分子生物学技术在生药鉴定中的应用Word格式文档下载.docx

1、大部分药材经加工、炮制等处理后，往往失去了原来的形态和解剖特征，甚至显微特征也会发生改变，从而使药材的真伪优劣难以鉴别，特别是对一些故意造假、以次充好的药材更是难以鉴别。因此假劣药材、混淆品充斥生药材市场的状况一直未能得到根本改善。复方制剂也难以通过传统的形态鉴别方法来鉴别。近年来，分子生物学技术的应用，使生药材鉴别从器官水平提高到细胞水平和分子水平。2蛋白质电泳技术生物样品中富含蛋白质分子,各种分子电荷性质、电荷数和分子量各不相同,在同一电场作用下,一定时间内各组分泳动的方向、速度和距离也不相同,结合谱带条数和染色不同可以达到鉴别的目的。蛋白质电泳技术简单实用被较早地应用于生药材鉴别中。2.

2、1蛋白质电泳技术在植物性药材鉴定中的应用在植物性药材方面,蛋白质电泳技术在种子类药材的鉴别中得到了较多应用。石俊英等2较早运用聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegel electrophoresis , PAGE）技术对青箱子、沙苑子、小菌香、苍耳子与伪混品等数十种药材进行分析。结果表明:不同种药材的蛋白PAGE图谱差异显著,并具有各自的鉴别特征带。陈振德等3对国产榧属植物种子的蛋白进行了高效毛细管电泳分析,利用电泳图谱区分了榧子、云南榧子等7种榧子,可作为中药榧子的鉴别方法之一。蛋白质电泳技术在非种子类药材的鉴定中也有报道。许重远等4采取高效毛细管电泳技术对生药狗脊、制狗脊及其

3、混淆品黑狗脊的酸性、中性、碱性三种提取液分别进行蛋白多肽电泳检测,黑狗脊与狗脊在三种提取液检测所得图谱中都存在显著差异,生狗脊与制狗脊也可从酸性提取液的图谱中加以区别。2.2蛋白质电泳技术在动物性药材鉴定中的应用 蛋白质电泳技术在动物类药材鉴定方面也有不少报道。张林碧5用此法对家鸡、斑鸠、孔雀、白鹇、鸽等5种鸟类的内金进行了 PAGE 图谱、薄层扫描图谱的比较,不同种鸟类内金的PAGE图谱及其薄层扫描图谱差异明显,可作为内金类药材的鉴别依据。蜥蜴常被用来冒充壁虎,李国锐等6利用SDS - PAGE技术对蜥蜴和壁虎躯体各部分的蛋白图谱分别进行研究,各部分图谱均能有效鉴别两种动物。蛋白电泳应用较早

4、,较为快捷,但生物体蛋白的种类和数量在生物生长发育周期中变化较大,各组织器官也不相同,且样品内蛋白的降解程度也会影响结果,国内采用电泳方法过于单一,不同电泳方法及不同条件下提取蛋白方法的影响因素等极少同时观察,而对未知品种鉴别,仅靠一种电泳谱难以客观评价,因此难以建立标准化图谱,其应用受到了限制。3 DNA分子鉴定DNA分子作为生物遗传信息的直接载体，同种药用植物或动物的每一个体的所有细胞均包含相同的遗传信息，具有相同的遗传物质DNA，它不受气候、土壤等环境影响，也不会随个体发育阶段或因组织器官的不同而不同。因此DNA分子标记技术为鉴别原植物或动物形态已遭到破坏的药材的鉴别提供了新的技术途径。

5、3.1基于聚合酶链反应 （PCR）的鉴别：基于PCR的鉴别方法有随机扩增多态性DNA（RAPD）、任意引物聚合酶链反应（AP-PCR）、微卫星DNA等。如黄璐琦等7应用 RAPD技术对来源于13个种3个变种的天花粉及其类似品，用8个引物分别扩增，得到了清晰、稳定的83条条带，通过聚类分析，把天花粉正品与类似品有效地分成3大类。曹晖等8采用AP-PCR和RAPD方法扩增地胆草、白花地胆草和假地胆草及其商品药材苦地胆草的基因组DNA，获得了可靠的DNA指纹，根据DNA带型差异可鉴别苦地胆及其混淆品。张荣等9用50个随机引物对云南木蓝属的8种生药进行了PCR扩增，其中8个引物扩增成功，有的引物扩增种

6、间差异明显，可以有效地进行鉴别。此外，运用基于PCR的 DNA技术，还进行了野山参与栽培人参（园参）10、西洋参11、西红花及其伪品、冬虫夏草及其伪品、细辛属、石斛属等药材的鉴别。3.2限制性长度多态性分析：将药材的DNA或通过PCR扩增的药材DNA片段，用限制性内切酶消化后，进行限制性片段长度多态性（RFLP,PCR-RFLP）分析，即多态性酶切位点的分析，可以确定基因的种属特异性，从而鉴别药材。山崎真己等12用RFLP方法分析了羽扇豆属药用植物。马小军等13对人参的研究表明 ，对RAPD反应产物进行限制性内切后作RFLP分析，能有效提高DNA指纹的使用效率。吴平等14从5种海马干燥标本中提

7、取 DNA,用PCR技术扩增12SrRNA和Cytb基因片段并进行RFLP分析，结果12SrRNA基因比Cytb基因保守，从Cytb基因的RFLP获得的遗传信息比12SrRNA基因片段的大得多。说明以PCR-RFLP方法进行生药材的分子鉴定，应选择进化速率较快的基因。3.3DNA测序技术：对药材的基因片段进行精确的DNA序列测定和分析，已成为鉴别药材的重要手段，目前主要是12SrRNA基因和Cytb基因的序列比较。因为12SrRNA基因属于线粒体基因组中的非蛋白编码基因，在线粒体基因组中相对保守；Cytb基因是线粒体上一编码基因，也有一定保守性。它们在种内高度保守，而在种间则存在较大的序列差异

8、。吴平等15建立了乌龟和其他20种龟类的线粒体12SrRNA基因片段序列数据库，并通过序列比较鉴别了乌龟正品和混淆品。王建云等16通过Cytb基因的序列比较，证明梅花鹿的鹿毛、血、鹿鞭的DNA序列完全一致，而来源不同的鹿茸与其有较大差异，说明微量DNA并测定序列鉴定鹿茸和鹿鞭是可行而且准确的。此外乌梢蛇与混淆品、人参与西洋参、鸡内金与鸭内金、鳖甲等多种药材，均可通过DNA序列测定和比较来进行鉴别。3.4 DNA条形码鉴定技术 DNA条形码是指利用基因组中一段公认标准的、相对较短的 DNA 片段作为物种标记而建立的一种新的生物鉴定方法，由加拿大分类学家Paul Hebert于2003年首次提出1

9、7。该方法通过筛选确定通用条形码，建立条形码数据库和鉴定平台，通过生物信息学分析方法分析比对 DNA 数据，进而对物种进行鉴定。DNA 条形码鉴定快速准确、有望实现自动鉴定，是传统生物鉴定方法的有效补充，因而受到了国内外学者的广泛关注，目前已成为物种鉴定和分类的研究热点18-20。与其他分子鉴定方法相比，DNA 条形码鉴定具有三大优势:鉴定结果可重复性良好;方法通用性强;可构建统一数据库和鉴定平台，易于推广和标准化。 近年来，生药DNA条形码鉴定研究得到快速发展。中国学者通过大样本量系统研究，于2010年提出将 ITS2作为药用植物标准 DNA条形码，psbA-trnH作为ITS2的补充序列2

10、1。同时，通过对 GenBank 数据库中所有植物和动物ITS2序列的分析，发现ITS2 不仅对植物具有较高的鉴定效率，对动物的鉴定成功率也高达91. 7% ，进而建议 ITS2 可作为动物通用条形码COI的补充序列22。目前，ITS2 已成功应用于豆科等多个科属药用植物及药材鉴定23-28。psbA-trnH 序列也在石斛属等药用植物鉴定中得到了较好应用29-37。鉴于以上研究成果，陈士林等38建立了以 ITS2 为核心、psbA-trnH为补充序列的植物类药材 DNA 条形码鉴定体系和以COI 序列为核心、ITS2为辅助序列的动物类药材DNA条形码鉴定体系，并编著中药DNA条形码分子鉴定一

11、书。同时，为加快中药 DNA 条形码研究和应用步伐，中国医学科学院药用植物研究所建立了药用植物 DNA 条形码数据库。随着数据库的充实和扩大，相信在不久的将来，便可通过数据库对中药材进行快速检索和鉴定，应用前景广阔。3.5RAPD鉴定技术：即随机扩增的多态性DNA（ Random amplified poly-morphic DNA） , 是美国的Williams 和 Welsh 两个研究小组于1990 年同时提出的一种运用随机引物扩增 , 寻找多态性DNA片段的遗传标记技术 39、40。Williams等39利用任意顺序列10个碱基的寡核苷酸作引物, 以未知序列的基因组DNA为模板进行PCR

12、扩增, 获 得了一组不连续的DNA片段, 即DNA指纹（DNA fingerprinting） ; Welsh等40则用20 30个碱基的任意引物, 成功地进行了 DNA 指纹分析, 并称之为AP- PCR（ Ar-bitrarily primed PCR）。二者本质上都是任 意顺序引物的随机扩增,只是引物的碱基长度不同而已。由于RAPD引物没有特异性,合成一套引物可用于不同生物基因组的分析, 故可以在不知道DNA序列的情况下检测DNA的多态性, 与常规的基因多态性分析技术如RFLP（ Restriction fragment length polymorphism）和PCR（ polymer

13、ase chain reaction）相比, 具有快速、简便、通用性广等优点。尤其在目前绝大多数动、植物生药 DNA 序列尚不清楚的情况下, RAPD 技术较其他PCR标记更具有广阔的应用前景。3.5.1相近种的鉴别 邵鹏柱等41采用CATB微量提取法分离了五加科人参属（ Panna ） 3种植物, 人参（ P. ginseng ）、西洋参（ P. quinquef olium ） 、三七和 4 种伪品的基因组DNA, 用RAPD 技术得到了人参和西洋参的DNA指纹图谱, 并从DNA水平鉴别出了人参和西洋参这两种药材。曹晖等42利用RAPD技术得到了有明显差异的菊科植物蒲公英（Taraxacu

14、mmongolicum）和6种土公英混淆品种的DNA指纹谱;张荣等43对云南产的蓼科木蓝属（ Indigof erae ） 8种生药和毛莨科植物铁线莲（ Clematis ） 7种生药分别用RAPD技术进行了准确的鉴定; 裴德清等44对蓼科大黄属（ Rheum ）植物的掌叶大黄（ R. palmatum ）和阿尔泰大黄（ R. altaicum ）进行了RAP分析; Nakai R等45对小檗科淫羊藿属（ Eplimedium ）的8种植物进行了RAPD分析;均成功地鉴别了相近种的不同生药。3.5.2基原鉴定 _ Yamazaki M等46对日本药局方收载的伞形科植物当归（ Angelica

15、acutiloba即东当归）的大和当归和北海当归两个品系及商品药材当归采用了RAPD标记鉴别, 发现两个品系之间DNA片段存在明显差别, 商品药材当归扩增产物与大和当归品系的完全一致, 与PCR标记方法分析的结果相似。因此, RAPD分析可以用于药材的基原鉴别。曹晖等47采用CTAB法提取菊科地胆草属（ Elephantopus ） 植物地胆草（E.scaber ）、白花地胆草（E.mollis）和假地胆草（ Pseudoelephantopus spicatus ）以及4种商品药材苦地胆的基因组 DNA, 利用RAPD技术获得清晰可靠的多态性DNA指纹图谱。并根据这些指纹图谱及由此估算的相似

16、度值, 证实了从福建、台湾、香港以及澳门等地获得的商品药材苦地胆的基原为菊科植物地 胆草。Yamazaki M等48采用酸性缓冲液提取法分离了4种豆科甘草属（ Glycyrrhiza ）植物光果甘草（ G. glabra ）、甘草（ G . uralersis ）、刺毛甘草（ G. echinata ）和刺果甘草（ G . palliadiflora ）的基因组DNA, 通过RAPD指纹图分析了它们的遗传关系, 发现含甘草甜素（ Glycyrrhizin ）的光果甘草和甘草之间遗传关系非常接近; 而与含量极低或不含甘草甜素的刺毛甘草、刺果甘草的遗传关系则较远。这一结果与植物分类研究及RFLP法

17、的分析结果相吻合。进一步采用 RAPD技术阐明了4种商品甘草药材的基原归属问题, 认为阿富汗甘草来源于光果甘草, 西伯利亚甘草来源于甘草, 新疆甘草和西伯利亚甘草则来源于胀果甘草（ G.inflata ） 。3.5.3复方制剂中的药材品种鉴定 _ 中药复方制剂各种生药的外观性状均遭破坏, 要了解其中某味药是否存在, 用传统的鉴别方法有时难以奏效。如果通过对这种药材的分子遗传标记的研究能找到具有该种高度特异性的片段, 便可以此为基础, 制备出对该种高度特异的寡核苷酸探针, 再经分子杂交进行指纹分析, 即可达到鉴别目的。这一方法在法医鉴定上的成功应用, 表明了它应用于中药传统制剂中组分鉴别的可行性

18、。日本东京大学Ozeki等49采用GTC（异硫氰酸胍） 微量提取法分离3种植物人参、西洋参、珠子七和2种人参制剂高丽参袋泡茶及OTANECHAN（日本一种人参组织培养物制成的茶）的基因组DNA。通过RAPD分析, 结果发现高丽参茶中几乎没有片段的扩增（系提取物无模板DNA之故） , 但从OTANECHAN中扩增到了与人参愈伤组织相同的DNA片段, 表明了RAPD标记在生药质量研究中也将有广阔的应用前景。3.5.4 动物药的鉴定 _动物药特别是以部分组织器官入药和切成片块的药材, 由于外部形态特征被破坏, 组织细胞学特征不明显, 理化成分复杂而重现性差, 给鉴定带来困难。RAPD技术可以在毫无遗

19、传背景的情况下, 对生药材进行分子遗传标记的的鉴别。因此, 特别适合于动物药的鉴定。王义权等50成功地将RAPD技术应用于6种蛇 类的基因组多态性检测, 在20个引物中找出16个引物产生了253个扩增片段, 能准确区分游蛇科5个种和蝰蛇科1个种, 片段分布和片段共享度聚类分析所得的游蛇科5种蛇之间的亲缘关系与染色体、颅骨和阴茎研究的结果基本一致。显示DNA分子遗传标 记技术可以成为一种准确鉴别蛇类药材的新方法, 也表明了RAPD技术在动 物药的鉴定中将有十分广阔的前景。3.6DNA芯片技术蔡佩欣等51克隆了9种贝母的26S rDNA的D2与D3区的多态性片段序列,制作了DNA芯片对各种贝母进行

20、检测,能够准确区分各种,为DNA芯片技术应用于生药鉴定开辟了新的领域。4 评价与展望我国生药产业化、规范化、标准化是生药现代化的必由之路 ,生药材品质鉴定是生药质量控制的首要环节,寻找科学有效的鉴定方法是实现生药现代化迫切任务。从应用的现状不难看出分子生物学技术在该领域的应用已经取得了可喜的成绩,具有以下几点优势:特异性强、稳定性好,鉴别可靠性强;对样本要求较低,无论是药材原生物还是成药、甚至是粉末都可以用来鉴别;所需样品量极少,可以同时检测大量样品;技术成熟,结果直观清晰,便于进一步分析。另一方面,分子生物学技术在生药材鉴定中的应用也存在着明显的不足。从应用成果来看,准确鉴别原生物已经不成问

21、题,在种养殖引种时进行鉴定,能够保证种源的地道纯正具有相当的推广价值。在对药材或成药的鉴定方面虽然能够胜任,但存在不少问题:尚处于资料积累与方法不断完善的阶段,已涉及的生药品种和研究人员还不够广泛;技术水平相对于生产收购第一线仍然显得复杂,效率不够;技术方法有限,而且照搬其它领域;成本依然偏高,无法在收购第一线普及;大多需要专门仪器和专业人员,成本较高;标准化程度不够,难以形成体系。因此,今后研究的重点应该放在以下几个方面: 结合生药其它领域的研究,推动分子生物学技术对更多的生药品种进行鉴定,更充分地比较各种方法的特点和合适的应用范围; 将更多的分子生物学技术,特别是新技术应用到该领域; 要把

22、开发简便易行的新方法放在突出的位置,降低对设备和专业人员的依赖; 最大限度地降低成本提高效率,开发即用型试剂盒和专用仪器; 在种质资源鉴定方面联用多种分子生物学方法进行分析。参考文献：1万德光,裴瑾.论中药品种鉴定在中药质量控制中的地位和作用J.药学实践杂志, 2000 ,18（5） :260 - 262.2石俊英. 中药电泳鉴别法及其在植物、动物类中药应用的研究J . 山东中医学院院报 , 1995 ,19（2） :74 - 75.3陈振德 ,陈志良 ,侯连兵等. 榧子蛋白高效毛细管电泳法鉴别J . 中草药 , 2000 ,31（5） :377 - 379.4许重远 ,陈振德 ,刘建武等.

23、狗脊及其混淆品蛋白多肽高效毛细管电泳法鉴别 J . 中药材 ,1999 ,22 （7） : 377 -338.5张林碧,肖凤英. 五种动物内金的 PAGE鉴别J .中药材 ,2000 ,23（1） :22-24.6李国锐,梁爱君,白林.中药壁虎及其伪品蜥蜴的凝胶电泳鉴别J . 解放军药学学报 ,2003 ,19（2） :144 - 146.7黄璐琦，王 敏，杨 滨，等.用随机扩增多态DNA（RAPD）技术鉴别天花粉及其类似品J.药物分析杂志，1999，19（4） ：2338曹 晖，毕培曦，邵鹏柱.中药材地苦胆的DNA指纹鉴定J.中药材，1996，19（12）：6089张 荣，张步振，叶 浩.

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