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1、关键字：最小抑制浓度；抗生素；大肠杆菌；枯草芽孢杆菌Kanamycin, ampicillin and tetracycline evaluation of the inhibition of bacterial killing effectsYang fang（College of life and environmental science, Minzu University of china, Beijing,100081 ）Abstract：Objectiveunderstand the impact of antibiotics on microbial growth, learn

2、basic methods of spectrum antimicrobial testing; design independently, master evaluate effects of chemical agents to kill suppression methods; grasp evaluate effects of chemical agents to kill suppression methods.MethodsThis experiment measured use pour bacterial suspension concentration, filter pap

3、er assay antibiotic minimum inhibitory concentration （MIC） and the effect of pH on the effects of antibiotics and t-test of the experimental results were analyzed statistically.ResultsThe tests used Escherichia coli and Bacillus subtilis bacteria suspension concentration was 1.3107CFU/mL, 7.1107 CFU

4、 / mL.Escherichia coli kanamycin, ampicillin and tetracycline MIC was 0.006 mg / mL, 0.098 mg / mL and 0.781mg/mL.Bacillus subtilis, kanamycin, ampicillin and tetracycline MIC was 0.024 mg / mL, 0.391 mg / mL and 0.195mg/mL; kanamycin killing effect on E. coli, Bacillus subtilis for the inhibition o

5、f E. coli tetracycline inhibition of Bacillus subtilis to kill, penicillin is the inhibition of Bacillus subtilis, Escherichia coli occur due to resistance, so the role of Escherichia coli penicillin is not obvious.ConclusionsFor the same drug, a low concentration of drug suppression kill little eff

6、ect on bacteria and with the increasing concentration of its suppression kill more and more obvious effect; same drug in the same concentration of different suppression kill bacteria have different effects; different agents of the same suppression of bacterial killing effects are different.Keywords:

7、 MIC;Antibiotic; E.coli;Bacillussubtilis一、引言：1.实验目的：1.1了解抗生素对微生物生长的影响，学习抗菌谱试验的基本方法；1.2巩固已学习的微生物实验技能，学以致用；1.3自主设计方案，通过滤纸片法研究一些常用抗生素的抑杀菌效果，掌握评价化学抑杀剂作用效果方法；1.4掌握评价化学抑杀剂作用效果方法；1.5培养学生的团队合作意识；1.6培养学生总结实验结果和撰写科研论文的能力。2.实验原理：2.1抗生素在人们日常生活中常用到各种抗病原体药物，包括各种抗生素和中药类复方抗菌药物等。抗生素是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）产生、能抑制或杀灭其他微生物的

8、物质。抗生素既不参与细胞结构也不是细胞内的贮存性养料对产生菌本身无害但对某些微生物有拮抗作用，是微生物在种间竞争中战胜其他微生物保存自己的一种防卫机制。抗生素分为天然品和人工合成品，前者由微生物产生，后者是对天然抗生素进行结构改造获得的部分合成产品。2.1.1本次实验所用抗生素及其作用原理：氨苄青霉素：抑制细胞壁中肽聚糖的合成；卡那霉素：一种蛋白质生物合成抑制剂，通过与30S核糖体结合从而致使mRNA密码误读；四环素：与核蛋白体的30S亚单位结合，而阻止氨酰基tRNA同核蛋白体结合，从而抑制肽连的增长和影响细菌蛋白质的合成；2.1.2抗生素具有不同于化学药物的特点：抗生素则能选择性地作用于菌体

9、细胞DNA、RNA和蛋白质合成系统的特定环节，干扰细胞的代谢，妨碍生命活动或使停止生长甚至死亡抗生素的抗菌活性主要表现为抑菌、杀菌和溶菌三种现象。抗生素抗菌作用的表现与使用浓度、作用时间、敏感微生物种类以及周围环境条件都有关系。抗生素的作用具有选择性，不同抗生素对不同病原菌的作用不一样。对某种抗生素敏感的病原菌种类称为该抗生素的抗生谱（抗菌谱）。广谱抗生素对多种病原菌有抗生作用，例如青霉素对多种革兰氏阳性细菌都有良好药效，链霉素对多种革兰氏阳性和阴性细菌都有良好药效，对结核杆菌有特殊的疗效。有效作用浓度。各种抗生素一般都在很低浓度下对病原菌就发生作用，这是抗生素区别于其他化学杀菌剂的又一主要特

10、点。各种抗生素对不同微生物的有效浓度各异，通常以抑制微生物生长的最低浓度作为抗生素的抗菌强度简，称有效浓度。有效浓度越低，表明抗菌作用越强。有效浓度在100mg/L以上的属于作用强度较低的抗生素；有效浓度在lmg/L以下是作用强度高的抗生素。2.1.3抗生素的作用机制：抑制细胞壁合成（青霉素、头孢菌素、杆菌肽）；干扰细胞膜（多粘菌素）；抑制蛋白质合成（与50S（30S）核糖体结合，氯霉素，红霉素）；抑制DNA复制（丝裂霉素）；抑制RNA转录或合成（放线菌素D、利福平）。2.1.4细菌对抗生素（包括抗菌药物）的抗药性的4种机制使抗生素分解或失去活性：细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进

11、入细菌内的抗生素使之失去生物活性。使抗菌药物作用的靶点发生改变：由于细菌自身发生突变或细菌产生某种酶的修饰使抗生素的作用靶点（如核酸或核蛋白）的结构发生变化，使抗菌药物无法发挥作用。细胞特性的改变：细菌细胞膜渗透性的改变或其它特性的改变使抗菌药物无法进入细胞内。细菌产生药泵将进入细胞的抗生素泵出细胞：细菌产生的一种主动运输方式，将进入细胞内的药物泵出至胞外。2.2传统中药的抗菌活性传统中药在维系人们的健康中发挥重要的作用。其中一些药物具有较强抗菌活性被人们所选用。如双黄连（金银花、黄芩、连翘）是一种理想的抗病毒及细菌感染的中药新剂型，清热解毒。用于风热感冒发热，咳嗽，咽痛。消炎利胆片（穿心莲、

12、溪黄草、苦木），清热、祛湿、利胆。用于肝胆湿热引起的口苦、肋痛；急性胆囊炎、胆管炎。2.2.1传统中药黄连素的抗菌活性黄连素是一种重要的生物碱，是我国应用很久的中药。可从黄连、黄柏、三颗针等植物中提取。它具有显著的抑菌作用。常用的盐酸黄连素又叫盐酸小檗碱。黄连素能对抗病原微生物，对多种细菌如痢疾杆菌、结核杆菌、肺炎球菌、伤寒杆菌及白喉杆菌等都有抑制作用，其中对痢疾杆菌作用最强，常用来治疗细菌性胃肠炎、痢疾等消化道疾病。临床主要用于治疗细菌性痢疾和肠胃炎，它无抗药性和副作用；2.3检测化学抑杀菌剂的作用活性的方法通过杯碟法（管碟法）、滤纸片法（琼脂扩散纸片法）、石炭酸系数法及生长曲线测定等方法鉴

13、定不同抑杀菌剂的作用效果；同时采用杯碟法（管碟法）、滤纸片法（琼脂扩散纸片法）还可以检测物品（如食品中）是否含有化学抑杀菌剂；2.3.1关于滤纸片法（1）滤纸片法适用条件:不易挥发的化学药剂；（2）滤纸片法工作原理:利用滤纸作为药剂的承载体，放置于含有待检测菌种的平板上，使药剂在琼脂中扩散，在不同浓度下对细菌的抑菌效力不同，产生可见的抑菌圈。测定抑菌圈直径大小，抑菌圈直径大越大，该药剂的杀菌能力越强；（3）滤纸片法注意事项：滤纸片大小一致（6mm，选用打孔器获取）；滤纸片吸附量一致（以移液器量取20-40L，可以采用2-4片叠加吸附，增加吸附剂量）菌量控制合理，以形成菌苔（107-109cfu

14、/mL）；2.3.2关于杯碟法（1）适用条件：（2）工作原理：将牛津杯放置于含有待检测菌种的平板上，将试验药剂加入牛津杯中（200L）,当药剂在琼脂中扩散，在不同浓度下对细菌的抑菌效力不同，产生可见的抑菌圈。（3）注意事项：牛津杯放置要平；加药剂量一致（以移液器量取）；2.4关于菌液的浓度测定2.4.1比浊法在一定范围内，微生物细胞浓度与透光度呈反比与光，密度呈正比。而光密度或透光度可以通过光电池测出；2.4.2其他方法采用倾注法或涂布法进行活菌计数二、实验材料、仪器、试剂2.1实验材料：大肠杆菌菌种（G-）、枯草芽孢杆菌菌种（G+）；2.2实验仪器高压蒸汽灭菌锅、鼓风干燥箱、移液器、涂布棒、

15、平板、试管、酒精灯、打孔器、三角瓶、微波炉、培养皿、镊子、线绳、烧杯、玻璃棒、试管塞等；2.3实验试剂：2.3.1牛肉膏蛋白胨培养基的配方表1 牛肉膏蛋白胨培养基的配方Table 1Recipe beef extract peptone medium成分牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂水含量3g10g5g18g1000mLPH为7.07.2121灭菌20min2.3.2其他试剂生理盐水100mg/mL氨苄青霉素、卡那霉素、四环素母液各1mL（配好的抗生素溶液应冷藏保存）三、实验方法3.1采用倾注法的接种方法对所用菌种的浓度进行测定3.1.1实验用品的准备阶段（1）按照牛肉膏蛋白胨培养基的配方配制牛肉膏

16、蛋白胨培养基350mL,分装在六个试管（约为试管体积的1/3用于扩繁菌种）和几个锥形瓶中，并进行包扎；（2）配制200mL的生理盐水，分装在12个试管（每支试管中用移液管准确量取9mL）中，剩下的生理盐水装在锥形瓶中，并进行包扎；（3）取两只涂布棒和足量两种移液器的针头进行包扎；（4）用打孔器打约300个滤纸片并进行包扎；（5）将上述包扎所得在高压蒸汽灭菌锅中灭菌（在121温度下灭菌20min）；（6）将无菌操作台的紫外灯打开灭菌，计时20min后放气，以备用；3.3.2对菌种进行扩繁（1）将灭菌的培养基倒入6支试管中，倒入试管中培养基的体积约为试管体积的1/3，制作斜面；（2）每三支试管扩繁

17、一种菌，用接种环挑取菌种，在斜面上接种；（3）将接种好的细菌放入恒温培养箱中进行培养，以用于接下来的实验；3.3.3倾注法接种测菌种的浓度（1）将3.3.1步骤中做的物品放入无菌操作台中，并准备好灭过菌的平板；（2）将装有培养基的试管放在一根玻璃棒上制备斜面并进行标记，每三支试管标记为一种菌；（3）将接种环在酒精灯上灼烧，待温度合适，挑取一环菌接种在斜面上，并与标记菌命相对应；重复此操作至接种完六支试管，将所新接菌种放入37恒温培养箱中进行培养；（4）待锥形瓶内的生理盐水冷却至室温，向有菌种的试管中放入大约5mL的生理盐水，作为10-1稀释度菌悬液；（5）对每种菌的10-1稀释度菌悬液进行稀释

18、，具体的稀释过程如图1所示；1mL 1mL1mL1mL1mL10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6图1 菌悬液稀释示意图Figure 1 Schematic diluted bacterial suspension（6）用移液器取每种菌的每种浓度（从10-2至10-6）的稀释液1mL放于每一平板中，并做好标记，每种菌的每种浓度的稀释液有两个平板做平行试验，将适宜温度的培养基倒入平板中（每个平板约15mL）；（7）将上述20个平板倒置放入37恒温培养箱中培养24h；3.2测量每种抗生素最小抑制细菌浓度MIC（1）按照牛肉膏蛋白胨培养基的配方配制培养基400mL,并分装在锥形瓶

19、中，进行包扎灭菌；（2）配制适量生理盐水与锥形瓶中进行包扎灭菌；（3）将三种抗生素原液进行二倍稀释，以0.9%无菌生理盐水为稀释液，得100g/mL，50g/mL，25g/mL，12.5g/mL，6.25g/mL稀释液；（4）取出扩繁的大肠杆菌及枯草芽孢杆菌各一支，向其中加入温度适宜的生理盐水（约5mL）；（5）将灭过菌培养基倒入平板中（每个平板大约15mL），吸取每种菌种的菌悬液200L于每个平板中（每种菌有九个平板），用涂布棒进行涂布接种；（6）在无菌环境下，用移液器吸取30L稀释好的各浓度的抗生素溶液湿润滤纸片（2层滤纸片叠在一起），将滤纸片贴在含有待检测菌种平板上，不同浓度的同一种抗生

20、素贴在一个平板上，每种抗生素再做两组平行试验，平板中间贴上对照组（生理盐水），故一个平板上贴6个滤纸片（5+1），做上标记；（7）将平板倒置放入37恒温培养箱中培养24h；（8）观察记录前一天实验的抑菌圈的大小，以出现的最小抑菌圈（7.0mm）的浓度作为MIC，如果未出现7.0mm 的抑菌圈则将抗生素的最小稀释浓度继续稀释，重复以上七步，并进行观察，以至于得到各种抗生素的最小抑制浓度；3.3测定每种抗生素对每种菌的作用效果（表现为抑制或者杀灭）（1）将抑菌圈大小合适的一组平板的滤纸片接下，并放入37恒温培养箱中培养24h；（2）观察实验结果，若原抑菌圈中出现新的菌落则说明该抗生素对该菌的作用效

21、果为抑制作用，若原抑菌圈中未出现新的菌落组说明该抗生素对该菌的作用效果为杀灭作用；3.4测定一种抗生素的最适pH（1）pH选5、6、7、8、9进行最适pH的选取；（2）选用抑菌效果最好的抗生素卡那霉素，将抗生素的的pH分别调至5、6、7、8、9五个点；（3）倒3个平板，用涂布法接种枯草芽孢杆菌3个平板；（4）在无菌环境下，用移液器吸取30L抗生素溶液湿润滤纸片（2层滤纸片叠在一起），将滤纸片贴在含有待检测菌种平板上，每种浓度抗生素贴在同一个平板上，平板中间贴上对照组（生理盐水），故一个平板上贴6个滤纸片（5+1），做上标记，再做两组平行试验；（5）将上述的3个平板放入37恒温培养箱中倒置培养2

22、4h。3.5将所有的实验结果做图像采集四、实验结果4.1倾注法接种测菌悬液浓度的结果见下图和下表4.1.1测菌悬液浓度的平板结果见下图图2 测量菌悬液浓度的平板Figure 2 tablet measuring the concentration of the bacterial suspension通过观察平板菌落的形成情况得到，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌稀释液为10-2和10-3因浓度太大无法进行计数，对其余平板上的菌落进行计数并进行数据的记录。4.1.2各浓度接种液菌落的计数结果见下表表2测定菌悬液浓度的结果Table 2The results of measuring the concen

23、tration of the bacterial suspension菌种大肠杆菌AB10-2无法计数10-310-4146332838110-566206687410-6326456111两个稀释度菌落数之比4.83.1-菌落总数/（CFU/mL）6.61062.11076.81067.4106平均数/1.31077.1106根据检测平板的菌落技术方法得到结果，大肠杆菌菌悬液浓度为1.3107 CFU/mL，枯草芽孢杆菌菌悬液浓度为7.1106 CFU/mL。4.2测定每种抗生素对每种细菌的最小抑制浓度MIC结果见下图和下表4.2.1第一次实验所得抗生素对细菌的抑菌圈见下图图3 第一次实验所

24、得每种抗生素对每种菌的MICFigure 3 for the first time each of the experimental antibiotic MIC for each strain注：卡那霉素、四环素、青霉素1,2,3,4,5号浓度（mg/mL）分别为100、50、25、12.5、6.25观察平板中每种抗生素对每种菌的抑菌圈大小，虽然由于滤纸片上的抗生素溶液没有晾干就贴在平板上，导致抗生素溶液到处流淌，并且抗生素的浓度太大，所产生的抑菌圈连在一起，无法准确测量抑菌圈大小的准确数值，但通过观察，依然可以得到，5号滤纸片上的抗生素浓度（6.25mg/mL）依然很大，需继续对抗生素进行

25、稀释才能得到每种抗生素的最小抑制浓度。通过仔细观察，本组成员观察到大肠杆菌对青霉素出现抗性，见下图图4 大肠杆菌对青霉素出现抗性Figure 4 appears resistant to penicillin E.coli4.2.2第二次实验继续稀释抗生素所得抑菌圈大小统计见下图和下表（1）继续稀释抗生素所得抑菌圈大小见下图图5 继续稀释的抗生素对两种细菌所产生的抑菌圈Figure 5 continues to dilute the two antibiotics produced by bacteria inhibition zone卡那霉素、四环素、青霉素1,2,3,4,5号浓度（mg/m

26、L）分别为6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.390625。通过观察，经过改进，将滤纸片上的抗生素溶液晾干后贴在平板上，本次实验平板上已出现均匀的抑菌圈，并随抗生素浓度梯度变化抑菌圈出现明显的大小变化。用直尺测量抑菌圈直径并进行数据的记录。（2）各种抗生素对大肠杆菌的抑菌圈大小见下表表3 继续稀释的抗生素对大肠杆菌所产生的抑菌圈大小统计表Table 3 Inhibition zone size tables continue diluted antibiotic produced by Escherichia coli抗生素抗生素浓度编号抑菌圈大小（mm）平均值（mm）卡那

27、霉素1234522.0 22.0 24.020.0 21.0 20.018.0 20.0 18.017.0 17.0 18.015.0 15.0 15.022.720.318.717.315.0四环素13.0 13.0 13.010.0 11.0 11.07.0 7.0 9.07.0 7.0 7.06.0 6.0 6.013.010.77.77.06.0氨苄青霉素26.0 25.0 25.021.0 21.0 19.019.0 19.0 20.016.0 17.0 17.014.0 13.0 13.025.319.316.713.3通过上表可以得到：四环素对大肠杆菌的最小抑制浓度为0.78125mg/mL，卡那霉素和氨苄青霉素浓度大，在本次实验中没有得到MIC，需要继续进行稀释。（3）各种抗生素对枯草芽孢杆菌的抑菌圈大小见下表表4 继续稀释的抗生素对枯草芽孢杆菌所产生的抑菌圈大小统计表Table 4 Statistics continue to dilute the size of the zone of inhibition for antibiotics produced by Bacillus subtilis抗生