病毒的形态学诊断Word文档下载推荐.docx

1、二、 病毒动物接种法 实验动物在病毒学研究中有四方面用途：分离鉴定病毒，如乙脑病毒；连续传代通过，以减弱有毒株对人的致病力，如狂犬病病毒；制备抗血清；病毒致病机理的研究。 常用的实验动物有小白鼠、地鼠、豚鼠、家兔、绵羊、鸡、猴等。在病毒学研究中，动物接种时为避免动物本身可能带有病毒，多采用实验室自己繁殖的动物。首先根据研究目的选择动物种类，对病毒致病机制的研究，则选择愈接近人类的高等动物（例如灵长类）研究结果愈有价值；其次要注意动物的年龄、性别和接种的途径等各种因素，一般年幼的动物比成年动物对病毒的敏感性高。至于接种的途径应根据病毒的嗜性决定，例如脑炎病毒以脑内注射最敏感。 （一）小白鼠尾静脉

2、接种（录像） 【材料】 1. 动物：小白鼠 2. 病毒悬液 3. 碘酒、酒精、二甲苯、无菌0.25ml注射器、4号针头及小铝匣 【方法】 1. 将小白鼠固定在小铝匣内，露出尾部，用碘酒消毒尾部，然后用酒精棉球连续擦尾部皮肤（必要时用二甲苯擦）使血管扩张。 2. 尾背和左右两侧三根血管皆为静脉，可选一根扩张较好的静脉作接种用。左手拇指捏住尾部的远端，向下弯45，右手持注射器，于弯处进针静脉，推液0.1毫升。 注意：推注时遇阻力且皮下隆起发白时，表示针头不在血管内应拔出重新进针；如针头在血管内，推注时不感阻力，且可看到血管中血液由于注入液体而后退。 接种后逐日观察动物发病情况。（二）小白鼠鼻内接种

3、（录像） 小白鼠、流感病毒鼠肺适应株病毒悬液、无菌小试管、无菌毛细管、麻醉用乙醚、棉球及小玻瓶。 1. 首先将沾有乙醚的棉球放入一清洁小玻瓶内。左手握小瓶，右手抓住小白鼠，将其头部塞入瓶口，进行全身麻醉。注意麻醉深度，不宜太浅或太深，太深时易遭致麻醉死亡或非特异性吸入性肺炎，太浅则易在滴种时打喷嚏。 2. 用无菌毛细吸管吸取病毒悬液少许，连同毛细吸管插在无菌试管中备用。 3. 用左手将小白鼠握在手掌中，大拇指及食指抓住小白鼠耳部使其头部朝前并呈仰卧位置，另一手取事先吸有病毒悬液的吸管，慢慢滴出一点于滴管口而不使其自然掉落，呈悬滴状。将悬滴靠近动物鼻尖，动物在呼吸时自然吸入，一般为0.030.0

4、5毫升，不宜过多。 4. 小白鼠慢慢苏醒，在饲养盒中逐日开始发病，发病的症状常为毛耸、咳嗽、不食、甚至死亡。解剖尸体可观察到肺炎或血性病灶。 （三）小白鼠脑内接种（录像）【材料】脑炎病毒（小白鼠脑脊髓炎病毒）悬液。脑组织先用无菌生理盐水洗去血液，再加10脱脂奶盐水研磨成101悬液，然后用3000转/分离心沉淀30分钟，吸取上清液供接种用。小白鼠：3周龄，体重68克。无菌0.25毫升注射器及针头（4号）、煮针锅、碘酊、棉签。 1. 以无菌0.25毫升注射器抽取脑炎病毒悬液0.1毫升，去除注射器内的气泡。 2. 取出小白鼠，左手将小白鼠固定，固定时用大拇指和食指捏住小白鼠的头部，左手手掌轻轻按住小

5、白鼠的体部。 3. 右手以棉签蘸以碘酒，消毒小白鼠颞部皮毛（不碰到眼）。 4. 右手拿注射器在小白鼠颞部（眼与耳根连线的中点略偏耳朵的方向）刺入，进入颅腔，进针23毫米，不要插得太深，注射量为0.020.03毫升。 5. 注射完毕，将用过得注射器放入煮针锅内煮沸消毒。动物一般在34天后开始发病，食欲减退，活动迟钝，毛耸，震颤，慢慢发展为麻痹，瘫痪而死亡。 本法适用于一些脑炎病毒的分离培养。三、 病毒鸡胚培养法 鸡胚培养法常用于痘类病毒、粘病毒和疱疹病毒的分离、鉴定、制备抗原、生产疫苗以及研究病毒性质等。 鸡胚和实验动物一样，为一整体动物，有神经血管的分布及脏器的构造；鸡胚的组织分化程度低，病毒

6、易于繁殖，感染了病毒的膜结构和液体中，含有大量病毒；鸡胚来源充足，操作简单、通常本身是无菌的，对接种的病毒不产生抗体为其优点，但除产生痘疱的病毒及引起鸡胚死亡的病毒外，通常不产生特异性的感染指征，必须利用第二个试验系统来测定病毒的增殖。 常用的鸡胚接种方法有四种，即绒毛尿囊膜上接种法、羊膜腔接种法、尿囊接种法及卵黄囊接种法。根据不同病毒和不同目的采用合适的接种方法。（一）尿囊腔接种法（录像） 副流感病毒103稀释液，1012日龄鸡胚、无菌1毫升注射器及7号针头、电动磨蛋器、检蛋灯、弯头小镊子、蛋架、碘酒棉球、胶布、大头针、无菌试管、无菌毛细吸管。 1. 选用1012日龄鸡胚，在照蛋灯上照视观察

7、鸡胚是否存活，根据如下：小血管是否清晰；胚胎是否活动，观察小鸡的眼睛黑点是否移动；蛋白一边和胎盘一边是否界限分明，蛋白一边较亮，胎盘一边暗红色，如果胎盘一边发黑或苍白都表示胚蛋已死亡。 用铅笔标明天然气室，鸡胚及大血管位置，然后在绒毛尿囊膜发育区避开大血管的地方作一记号，定为注射入口。绒毛尿囊膜区血管丰富，在照视时呈现红色，几乎占据鸡蛋的二分之一。 2. 用碘酒消毒注射入口和天然气室端的蛋壳，再用电动磨蛋器于注射入口和天然气室端的蛋壳上磨一小孔，勿伤及卵膜。 3用大头针通过火焰消毒后刺穿气室端所开小孔的卵膜，这样可避免在注射时液体回流出来。 4将鸡胚横卧于蛋架上，用无菌1毫升注射器抽取病毒液体

8、，针头于卵壳成30交角，由注射小孔刺入0.51.0厘米，注射0.10.2毫升（图10-1）。 5注射完结用胶布封口。封口前胶布用碘酒消毒，并通过火焰烧去余碘。用过的注射器用煮沸法消毒，鸡胚放入3537培养。 6注射后次日，逐日观察鸡胚生活情况，孵育4872小时后移入4冰箱。注意鸡胚必须直立，令气室端朝上。 7收获尿囊液之前取出鸡胚，用碘酒消毒气室端，并用镊子击破气室端卵壳，沿气室边缘小心打开一大缺口，然后用小镊子撕去卵膜及撕破绒毛尿囊膜，最后用毛细管吸取尿囊液，一般可吸得45毫升。 8滴定尿囊液的病毒血凝效价。尿囊接种法适用于某些呼吸道病毒，如流感病毒、副流感病毒、新城鸡瘟病毒等的培养，惟分离

9、培养不如羊膜腔接种法阳性率高。（二）绒毛尿囊膜上接种法（录像）牛痘苗病毒103稀释液、1013日龄鸡胚、橡皮乳头、眼科镊子或小剪刀、无菌培养皿、无菌生理盐水，其余同尿囊腔接种法。1选用1013日龄鸡胚，在照蛋灯上照视观察是否活胚蛋，用铅笔划下绒毛尿囊膜发育的界限。2将胚蛋横卧于蛋座上，使其绒毛尿囊膜部位朝上，用碘酒消毒绒毛尿囊膜部位和天然气室端的中心部，待干后即用磨蛋器轻轻在绒毛尿囊膜中心部磨一三角形窗口（每边一厘米许），磨破卵壳而不使卵膜破裂，同时用磨蛋器于气室端开一小孔。注意：已磨好之鸡胚必须于12小时内接种，否则绒毛尿囊膜易与卵壳粘着。3用分离针或大头针通过火焰消毒，穿通天然气室端所锯小

10、孔；并用分离针或大头针轻轻划破卵壳，露出三角形卵膜，最好将分离针或大头针30角度自上往下压迫卵膜一个小口，这样不致损伤绒毛尿囊膜。4立即用橡皮乳头在天然气室一端小孔吸气23次，目的将天然气室的空气吸去，而上面所开的洞口进入空气，形成一个人工气室，可在照蛋灯上照视一下，看天然气室是否消失，如未消失则尚需再吸气数次（图10-2）。5用小镊子通过火焰灭菌，稍待冷却后将三角形窗口的卵膜撕去、暂时盖以无菌培养皿防止污染，然后用消毒注射器吸取牛痘苗悬液（103稀释液，内加适量的链霉素及青霉素），揭去培养皿，于窗口滴入0.10.2毫升病毒液，注毕后窗口用胶布封口，封口前胶布用碘酒消毒，并通过火焰，烧去余碘。

11、用过的注射器煮沸消毒。6孵育于37温箱，每日观察生活情况，接种103稀释的牛痘苗后的鸡胚一般不死亡，但也可能在3天之后发生死亡，如发现死亡则立即放入普通冰箱，如不死亡则培养45日后放入普通冰箱，等待观察检查。7将感染病毒的鸡胚自冰箱中取出，用碘酒消毒人工气室面，然后用镊子撕去胶布并将卵壳的三角形窗口扩大，以便剪取绒毛膜，此时在明亮处可清楚地看到牛痘斑，呈白色点状，有时融合成一堆或一片。8左手用小镊子镊起绒毛尿囊膜，右手用小剪顺卵壳四周剪下绒毛尿囊膜放入无菌培养皿内，并用无菌生理盐水洗涤12次，再将膜张开，膜上牛痘斑就看得更为清楚。绒毛尿囊膜上接种法，除适用于天花，牛痘等病毒外，尚适用于单纯疱疹

12、病毒和其它一些病毒，但其它一些病毒不如天花、牛痘、单疱疹病毒那样具有明显的病斑。（三）羊膜腔接种法（录像）副流感病毒103稀释液、910日龄鸡胚、灭菌液体石蜡、其余同尿囊腔接种法。1所用鸡胚在使用前一天，将鸡胚直立卵盘培养，使其胚胎向上，便于操作。 2接种前检查鸡胚生活情况，并用铅笔画出天然气室和胚胎的位置，然后用磨蛋器沿天然气室的边缘和胚胎位置近处，锯一方形小窗（每边约1厘米许，如图10-3）。 3用小镊子挑去方形卵壳和撕去卵膜，再用无菌吸管，吸取石蜡油少许，滴入2滴，石蜡油在气室面的卵膜上很快散开，使膜透明，这样在鸡蛋照明灯或检蛋灯上，可清楚地观察到整个鸡胚。 4用无菌1毫升注射器抽取少许

13、流感病毒液体，将鸡蛋直立于照明灯或检蛋灯上，针头自窗口对着鸡胚直下，穿过绒毛尿囊膜，羊膜腔、推动注射器，注入0.10.2毫升，针头刺入时注意勿伤及鸡胚本身，最好从小鸡的颈部空隙中插入。 5注射完毕后，用胶布封口（胶布先经碘酒消毒和通过火焰烧去余碘处理）。用过的注射器煮沸消毒处理。鸡胚放入3537培养4872小时。 6自注射后次日起逐日检查鸡胚的生活情况，2日以内死亡者多为非特异性损伤而致死；2日后死亡者视为特异性死亡，流感或副流感病毒103稀释注射时，一般不引起死亡。收获病毒之前将鸡胚移入普通冰箱1824小时，将鸡胚冻死，以减少收获时的出血。 7冰箱取出鸡胚，碘酒消毒鸡蛋气室端，撕去胶布并将蛋

14、壳窗口扩大，用小镊子撕破卵膜及绒毛尿囊膜，然后用毛细管吸出尿囊液弃去，尿囊液吸完后，左手持镊子镊住羊膜腔，右手以毛细吸管插入羊膜腔吸取羊水，一般羊水可吸出一毫升左右。 8滴定羊水的病毒血凝效价。 羊膜腔接种方法适用于一些呼吸道病毒，如流感病毒、副流感病毒及流行性腮腺炎病毒等的分离。 图 10-3羊膜腔接种法四、病毒细胞培养法及病变观察（录像）细胞培养法是目前培养病毒应用最广的一种培养方法，其优点是（1）经济适用，结果正确且敏感；（2）较实验动物易于控制。细胞培养法多应用于病毒的分离培养，进行血清中和试验及制造疫苗和抗原等方面。很多组织细胞，包括鸡胚、鼠胚、各种动物的肾组织细胞，人胚羊膜组织细胞

15、或流产胎儿组织细胞（应在死后6小时内采取，因时间过长，组织细胞生长成功率下降）等均可作细胞培养的来源。细胞的选择主要依据组织细胞对病毒的敏感性。能引起病变的组织细胞，往往取自病毒的自然宿主，特别是引起疾病的宿主的某些脏器组织细胞。人类病毒，用人或猴的组织细胞较敏感，但这不是绝对的，如地鼠肾细胞较人肾细胞对流行性乙型脑炎病毒敏感。（一） 原代细胞培养法910日龄鸡胚、Hanks氏溶液、0.25胰酶溶液、无菌小剪、镊子、无菌培养皿、毛细吸管、吸管、沉淀管、无菌细胞培养管（抗生素空瓶）、100毫升无菌玻璃瓶或三角烧瓶、备有四层纱布的玻璃漏斗。1用碘酒消毒鸡胚蛋气室外壳，并将它直立于蛋架上，以镊子将鸡

16、胚取出放入无菌培养皿内，去头爪及内脏。2用小剪在培养皿内将胚胎剪成小块（45毫米3），加Hanks氏溶液（约10毫升）冲洗，静置12分钟后，用毛细吸管吸取液体。依同法再洗涤2次，将血球充分洗去。3用镊子将组织块放入无菌玻璃瓶或三角烧瓶内，加入1015毫升0.25胰酶溶液，37水浴20分钟，中间摇动几次。由于胰酶的作用可使大量细胞游离，液体变混。经四层纱布过滤后的细胞悬液，低速离心沉淀（1000转/分以内）5分钟，吸取上清液，沉淀物加入适量营养液，用白细胞计数的方法进行计数，使成每毫升含5080万细胞悬液以作单层细胞培养。4每一细胞培养管，注入细胞悬液1毫升，盖好瓶塞，并将瓶略加摇动，横卧于有槽

17、木架上，使细胞均匀平铺于管壁。置37温箱孵育，一般4小时，细胞附着于管壁，48小时可长成单层，此时即可调换营养液，接种病毒。（二） 传代细胞培养法从人及动物组织，特别是肿瘤组织，经过多次传代可建立传代细胞系。这种细胞能无限地传代，但并不是所有的组织细胞都能建立传代细胞。有一些传代细胞对病毒敏感范围较广，曾被利用作病毒的分离和鉴定。如HeLa细胞，Hep2细胞及KB细胞。HeLa细胞对脊髓灰质炎三型病毒，腺病毒及大多数实验室适应的ECHO病毒都敏感。Hep2细胞也曾用来分离脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A组病毒、腺病毒、RS病毒。HeLa细胞来自子宫颈癌，Hep2细胞来自喉癌，而KB细胞来自上腭癌。由于

18、传代细胞有致肿瘤作用，目前仅用做病毒的分离鉴定及一些病毒学的研究而不能用于疫苗的生产。单层细胞培养瓶，营养液，0.25胰蛋白酶溶液，无菌吸管，无菌细胞瓶。1将成片细胞的生长液倒掉，用Hanks液洗一次。2加入适量的0.25胰蛋白酶，37孵育1分钟。3将细胞瓶倒放，细胞在上，胰酶在下，继续孵育37510分钟。4将胰蛋白酶倒掉，再加入原量的生长液，用10毫升吸管吹打分散细胞。5用生长液按原量34倍稀释，即一瓶细胞能传34瓶。（三） 细胞培养接种病毒的方法及病变观察（示教）单层细胞培养管、营养液、Hanks溶液、无菌毛细滴管和腺病毒稀释液。1取已长成单层细胞的培养瓶二只，用无菌毛细滴管吸去管中液体，

19、用Hanks溶液洗二次。2用无菌的1毫升吸管吸稀释的腺病毒液0.1毫升加入一只单层细胞培养瓶中，另一只加0.1毫升营养液不接种病毒作为对照，细胞瓶放平，使其接触整个细胞层，置37作用1小时，使病毒吸附到细胞上。3取出单层细胞瓶，每只中加入营养液0.9毫升，盖紧后置37孵箱中培养12天。4取出细胞在低倍显微镜下观察，注意种毒与对照二管的细胞形态，排列等。注：为方便保存，此处观察的细胞已经过固定和染色。五、血凝抑制试验 血凝抑制试验系利用血凝素特异性抗体与病毒表面相应血凝素相互作用，使病毒血凝现象抑制的试验。 血凝抑制试验适用于具有血凝素的病毒，试验必须预先滴定病毒的血凝效价，然后采用一定量的病毒

20、，通常是加入4个血凝单位的病毒，在与血凝滴定试验相同的反应条件下来进行测定。 （一）血凝效价的滴定 收获的尿囊液（病毒悬液）、32孔有机玻璃板。0.2 ml移液器、移液头、小试管一支、0.5鸡红细胞悬液、生理盐水 按下表进行，其操作程序为： 1将有机玻璃板孔从110号进行编号，从第一孔起直至第10孔，每孔加生理盐水0.2ml。 2将尿囊液在试管中作15稀释，即吸取0.8ml生理盐水，加入0.2ml尿囊液。然后吸取15稀释的尿囊液0.2 ml加入到第1孔，混匀后（吹吸3次），从中吸出0.2 ml移入第2孔，如此对倍稀释直至第9孔，于第9孔中吸出0.2 ml，弃入消毒缸内。第10孔不加尿囊液作为对

21、照。 3自第10孔起，反方向每孔补充生理盐水0.2 ml。1 自第10孔起，反方向每孔加入0.5 鸡红血球0.4 ml，摇匀后放室温静止45分钟，观察结果，并确定血（球）凝（集）效价。孔 号12345678910生 理 盐 水（ml）尿 囊 液（ml）0.2+0.2 *0.2弃去病 毒 稀 释 度11 012 014 018 01160132016401128012560对 照补 充 液（ml）（生 理 盐 水）各 0.20.5 鸡 红 细 胞悬 液（ml ）各 0.4*为15稀释尿囊液 结果观察：凡出现凝集者，红细胞平铺孔底，呈倒张的伞状，边缘有卷起的趋向。凝集特别显著者为，次之为，凝集清楚

22、可见者为，稍呈凝集者为；阴性者血球沉于孔底中心，呈钮扣状。 血凝效价：指呈现凝集时病毒的最高稀释度。此时的稀释度即为1个血凝单位。若1个血凝单位为1640，则4个血凝单位为1160。 （二）血凝抑制试验 4个血凝单位的病毒液，15稀释的抗血清，32孔有机玻璃板，0.2 ml移液器，移液头，0.5鸡红细胞悬液，生理盐水 1将有机玻璃板孔从110号进行编号，从第一孔起直至第9孔，每孔加生理盐水0.2ml，第10孔加0.4ml。 2于第1孔和第8孔中各加入15稀释血清0.2ml。将第1孔混匀后从中吸出0.2ml移入第2孔，如此作对倍稀释直至第7孔，于第7孔中吸出0.2ml弃入消毒缸内。第8孔为血清对

23、照。 3于第1至第7孔中各加入0.2ml 4个血凝单位的病毒液，第9孔亦加入0.2ml病毒液作病毒对照。 4稍加振摇后，每孔加入0.5鸡红细胞0.4ml，室温静置45分钟，观察结果。血 清 病 毒 红 细 胞抗 血 清 （ml） 0.2弃去0.4血 清 稀 释 度110120140180116 013 204 个 血 凝 单 位 病 毒（ml）0.5 鸡 红 细 胞 悬 液（ml）*为15稀释的抗血清结果：红 细 胞 对 照 孔 ，血球沉于孔底中心，呈钮扣状，表明红细胞无自凝现象；病毒对照孔，呈现凝集，表明病毒血凝功能正常；血清对照孔，血球沉于孔底中心，呈钮扣状，表明血清中无凝集因子；测定孔中

24、，如血球沉于孔底中心，呈钮扣状，表明血清中有相应的血凝抑制抗体，为阳性孔；反之凝集者为阴性孔。血凝抑制效价：呈完全血凝抑制时的最高血清稀释度。附录：1鸡胚的准备和发育过程 病毒的鸡胚培养，多采用来亨鸡卵，其优点为卵壳色白而薄，易于照视，如不能得到，一般家鸡卵也可应用。孵育温度通常在3839之间，相对湿度4060。孵育45天后即可在检蛋灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。未受精之鸡蛋于4日后仅见模糊卵黄黑影，无鸡胚迹象。活的鸡胚于4日后即可见清晰之血管小网，中有刚刚发育之胚胎，自45天以后逐日检查胚胎生活情况，逐日增大之鸡胚则可见到清楚之绒毛尿囊膜上的血管及活动之胚胎。 受精卵在通过输卵管时，已开始

25、分裂，当产卵时已在卵黄中形成细胞，名为胚点，在适宜温度下即能继续分裂发育，形成中、外、内三胚层，逐步发育成各种器官。 鸡胚的最外层为石灰质之卵壳，上有细孔以行气体交换，下层为壳膜，很容易与孵壳分开，壳膜的功能是使气体分子和液体分子在内外两方面进行交换，因此在孵育鸡胚时需要一定的湿度和气流，如果湿度太低，鸡胚就容易脱水，引起鸡胚死亡，气流同样是重要的，孵育时如空气不流通，亦可造成鸡胚的死亡。因此壳和壳膜不是简单的覆盖，而是本身具有维持内部生命的功能。气室的功能是呼吸和调节压力，壳膜之下为血管丰富的绒毛尿囊膜，外为绒毛膜，系外胚层形成，内为尿囊膜，由内胚层形成，两膜结合之间为中胚层，因此绒毛尿囊膜

26、是尿囊膜在生长发育过程中与绒毛膜相连而成，血管较多，起着胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。鸡胚孵育至第3天即出现尿囊，为直肠腹侧部分的膨出物，尿囊腔是胚胎的排泄器官，内含尿囊液，初为透明液体，是单纯生理盐水溶液，以后尿囊液中尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第1213天，尿囊液开始变得浑浊，若将其冷却即可见有沉淀物形成，主要是尿酸盐类。因此，在制备流感病毒抗原时，通常用盐水将尿液加以稀释后放4备用，这样可减少尿酸盐的沉淀，尿液量在鸡胚发育的第11至13天最高，平均为66.5毫升。 羊膜为胚胎最内层包被，系由外胚层组成，羊膜腔盛有羊水，胎体浸泡于其中，羊水在起初是单纯的生理

27、盐水，后来则蛋白质含量增加，羊水量平均为1毫升左右。 卵黄囊附着于胚胎，卵黄囊膜系由内胚层的细胞组成，对培养病毒有重要作用，内包有卵黄，为胚胎之养料，卵白位于卵之锐端，为胚胎发育晚期之养料。 2Hanks溶液配制，先配成下列甲、乙两种原液。 原液甲： NaCl 160克 KCl 8克 加入800毫升双蒸水 MgSO47H2O 2克 MgCl2H2O 2克 CaCl2 2.8克溶于100毫升双蒸水 将上述二溶液混合后加双蒸水至1000毫升，加2毫升氯仿作为防腐剂，保存于4冰箱。 原液乙： Na2HPO412H2O 304克 KH2PO4 1.2克 加入800毫升双蒸水 葡萄糖 20克 04酚红液 100毫升 加入双蒸水使成1000毫升，加入2毫升氯仿作为防腐剂，保存于4冰箱，使用前按以下比例配成。 原液甲 1份 原液乙 1份 双蒸水 1