TCP家族基因研究进展Word下载.docx

1、PCF1和PCF2是结合水稻PROLIFERA-TING CELL NUCLEAR ANTIGEN（PCNA）基因的启动子1，PCNA编码参与DNA复制和修复，维持染色体结构，染色体分离，细胞周期进程的蛋白。近10年来，对TCP基因的总结需要一个长焦显微镜来对这个成长着的家族进行分析。TCP基因已经在多个物种中被发现，它们在植物发育过程中所起得作用也渐渐被阐明。这些基因的发现强调了这一植物特异性的基因家族在植物形态进化和发育控制中的重要性。基因组和转录组在非模式物种中的测序发现了更多位置功能的TCP基因，它们的功能部分根据目前在模式生物中所作的研究来决定。在此我们简要分析当前这一家族的知识，其

2、进化史、蛋白的生化功能，以及已知功能的一些家族成员在植物形态构建和进化中的调控作用，以期为更好的调节植物的生长模式和调控植物的生理特性的研究提供思路。1 TCP家族的进化TCP转录因子是一类古老的蛋白。尽管没有发现其在单细胞藻类Chlamydomonas 中出现，但在绿藻中发现，如Cosmarium and Chara，还有苔藓植物Physcomitrella patens，蕨类植物及Lycophyte Selaginella5，6。在这些物种中，TCP基因形成含5-6个成员的小家族。在植物进化过程中，重复和多样化在裸子植物6和被子植物7-16中产生了由数十个成员组成的更大的家族，全基因组搜索

3、发现了超过20个成员的该基因物种有拟南芥8，14、水稻6，15，16和白杨6等。根据它们的TCP domain可将TCP蛋白分为两类：I类17（PCF类或者TCP-P类），II类（TCP-C类）6。I类包含水稻PCF1和PCF2，II类包括CYC和tb1。这两类最大的不同是I类蛋白比II类蛋白在TCP domain处有4个氨基酸的缺失。除了TCP domain，其他基序是保守的2，6，11，16，18。此外，在II类蛋白中发现一个富含18-20个精氨酸的基序2和一个谷氨酸-半胱氨酸-谷氨酸结构（ECE motif）11，功能未知。目前为止，还没有定论说这两类蛋白谁是祖先，因为绿藻中这两类TCP

4、蛋白都有发现。在被子植物中，I类是由一组相关度较高的蛋白组成；II类则可根据其TCP domain的不同而进一步分为两个亚类。CIN亚类，以金鱼草中的CIN基因为例，包含与侧生器官发育相关的一些基因18-24；CYC/TB1亚类11，包括与腋生分生组织（花和侧枝）发育相关的一些基因。CIN亚类可能比CYC/TB1亚类更古老，因为，以卷柏属Selaginella和立碗藓属Physcomitrella为例，它们没有花叶没有分支。CYC/TB1亚类可能到被子植物之后进化。在单子叶植物中，tb1基因及它的同源基因控制着腋生器官（花序原基，花，侧生茎）的营养生长、发育和生殖3，25-30。系统进化分析表

5、明，CYC/TB1分枝经历了两次重复，从而引发了3种类型的基因：CYC1、CYC2和CYC311。对拟南芥的遗传研究表明，CYC1类保持了tb1的控制茎分枝的功能31-33。CYC2类包括CYCLOIDEA-like基因，在花的背腹对称进化中起关键作用34-36。这一类基因由于重复作用进化出很多新的功能，以豆科（Leguminosae）12，37-40、紫菀目41-43和Lamiales4，13，44-59为例。CYC3类包含一些基因如拟南芥的BRANCHED2，在侧枝和花原基中都有表达，在茎分枝控制方面作用较小，在花发育方面功能还不是很清楚31-33。2 TCP蛋白的特征2.1 TCP蛋白的

6、生化特性TCP因子的生化特性主要在水稻中明确1，17。PCF1，PCF2是识别PCNA启动子的DNA结合蛋白1。TCP domain 的碱性区域，在所有家族成员中是高度保守的，是DNA结合所必须但不是高效的区域，因为缺失这一区域将完全限制酵母单杂交中的DNA结合活性。而且，水稻TCP蛋白能结合特异的DNA motif。随机结合位点选择实验和EMSAs电泳迁移位移实验揭示了I类和II类因子的不同的共有结合位点。I类的共有位点是GGNCCCAC，这个相同的基序或者是更短的序列是（T）TGGGCC，GCCCR，GG（A/T）CCC接着在拟南芥基因推测受I类因子控制的启动子中被发现60-64。有趣的是

7、，II类结合位点的共有序列与I类不同但存在共有序列：G（T/C）GGNCCC17，65。一段互补的基序是gGGaCCAC，通过体外选择得到确认，作为II类AtTCP4的结合位点，它的核心序列是GGACCA，在AtTCP4调控的基因中过度出现24。这预示着，包含这两个位点的序列，G（T/C）GGNCCCAC可能被这两类蛋白识别，从而同等的或者竞争性的调控转录调控8，17，61。最近有研究表明，II类因子CYC可以结合I类位点66，这说明，这个序列的特异性是不完全的，TCP因子存在竞争的可能。TCP蛋白形成同源或者异源二聚体起作用（目前只在同类的因子中有表述），在除TCPdomain之外，其他蛋白

8、的缺失预防了二聚化作用，从而导致DNA结合能力丧失，因为DNA结合需要形成二聚体17。因此，也有可能是，不同的异聚化组合结合不同的瞬时作用元件，以不同的亲和力识别靶基因，或者调整其他的活性7。这将使得研究这些转录因子的调控网络更加复杂。作为DNA结合蛋白，TCP因子预测是定位在细胞核内。在这些因子中存在两个或者多个核定位信号（NLS），免疫共沉淀核提取物或者GFP融合蛋白技术确定了少数TCP成员是定位于核中1，17，31，62，67，68。相反的，PTF1/TCP13的GFP融合蛋白发现定位于叶绿体69。其他少数TCP因子（AtTCP11、AtTCP15、AtTCP17、AtTCP22和 At

9、TCP23）被预测含有叶绿体靶向肽段（cTP）6，70，因此这些因子极有可能是控制叶绿体基因的转录69。2.2 TCP蛋白因子的转录TCP蛋白结合数个基因的启动子部分的功能顺式调控元件1，17，24，60-65，69，71。但是具体被哪一个TCP蛋白控制转录的分子机制知之甚少。例如，TCP因子可否激活自身转录，少数TCP因子被报道具有自我激活功能，但是目前为止水稻蛋白I类没有发现可以反式激活受I类位点控制的报告基因。可见，至少一些TCP转录因子不是转录激活自身，而是需要和其他蛋白互作来控制转录。TCP结合位点经常与顺式作用元件有关，预示TCP因子可能作为调控复合物的一部分60-72。如，拟南芥

10、CYCLINB1；1基因（AtCYCB1；1）的启动子，TCP结合位点与M特异性激活元件（控制G2/M阶段特异的表达周期）73（MSA）合作促进高水平转录61。TCP位点被发现与AtPCNA2，AtCYTOCHROME C-1和2，以及很多核糖体蛋白基因的启动子的顺式作用元件telo box 有关63，72，74，75，并且它们与telo box协同作用于人工启动子从而控制报告基因的表达63。例如，一个telo box结合因子，AtPURa在酵母双杂交中与AtTCP20互作，表明这两个蛋白可以一起作用于核糖体蛋白基因的启动子63。另 一 个TCP因 子，CCA1 HIKING EXPEDITI

11、ON（CHE），与CCA1启动子结合，引起该基因的下调62，与TIMING OF CAB EXPRESSION1（TOC1）（一个 CCA1的转录激活因子）互作76。认为CHE使TOC1分离，防止了它在CCA1启动子与其他转录因子互作62。AtTCP24与ABAP1互作负调控AtCDT1a和AtCDT1b的转录65。最后，金鱼草中TCP-CUP互作蛋白（TIC），与CUPULIFORMIS（CUP），一个调控器官边界形成的NAC-域转录因子结合，但是未被检测到其转录作用。2.3 TCP蛋白的生化功能TCP蛋白可以作为转录激活子或者抑制子，但是这些功能似乎不是由它们的TCP域决定的：两个亚家族的

12、TCP因子都有转录激活作用（如第1亚家族的AtTCP20增强了CYCB1；1的转录，第2亚家族PTF1/AtTCP13促进了PSBD的转录）和转录抑制作用（第1亚家族的CHE和第2亚家族的AtTCP24）。有些TCP蛋白甚至可能既有转录激活作用又有转录抑制作用，此外，有些TCP蛋白相互作用可能与转录控制无关联。PTF1/AtTCP13在叶绿体中促进PSBD的转录，经酵母双杂交鉴定与AHPs互作，（AHPs调停His-to-Asp信号转导，如细胞分裂素途径68）。这表示TCP家族在细胞分裂素转导途径中起作用的可能性。蛋白质相互作用可通过保守的TCP域两亲性螺旋介导2，该螺旋包含LxxLL特征或者

13、是fxxLL特征，（L是亮氨酸残基；x是任意氨基酸；F是一个疏水性氨基酸），这个结构在动物中是介导转录共激活子与配体核受体结合77。但是，该类蛋白的其他部分，在某些情况下，增强了其特异性：ABAP1与AtTCP24互作而不是与其他关系亲近的TCP因子，AtTCP3，AtTCP5，PTF1/TCP13，或者 AtTCP17，这些因子包含几乎相同的TCP域65。这表明，在TCP域之外的高度的分化和快速的进化结果，在某些情况下，是为了其功能特异性。相反的，金鱼草CUP可以结合TIC和CYC，这两个TCP蛋白分属于不同的亚家族78。所有的这些相互作用，目前为止都只在体外得到证明，需要进一步得到体内实验

14、的验证。3 发育过程中TCP基因的作用一直以来都认为第一亚家族的基因促进植物生长和分芽生殖，主要是根据水稻中PCF1/PCF2和AtTCP20在分生组织中的表达，以及这些基因分别对PCNA和CYCB1；1的转录激活作用1，60。但是，对于这一功能的直接证据还没有得到。大多数第一亚家族经分析的单突变体有弱的或者是没有表型缺失，可能是由于基因冗余导致的60，61，79，80。同时，在拟南芥中，AtTCP20 融合EAR抑制子的异位表达引起很特殊的表型，表明了TCP家族基因在细胞分裂、伸长和分化调控中起到重要作用63。相比之下，基于观察几个单突变和多突变体的表型认为第二亚家族的功能是防止植物生长和增

15、殖。cyc-型突变体减少了花两侧对称的生长4，30，37，41，43，45，50，81，tb1/bra1-型突变体则表现出过度的茎分枝3，26-29，31，32。这些明显不相关的表型都可归因于响应组织增殖模式的基因表达的改变。CIN-型基因在金鱼草、拟南芥和番茄中发现，限制了发育中的叶原基边界的细胞增殖。在金鱼草和拟南芥的突变体中发现，与野生型相比，叶片保持更长时间的细胞分裂，因此产生更大的叶片，且叶片形状发生改变，表面褶皱18，20，22，24，65。在番茄中，突变体的复叶有更多的叶缘持续生长的更大片的小叶23。金鱼草中CYC基因减少了嫩花原基分生组织的背侧区域的细胞的增殖，从而减少了在这一

16、区域背侧花器的数目，并进一步引起背侧雄蕊的败育形成不育雄蕊4，56。玉米tb1和AtBRC1可以通过下调特定基因的表达，使得腋芽生长停止被打破，从而生长成侧枝3，25，32，33。第二亚家族基因与控制细胞增殖和生长有什么关系，有文献报道称第二亚家族的TCP基因mRNA水平与一些细胞周期标志基因表达呈负相关22，81，82，但是这也只是表明细胞在有细胞周期标志基因表达的区域的分裂停止。目前为止，没有证据表明，TCP基因直接抑制HISTONE或者是CYCLIND3基因转录。尽管有少数TCP靶基因已知1，21，60，64-66，69，一些是直接参与到细胞周期进程的。例如，II类AtTCP24负调节转

17、录前复制控制（预RC）因子基因CDT1a和CDT1b，这是细胞进入S期和DNA复制必须的65。此外，II类蛋白可以拮抗前面提到的I类因子在PCNA1和CYCB160转录方面的作用。其他II类因子可以间接的影响细胞增殖，如PTF1/TCP13可能修正细胞分裂素信号途径的应答67，从而影响细胞分裂。最近的一项研究利用叶成熟标志基因表明，除了延缓增殖外，CIN-like基因可以促进分化22。基因组广义分子表明，I类基因结合位点在控制重要的细胞活动的基因的启动子区有很多，如蛋白质合成，线粒体氧化磷酸化，叶绿体基因转录，这些预示着I类基因可能控制这些进程60-62，69，75。而II类蛋白则通过急剧的影

18、响细胞和组织的增殖与生长率来干扰这些细胞活动。还有研究表明，NAC域转录因子家族与TCP家族有很近的关联，都是最为互作的部分和作为下游靶目标。金鱼草的NAC域蛋白CUP以I类TCP因子-TIC互作表明，基于NAC和TCP因子定位表达的器官边界的建立存在一个模式77。已经证明，拟南芥中AtTCP3、AtTCP2、AtTCP4、AtTCP5、AtTCP10、PTF1/TCP13、AtTCP17和 AtTCP24嵌合表达阻遏子减少了NAC域基因CUP-SHAPED COTYLEDON（CUC）的表达24。相比之下，At-TCP3的功能获得抑制了CUC基因的表达并引起子叶融合24，这个表型在前面对与A

19、tTCP2和AtTCP4的超表达研究中也有发现18。在TCP3的dominant negative version 表达中，出现了miR164的下调，导致CUC转录本的裂解。由此可见，CIN-like基因可以通过调控miR164的转录水平而控制CUC基因的表达24。而其他的TCP基因则可能促进器官的融合。人们在紫菀目大丁草中发现，GhCYC2基因与花瓣融合形成伞形花序小花有关。此外，减少GhCYC2功能导致频繁分裂反花瓣，异位GhCYC2表达导致花瓣的融合和形成管形磁盘小花41。对TCP基因的其他功能研究发现，它们与细胞伸长18，21，24，41，63，66，雌雄配体发育80，83，胚胎发育8

20、3，种子萌发79，茉莉酸合成和叶片衰老21及光形态建成84有关。TCP家族基因是植物特有的一类转录因子，在植物界特别是高等植物中具有非常广泛的分布，它控制着植物生长发育的大部分生物学功能。拟南芥TCP家族基因一共包括24个成员，如果按照氨基酸序列的保守性来区分，可以分为亚家族一和亚家族二，它们分别包含13个成员和11个成员。通过对TCP1的研究发现其对拟南芥植物激素油菜素内酯的生物合成具有非常重要的调节作用。在拟南芥油菜素内酯生物合成的途径中，DWF4是其中的一个关键酶，DWF4的蛋白含量直接影响到高等植物体内油菜素内酯的合成量，TCP1通过与DWF4启动子相互作用，可以正向调节DWF4的转录

21、水平，从而达到影响植物体内油菜素内酯的含量，进而进一步对植物的生长发育进行调控18，21，79，83。TCP20是一个与叶片发育相关的转录因子，以往的研究中发现TCP20可能参与调控了叶片的衰老进程。将TCP20和TIE1的C端融合后在拟南芥中表达，转基因植物表现出与tie1-D相类似叶片早衰表型，表明TIE1能和TCP20相互作用并参与调控叶片的衰老进程。为了探究TIE1在衰老过程中行使的功能，我们把将TIE1的EAR基序突变或删除后在野生型拟南芥中表达或再与病毒VP16蛋白的转录激活区融合后在拟南芥中表达，最终获得了使TIE1功能抑制的显性缺失转基因植株18，21。最后，CHE作为生物钟的

22、一个新的因素的功能鉴定64进一步解释了这个基因家族在植物中的多功能。4 TCP基因的转录和转录后调控转录的数据表明，I类基因是广泛在植物生长发育过程表达，在转录后控制功能尚未见报道。相比之下，II类TCP基因的功能似乎严格控制在多个层面。这并不奇怪鉴于其对增殖和生长的强烈影响，它们在不同发育阶段和不同组织的功能是收到严格限制的。II类基因显示mRNA的分布动态和空间限制的模式4，32，20通过转录水平调控，同时也严格监管mRNA的稳定性。迄今在所有已分析的被子植物CIN型基因的一个子集是小分子RNAmiR319的靶目标18，21，22-24。这种途径进化较晚，因为虽在立碗藓属已检测到miR31

23、9，CIN-类基因在这个物种没有目标序列5，85。异位或在自己的启动子下表达CIN-miR319耐基因，导致强劲增长，减少子叶融合，茎顶端分生组织的发育受阻和致死，都说明该类基因在植物生存能力的控制方面的重要性18，23，24。在这些基因中内含子也可能具有调节作用。许多tb1-like和CYC-like基因含有内含子，在某些情况下是定位在3 UTRs处4，42。UTRs调节mRNA的稳定性，定位和翻译效率，UTR的内含子，这是比较少见的，已报道影响表达水平（如文献86，87）。通过选择剪接的假定调控也被观察到。例如，BRC1的cDNA已从腋芽以外的组织分离得到，并保留内含子导致缺乏R结构域的截

24、断的蛋白质（C. Poza 和P. Cubas，未发表）。最后，尽管还有待证明，高保守的TCP域在参与调控的DNA结合，亚细胞定位，蛋白质的相互作用和蛋白质降解有关。5 结语植物特异性的TCP基因家族作为一个专利因子家族的出现，在植物发育过程中起重要作用。这些基因，主要是II类因子，影响细胞增殖的定位模式，控制形态特征，如花的形状、叶形和茎分枝。TCP基因还参与其他关键生物过程，如激素的合成和昼夜节律调控。在过去的十多年中，已获得了这个家族的演变和其分子功能的一些知识，但这些领域的研究仍处于早期阶段。目前还不清楚这个新基因家族是如何出现的，新的顺式调控元件与新的形态特征的产生是如何相关的，如花

25、卉两侧对称，侧枝生长受阻。在整个植物王国里，TCP基因的种系基因组学比较和RNAi的功能分析应帮助解决这些问题。从力学的观点来看，它仍然是证明I类和II类因子拮抗竞争共同的靶基因或结合位点。如果这种情况是真实的，TCP因子通过部分重叠的表达域，可以建立复杂的转录因子活性的组合网络，这需要阐明。生物意义的TCP同源和异源二聚体和其他的TCP蛋白质伴侣可能会在不久的未来使用蛋白质组学方法去鉴定，以及这些蛋白控制的靶基因的确定可通过体内转录复合物高通量技术，如染色质免疫沉淀结合大规模parallel DNA sequencing（芯片SEQ）88实现。TCP蛋白质伴侣和其下游基因的确定可能帮助研究人

26、员了解哪些TCP基因影响增殖与细胞的分化状态的遗传途径。最后，由于I类的成员可能存在功能冗余现象，对这一类基因的分析可能需要由RNA诱导的基因沉默和嵌合阻遏沉默技术21，60，89。今后的工作应该揭示该植物特有的基因家庭的新功能。此外，随着对TCP基因的功能和调节机制的深入研究，研究人员可使用它们作为工具，调节植物的生长模式和生成新的农艺性状。参 考 文 献：1Kosugi S, Ohashi Y. PCF1 and PCF2 specifically bind to cis elements in the rice proliferating cell nuclear antigen gen

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