对白胡椒对黑曲霉抑菌效果进行回归分析得到以下回归方程，试验结果的方差分析见表 7。其回归方程如下：Y=4.82609-0.01004X1-0.12422X2+0.10049X3+0.28011X12+0.26242X22 +0.05908 X32+0.16750 X1X2-0.06000 X1X3-0.05750 X2X3

16、当=0.10显著水平剔除不显著项后，简化后的回归方程：Y=4.82069-0.124422X2+0.10049X3+0.28011X12+0.26242X22+0.05908X32 +0.16750 X1X2-0.06000 X1X3-0.05750 X2X3以抑菌直径为准，将其回归方程用LONGO语言进行分析，得到最佳方案为：乙醇浓度为95%，浸泡时间720min，萃取时间100min。对最佳方案进行验证，得到提取率为 6.92%，抑菌直径为6.48mm，与理论值的6.62mm相差不大，所以可认为其为最佳方案。表 7 白胡椒对黑曲霉抑菌效果的试验结果方差分析变异来源 平方和 自由度 均方 比值F 显著水平p X10.0150.2600.621X22.23039.7090.000X31.45925.988X1211.965213.073X2210.502187.021X320.5329.4790.012X1X22.37542.296X1X30.3055.4270.042X2X30.2804.9840.050回归2.5640.285F2=5.0730.011剩余0.5620.056失拟0.5350.107F1=20.1630.