麦类病毒病测报技术规范Word格式.docx

1、本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心。本标准主要起草人：曾娟、姜玉英、周彤、吴燕、高军小麦黄花叶病测报技术规范1 范围本标准规定了小麦黄花叶病相关术语和定义、病情系统调查和普查方法、土壤和小麦植株带毒率测定、发生程度预测及测报资料收集、汇报和汇总等方面的技术和方法。本标准适用于冬麦区小麦黄花叶病调查和预测预报。2 术语和定义2.1 病原物pathogen of wheat spindle streak disease小麦黄花叶病（曾称小麦梭条斑花叶病）病原物为小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus，以下简称WYMV），属马铃薯Y病毒科大麦黄花叶病毒属。2.2 传

2、毒介体及传播方式vector and transmission of WYMVWYMV的传毒介体为禾谷多粘菌（Polymyxa graminis Led.）,是一种习居于土壤中的低等菌物，也是专性寄生于小麦根部的弱寄生菌。WYMV的传播方式为禾谷多粘菌胞内传播，即病毒存在于休眠孢子内，休眠孢子萌发后产生游动孢子，病毒随游动孢子侵入植物根部细胞而进入植株体内。自然条件下，WYMV主要通过带菌（病毒）病土、病根残体随病田流水等方式扩散传播。实验室中也可经病株汁液摩擦接种传播，不能经种子、昆虫传播。2.3 病情严重度severity level of disease指植株各部分及整体发病的程度。小麦

3、黄花叶病的病情严重度，以叶片花叶、黄化和坏死程度、条纹斑占叶面积比率、心叶受害程度、植株整体矮化程度等要素划分，共分4级：0级：无症状；1级：轻度花叶（即一般不产生明显的条纹斑），叶片不黄化或仅少数叶片黄化，植株矮化不明显；2级：花叶明显（即条纹斑明显、但占叶面积的50%以下），部分叶面黄化，少数叶片枯死，分蘖黄化萎缩，病株轻度矮化；3级：严重花叶（即条纹斑占叶面积的50%以上），心叶扭曲或呈缩顶状，叶片普遍黄化，部分叶片及分蘖或整株枯死，植株明显矮化。2.4 病情指数disease index反映某一田块内病害发生的普遍性和严重程度的综合指标，用以表示病害发生的平均水平。按式（1）进行计算：

4、 （1） 式中：I病情指数；i各严重度级值；li各严重度级值对应病株数；L调查总株数。2.5 平均病情指数average of disease index指某一地区病情普查中，各种发病水平的田块在总调查田块中所占比例的综合权重值。按公式（2）进行计算： （2）其中：Im平均病情指数；n 病情普查中病田序号（n=1,2,3, ，N）；N病情普查中详细调查的病田数；In各病田相应病情指数；F病情普查病田率。3发生程度分级指标小麦黄花叶病发生程度以平均病情指数为主要指标，以地区内的病田率为参考指标确定。发生程度划分为5级，即轻发生（1级）、偏轻发生（2级）、中等发生（3级）、偏重发生（4级）、大发生

5、（5级），各级指标见表1。表1 小麦黄花叶病发生程度分级指标发生程度指标1级2级3级4级5级平均病情指数（Im）0.001Im11Im55Im1010Im20Im20病田率（F，%） 1F55F1010F2020F30F 304病情调查4.1 系统调查4.1.1 调查时间 小麦播种后30天至越冬前，以及小麦返青期至抽穗期，每15天调查1次。4.1.2 调查地点选择常年发生严重、地势低洼、种植感病品种、播种期偏早的3块田作为系统调查对象田。4.1.3 调查方法每块田单对角线5点取样，两头的点距地边2m以上，其余3点等距取样，每点查50株，调查病株率、病情严重度，并计算病情指数。将调查结果记入小麦

6、黄花叶病定点病情系统调查表（附录A表A.1）4.2 病情普查4.2.1 调查时间秋苗期在系统调查田见病5-7天后普查一次，春季返青期在系统调查田见病5-7天后及发病高峰期各普查一次。4.2.2 调查方法选择能代表当地小麦主栽品种、种植方式（播期早晚、播种量、条播或撒播）、栽培条件（施肥和灌溉水平）和长势（好、中、差）的100块田，用目测法观察田块中有无病株，计算病田率。在病田中随机选择10块田进行病情详细调查，具体方法见4.1.3。根据各病田病情指数和病田率，计算该次普查平均病情指数。结果记入小麦黄花叶病病情普查表（见附录A表A.2）及小麦黄花叶病模式报表（见附录B）。5根际土壤和小麦植株带毒

7、率测定5.1 调查时间在秋苗期普查以及返青期第一次普查时进行。5.2 采样方法 在发病田块调查的5个取样点中，每点随机选择10株（丛）作为采样点，每点取小麦根系3cm以内、距土表10cm左右的根际土壤10g及对应植株小麦叶片5片作为测定标样。5.3 测定方法根据酶联免疫吸附检测法原理（参见附录C），采用斑点免疫法（Dot-immunobinding assay，DIBA，参见附录D）进行测定：根据测定标样呈阳性反应（带毒）情况，按公式（3）计算根际土壤或小麦叶片带毒率： （3）式中：V 带毒率；S 带毒标样数；Z 测定总标样数。6 预测方法根据小麦品种感病性、早播小麦面积比率、根际土壤和小麦植

8、株带毒率、小麦越冬期及返青期天气情况，采用综合分析法预报发生趋势。若以下条件皆满足，则病害将严重发生。1. 品种感病；2. 早播小麦面积比率大（占20%以上）；3. 上年发病情况（达中等以上程度发生）；4. 秋季播种后多雨且气温较低（413，最适气温为10）；5. 冬季（小麦越冬期）寒冷（气温为5以下）；6. 春季连续低温（气温保持在517之间持续30天以上，最适气温为15）。7 测报资料收集、汇总和汇报7.1 资料收集小麦播种期和各期播种的小麦面积，及其它必需的栽培管理资料,主要品种的栽培面积、生育期和抗病性，以及当地气象台（站）主要气象要素的预测值和实测值。7.2 资料汇总对小麦黄花叶病发

9、生期和发生量进行统计汇总，记载小麦种植和病害发生、防治情况，总结发生特点，进行原因分析，结果记入小麦黄花叶病发生防治基本情况记载表（见附录A表A.3）。7.3 资料汇报全国区域性测报站每年定时填写小麦黄花叶病早春模式报表（见附录B）报上级测报部门。附录（规范性附录）农作物病虫调查资料表册（年）站名 盖章站 址（北纬：东经：海拔：）测 报 员负 责 人 全国农业技术推广服务中心编制表A.1小麦黄花叶病病情系统调查表调查日期调查地块调查总株数株各点病株数 株病株率%各级严重度病株数 株病情指数备注序号品种播期面积667m212345合计表A.2小麦黄花叶病病情普查表调查地点调查田块总数块发病田块数

10、 病田率发病田块调查平均病情指数种植品种（早/中/晚）栽培条件长势调查总株数 病株数 678910表A.3 小麦黄花叶病发生防治基本情况记载表（麦收后汇总全省情况，省站及时上报）小麦种植情况：小麦面积（hm2） 耕地面积（hm2） 小麦面积占耕地面积比率（%） 主栽品种 早播面积（hm2） 占小麦面积比率（%） 灌溉面积（hm2） 占小麦面积比率（%） 施肥面积（hm2） 占小麦面积比率（%） 小麦黄花叶病发生情况：发病面积（hm2） 占小麦面积比率（%） 成灾（减产30%以上）面积（hm2） 占发病面积比率（%） 防治情况：抗病品种种植面积（hm2） 追肥（返青期施氮肥）面积（hm2）最终发

11、生程度 实际损失（吨） 挽回损失（吨） 发生和防治概况与原因简述附录B表B.1 小麦黄花叶病测报模式报表（MWYMA）要求汇报时间：秋苗期普查和返青期第一次普查后汇报查 报 内 容查报结果病虫模式报表名称MWYMA调查日期（月/日）根际土壤带毒率 （%）小麦叶片带毒率 （%）小麦早播面积比率 （%）小麦早播比历年平均值增减 （%）病田率（%）平均病情指数比历年平均值增减 （%）预计发病程度 （级）11预计发病面积 （hm2）附录C（资料性附录）酶联免疫吸附法检测原理将酶分子与抗体或抗体分子共价结合，此种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶的生物化学活性，此酶标记抗体可与存在于组织细胞或吸

12、附于固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下催化底物水解、氧化或还原等反应，产生有颜色的物质。酶降解底物的量与呈现的颜色成正比。用于标记的酶：1.辣根过氧化物酶 （Horseradish Peroxidase, HRP）;2.碱性磷酸酶 （Alkaline phosphatase）。附录D斑点免疫法（Dot-immunobinding assay，DIBA）硝酸纤维素膜（NC）具有很强的静电吸附力，在中性条件下即可有效地吸附蛋白质等生物大分子。因而，将抗原吸附于硝酸纤维素膜后，就可利用膜作为固相载体进行抗原抗体反应。当加入抗体后，即可与膜上的抗原结合，然后再加入带

13、有标记物的抗抗体，使标记通过抗抗体和相应抗体的结合间接地交联于纤维素膜上。最后加入标记物相应的底物后，标记物即可与底物作用形成不溶性产物,呈现斑点状着色，从而判定结果。所需仪器设备、试剂材料和方法步骤如下：D1. 仪器与设备D1.1 台式离心机（5 000r/min）D1.2 具盖塑料离心管：200 LD1.3 培养皿D1.4 塑料盒（规格为100mm50mm）D2. 试剂和材料D2.1 包被缓冲液：0.05mol/L，pH=9.6。称取 1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3，加水定容至1 000mL,用HCl调pH值至9.6，4保存。D2.2 磷酸盐Tween20缓冲液：0.0

14、1mol/L，pH=7.5。称取40g NaCl, 1g KCl, 1g KH2PO4和15g Na2HPO4，加水定容至5 000mL，用HCl调节pH值至7.5，再加入2.5mLTween-20，4保存。D2.3 磷酸盐缓冲液：0.02mol/L，pH=7.5。称取40g NaCl, 1g KCl,1g KH2PO4, 15g Na2HPO4，加水定容至2500mL，4保存。D2.4 1%脱脂奶粉封闭液：1g脱脂奶粉加入100mL 3.2.2所述磷酸盐Tween20缓冲液中，4保存。D2.5 2%小牛血清蛋白（BSA）封闭液：小牛血清蛋白（BSA）0.2g加入100mL 3.2.2所述磷酸

15、盐Tween20缓冲液中，4保存。D2.6 碱性磷酸酯酶固体显色底物溶液。NBT/BCIP，4保存备用，使用时加入10 mL2.2.3所述磷酸盐缓冲液中，再加入10LH2O2。D2.7 一抗。小麦黄花叶病的多抗，效价为110000，18保存。D2.8 二抗。Sigma公司Anti-Rabbit IgG-AP，效价为15000，18保存。D3 样品准备。在研钵中将土壤或小麦叶片研碎，加100L 包被缓冲液，离心（5000r/min） 3min，取上清液备用。D4 封闭。预先用铅笔将硝酸纤维素膜（NC）划成5mm5mm的正方格，取5.3.1获得的上清液3L点于NC膜上正方格内（以不超出正方格一半为

16、准）；同时各取3L左右病毒初提液（或确定为已感WYMV的小麦叶汁液）和蒸馏水（或健康叶片汁液及无病土浸出液）点于膜上预先标记好的正方格内，分别作为阳性对照和阴性对照；室温晾干膜。将干燥的膜置于塑料盒或玻璃培养皿，加入1%脱脂奶粉或2小牛血清蛋白（BSA）封闭液，将膜完全浸没，37轻轻摇晃，封闭30min。D5 孵育。用镊子压住膜，倒弃封闭液，以一抗和封闭液按（1:200001:40000）比例稀释配制孵育液。将膜完全浸入孵育液，37轻轻摇晃，孵育（11.5）h。用镊子压住膜倒弃孵育液，加入磷酸盐Tween20缓冲液，将膜完全浸没，轻轻摇晃，洗膜（35）min，用镊子压住膜倒弃洗液，重复洗膜三次

17、。D6 二抗孵育。用镊子压住膜，倒弃洗液，以辣根过氧化物酶标记的二抗和封闭液按1:2500比例稀释配制二抗孵育液，将膜完全浸入二抗孵育液，37轻轻摇晃，孵育（1.52）h，再用镊子压住膜倒弃二抗孵育液。加入磷酸盐Tween20缓冲液，将膜完全浸没，轻轻摇晃，洗膜（35）min，用镊子压住膜倒弃洗液，重复洗膜三次。D7 显色。用镊子压住膜倒弃洗液，加入碱性磷酸酯酶显色底物溶液，37静置显色30min。以蒸馏水冲洗膜，室温晾干。D8 结果观察。显色后首先观察对照的颜色反应，阳性对照应显蓝紫色，阴性对照应不显色，再观察样品的颜色反应，如果显蓝紫色，则认定该样品携带病毒；如果不显色，则认定该样品不携带病毒。若出现阳性对照不显色或阴性对照显蓝紫色中任一种情况，则应分析原因，并重新进行试验。