高效液相色谱法同时测定食品中八种添加剂的研究论文文档格式.docx

1、150mm i.d，5m）柱,以甲醇-0.02M乙酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为1.00mL/min;柱温:25;紫外检测波长0-9min为230nm，9min后为254nm。8种组分的回收率在97.8%102.4%之间,RSD均小于3%。该方法操作方面，结果准确，重现性好，能够满足食品中8种组分的同时测定。关键词：高效液相色谱法; 安赛蜜; 苯甲酸; 山梨酸; 糖精钠; 对羟基苯甲酸酯类Study on the simultaneous determination of eight food additives in food by high performance liquid ch

2、romatographicStudent majoring inFood Science and Engineering zhang xia Tutor tian qi yingAbstract：A high performance liquid chromatographic （HPLC） method was developed for the determinationofSacchar,Benzoic-acid,Sorbicacid,Sodium-cyclamate,Methyl-p-hydroxybenzoate,ethyl-p-hydroxybenzoate,propyl-p-hy

3、droxybenzoate,butyl-p-hydroxybenzoate.The chromatographic analysis was carried out using a Zorbax SB-C18 （4.6150mm i.d, 5m） column. The mobile phase was ammonium acetate aqueous solution-methanol by gradient elution at 1.00 mL/min. The eluation was monitored by UV detector at 230 nm at first 9 mins

4、and 254nm later. The recoveries were 98.3%102.4% and the relative standard deviations （RSD） were gwnerally below 3.0%. The result showed that it was a rapid and accurate method for the determination of these additives in food.Key words: A high performance liquid chromatographic; Sacchar; Benzoic aci

5、d; Sorbic acid; Sodium cyclamate; Parabens一、 前言在仅有的20几年时间内，我国食品工业迅速发展，食品工业的繁荣成了食品添加剂发展的动力源泉，现在“没有食品添加剂工业，就没有食品工业”已经成为这个行业业内人士的共识。食品添加剂是用于改善食品品质、延长食品保存期、便于食品加工和增加食品营养成分的一类化学合成或天然物质。食品添加剂有许多分类方法，按来源可分为天然食品添加剂和化学合成食品添加剂。按功能可分为酸味调节剂、甜味剂、漂白剂、着色剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、营养强化剂等。食品添加剂可以起到提高食品质量和营养价值，改善食品感观性质，防止食品腐败变质，延

6、长食品保藏期，便于食品加工和提高原料利用率等作用。食品添加剂的安全使用是非常重要的。理想的食品添加剂最好是有益无害的物质。食品添加剂，特别是化学合成的食品添加剂大都有一定的毒性，所以使用时要严格控制使用量。食品添加剂的毒性是指其对机体造成损害的能力。毒性除与物质本身的化学结构和理化性质有关外，还与其有效浓度、作用时间、接触途径和部位、物质的相互作用与机体的机能状态等条件有关。因此，不论食品添加剂的毒性强弱、剂量大小，对人体均有一个剂量与效应关系的问题，即物质只有达到一定浓度或剂量水平，才显现毒害作用。JECFA已制定人体每日允许摄入量（ADI）。近年来因食品添加剂应用不当而引起的食品安全问题成

7、为消费者关注的热点，因而，食品添加剂含量检测越为重要。11防腐剂、甜味剂的作用及机理造成食品腐败的原因很多，包括物理、化学和生物等方面，这些因素通常是同时或者连续发生的。由于食品营养丰富，适于微生物生长增殖，而微生物又到处都有，无孔不入，故细菌、霉菌和酵母之类微生物的侵袭通常是导致食品败坏的最主要原因。为了保存食品，可用罐藏、冷藏、干制、腌制或化学保藏等方法。各种方法各具备特点，如正在迅速发展中的速冻等保藏法，有效减缓食品品质劣变，但亦受到设备与成本等条件的限制。在一定的条件下，使用防腐剂作为一种保藏的辅助手段，对防止某些易腐食品的损失有显著效果。它使用简便，一般不需要特殊设备，甚至可使食品在

8、常温及简易包装的条件下短期储藏，在经济上较各种冷热保藏方法优越，故现阶段防腐剂尚有一定的作用。今后随着速冻或其他包藏新工艺的不断发展，防腐剂可能逐渐减少使用。笼统地讲，防腐剂是具有杀死微生物或抑制其增殖作用的物质，从抗微生物的概念出发，可更确切地将此类物质称之为抗微生物剂或抗菌剂。按照抗微生物的主要作用功能，可具体地分为杀菌剂和侠义范围的防腐剂（或称包藏剂），其作用是杀菌或抑菌，常常不易严格区分。例如，同一物质，浓度高时可杀菌，而浓度低时只能抑菌，又如作用时间长可杀菌，缩短作用时间则只能抑菌；还有由于各种微生物性质的不同，同一物质对一种微生物具有杀菌作用，而对另一种微生物仅有抑菌作用。两种并无

9、绝对严格的界限，在食品保藏中往往统称为防腐剂。防腐剂除了要符合食品添加剂的一般要求外，应该具有显著杀菌或抑菌作用，因为病原性微生物可能偶尔存在于食品中。防腐剂还应尽可能具有破坏病原性微生物的作用，防腐剂不应阻碍胃肠道酶类的作用，也不应影响有益的肠道正常菌群的活动。从防腐剂的组成和来源上看，主要是指化学防腐剂。化学防腐剂包括有机化学防腐剂与无机化学防腐剂两大类。有机化学防腐剂主要包括苯甲酸及其盐类、山梨酸及其盐类、对羟基苯甲酸酯类及乳酸等，无机化学防腐剂主要包括亚硫酸及其盐类、二氧化碳、硝酸盐类、游离氯及次氯酸盐等。上述物质除作防腐剂使用外，在食品工业上还有其他用途，如亚硫酸及其盐类常用作漂白剂

10、，硝酸盐及亚硝酸盐主要作为肉类腌制发色剂。此外，有些具有防腐剂作用的物质，如糖、醋食盐以及乙醇之类。在食品保藏中却时广泛使用的。例如早在有史记载以前，劳动人民就在食盐中应用防腐剂，一般来讲，这类物质在正常使用情况下，对人体无害或毒性较小，目前我国食品卫生法规中不列为化学防腐剂加以控制，此类物质具有一定的营养价值，主要作为调味料使用。甜味剂是指使食品呈现甜味的食品添加剂。人们喜爱甜味，但有些食品在制造或加工后，因其本身不具有甜味，需添加一些甜味物质以满足消费者的需要。甜味剂按其来源可分为天然甜味剂和人工合成甜味剂；按其营养价值可分为营养性甜味剂及非营养甜味剂；按其化学结构和性质可分为糖类甜味剂及

11、非糖类甜味剂：按其甜度又可分为一般甜味剂及强力甜味剂等。在上述甜味剂中，蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、果葡糖浆、淀粉糖浆及异麦芽酮糖等习惯上统称为糖，通常视为食品原料，在我国不列入食品添加剂范畴。糖醇类的甜度与蔗糖差不多，但因其热值低，或其和葡萄糖有不同的代谢过程而有某些特殊的用途，一般列为食品添加剂。其他类甜味剂的甜度高，热值很低，有些又不参加代谢，常称为非营养性或低热值甜味剂，是甜味剂中的重要品种。理想的甜味剂应具备以下特点：很高的安全性；良好的味觉；较高的稳定性；较好的水溶性；较低的价格。1.2防腐剂、甜味剂的应用及安全性问题食品添加剂促进了食品工业的发展，也大大改善了人们的生活质量，但在

12、享受食品添加剂所带来的多种好处的同时，也应该看到其消极的一面。应该说，大多数食品添加剂都有一定的毒性。只是程度不同而已，有些食品添加剂还具有特殊的毒性。1.2.1防腐剂苯甲酸（benzoic acid）别名：安息香酸 分子式C7H6O2,相对分子质量122.12白色有丝光的鳞片或针状结晶，质轻，无臭，或微带安息香或苯甲酸的气味。本品为稳定的化合物，但有湿性，相对密度1.2659，沸点249.2 ,熔点121123。100开始升华，在酸性条件下容易随同水蒸气一同挥发。pH值为2.8（25%饱和水溶液）。微溶于水、易溶于乙醇。 在pH值低的环境中，苯甲酸对广泛的微生物有效，惟对产酸菌作用很弱。 在

13、pH值5.5以下时对很多霉菌和酵母没有什么效果。苯甲酸能非选择地抑制较广范围的微生物细胞的呼吸酶系的活性，尤其是具有很强的阻碍乙酰辅酶a缩合反应的作用。此外也是阻碍细胞膜作用的因素之一。由于苯甲酸的溶解度低，使用不便。试剂生产中大多数是使用其钠盐。具体使用方法可参照苯甲酸钠。使用苯甲酸时，一般是先用适量的乙醇溶解后，在添加到食品中去。ADI为05mg/kg（苯甲酸及其盐的总量，以苯甲酸计）。山梨酸（sorbic acid）即2，4-己二烯酸，别名花楸 分子式C6H 8O2，相对分子质量122.13。山梨酸为无色的针状结晶或白色的结晶粉末，无臭或稍带刺激性臭味。山梨酸对光热是稳定的，但在空气中长

14、期放置易被氧化着色。山梨酸的水溶液加热时可随同水蒸气一起挥发。熔点133135，沸点228（分解）。饱和水溶液pH值为3.6，山梨酸微溶于水，但溶于有机溶剂。山梨酸对霉菌、酵母和好气性菌均有抑制作用；但对嫌气性芽孢形成句菌与嗜酸乳感菌几乎无效。山梨酸属于酸型防腐剂，其防腐效果随pH值的升高而降低：但山梨酸适宜pH值范围比苯甲酸为广。山梨酸及山梨酸钾宜在pH值56以下的范围使用。山梨酸能与微生物酶系统中的巯基结合，从而破坏许多重要酶系的作用，达到抑制微生物增殖及防腐目的。ADI为025mg/kg（山梨酸及其盐的总量，以山梨酸计）。对羟基苯甲酸乙酯（ethyl-p-hydroxybenzoate）

15、别名：尼泊金乙酯 分子式C9H 10O3，相对分子质量166.18。对羟基苯甲酸乙酯小而无色的结晶粉末。无臭、稍有涩味，对光和热稳定。无吸湿性，熔点116118，微溶于水，易溶于乙醇与乙二醇。ADI为010mg/kg（以羟基苯甲酸甲酯、乙酯和丙酯的总量计）。对羟基苯甲酸丙酯（propyl-p-hydroxybenzoate）别名：尼泊金丙酯分子式C10H 12O3，相对分子质量180.21。对羟基苯甲酸丙酯小而无色的结晶或白色粉末。几乎无臭、稍有涩味，熔点9598，微溶于水而易溶于乙醇与乙二醇。对羟基苯甲酸丁酯（butyl-p-hydroxybenzoate）别名：尼泊金丁酯 分子式C11H

16、14O3，相对分子质量194.23。对羟基苯甲酸乙酯小而无色的结晶或白色粉末。几乎无臭、稍有涩味，熔点6972，极微溶于水，易溶于乙醇与乙二醇。对羟基苯甲酸酯类对霉菌、酵母和细菌有广泛的抗菌作用。对霉菌与酵母的作用较强，但对细菌特别是革兰阴性杆菌及乳酸菌的作用较差，其烷链愈长，抗菌作用愈强13。对羟基苯甲酸酯类的抗菌作用比苯甲酸的山梨酸强，它是由未电离分子发挥抗菌活力的，但是其效果并不像酸型防腐剂那样易随pH值的变化而变化，重要的是因为其中的羟基被酯化了，其分子在更广的pH值范围内保持不电离。一般在pH值4.8的范围较好。对羟基苯甲酸酯类的作用在于抑制微生物细胞的呼吸酶系和电子传递酶系的活性，

17、破坏微生物的细胞膜结构。应注意对羟基苯甲酸酯类与淀粉共存时会影响其效果。自从苯甲酸钠大量投产后，对羟基苯甲酸酯类的使用就减少了。虽然对羟基苯甲酸酯类有溶解度低的特点，但因其毒性较低，且在非酸性条件下有其独到的作用，故仍有一定的使用价值。为了提高溶解度，可制备成盐类，对羟基苯甲酸酯类的钙盐是稳定的，但钠盐易于吸湿且不稳定。1.2.2甜味剂我国准许使用的甜味剂有：糖精钠、环己基氨基磺酸钠（甜蜜素）、乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）、天门冬酰苯丙氨酸甲酯（又名甜味素）、异麦芽酮糖、乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）、麦芽糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甜菊糖甙、L-a天冬氨酰-N-（2，2，4，4-四甲基-3-硫化三亚甲基）-D

18、-丙氨酰胺（阿力甜）等。其中目前食品中应用较多的且容易超出使用范围的是糖精钠、环己基氨基磺酸钠（甜蜜素）、乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）三种。乙酰磺胺酸钾（acesulfame potassium，安赛蜜；A-K糖）为6-甲基二氧化噁噻嗪的钾盐。安赛蜜为白色结晶物质（单斜结晶形），固体安赛蜜的密度为1.81g/cm3，容积密度在1.11.3 g/cm3。安赛蜜没有显著熔点，加热到200以上就开始分解，分解点决定于加热的速度。在通常测定熔点的条件下，分解点为225；其酸度（ASH）有明显的熔点123.5，在紫外227nm范围内有最大吸收峰，消光系数=1.0762104。安赛蜜的口感比蔗糖甜，高浓度时为蔗

19、糖的100倍，无令人不快，余味持久。安赛蜜在人体内代谢成其他物质，能更快排出体外，因此，他完全无热量，特别适合保健品的生产；另外，它不与食品中成分特别是香精和香料发生反应，故在安赛蜜增甜的产品中，香精可保持稳定。安赛蜜极易溶于水，溶解度随温度升高而增大，远超正常所需浓度。安赛蜜在纯乙醇中的溶解度稍小些，而在乙醇/水溶液中溶解度高于实际标准所需正常浓度。安赛蜜不仅可单独作甜味剂使用，而且与其他甜味剂有显著协同作用，可是总甜度提高，改善产品风味。安全性；ADI为09mg/kg （FAO/WHO：1984） 糖精钠（sodium saccharine） 的生产和应用的历史已有90年，它是甜味剂的老品

20、种，其甜度很高，溶化在1万倍的水溶液中仍有甜味，其甜味接近蔗糖，但若浓度稍大（达到0.026%）时就会带苦味。糖精钠中的杂质邻甲苯磺酰胺对大鼠有致膀胱癌作用，但在对生产过程的中间产物进行试验时，已证实邻甲苯磺酰胺对人体没有致性癌。认为糖精钠摄入人体后不被代谢，经尿排出体外，因此，目前尚有100多个国家批准允许使用，1993年WHO/FAO食品添加剂专家委员会规定可用于食品、饮料及餐饮方面。我国是糖精钠的主要生产和出口国，出口率达到62.2%。按食品添加剂使用卫生标准，糖精钠可用于饮料、酱菜类、复合调味料、蜜饯、配制酒、雪糕、糕点、饼干、面包，最大使用量为0.15g/kg；话梅、陈皮5.0g/k

21、g。1.3防腐剂、甜味剂的检测技术防腐剂和甜味剂的检测已有多年的历史，由于食品中多数防腐剂和甜味剂具有类似的理化性质，因此许多分析技术均把它们放在一起分析。通常采用高效液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、高效毛细管电泳法、离子色谱法等进行分析，其中高效液相色谱法、气相色谱法和离子色谱法已成为三大主要分析手段，且尤以高效液相色谱法占主导地位，它能进行大多数的防腐剂和甜味剂的分析，气相色谱法主要应用于酸型、酯型防腐剂等分析，离子色谱法主要应用于液体样品中酸型防腐剂、部分甜味剂的分析。近年来可用于实际样品检测的技术发展除在前处理技术方面有所改进外，仪器已从原来比较集中的气相色谱、液相色谱、离子色谱、

22、毛细管电泳和色谱-质谱联用技术方面发展，特别是色谱-质谱联用技术已显现出其突出的优势。1.4实验方法设计高效液相色谱在食品添加剂检测中应用比较广泛，由于安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、对羟基苯甲酸酯类的分子结构中都具对紫外光具有吸收的官能团，能够同时在紫外检测器上检测。近几年，国内外食品中多组分同时测定技术发展很快，目前文献报道测定防腐剂、甜味剂的方法主要有薄层色谱法、比色法、离子色谱法、气相色谱和液相色谱法，而同时测定食品中多种甜味剂和防腐剂的方法鲜有报道。研究建立同时测定食品中多种防腐剂和甜味剂的检测方法，重点针对目前食品中应用比较广泛且容易超标的防腐剂（山梨酸、苯甲酸、对羟基苯甲酸酯类）

23、和甜味剂（糖精钠和安赛蜜等）。在现有国标及已经报道的文献基础上，摸索出同时测定上述食品添加剂的方法，为产品质量检验机构及企业提供一种食品中多种添加剂的快速测定方法。在现有国标及已报道文献基础上开展下面几个方面的研究工作： 1.分析方法的研究（包括液相色谱柱的选择、多种流动相分离效果的比较、确定检测器检测波长，找到最佳的仪器参数条件）。2.方法准确性的验证（验证方法的重复性与准确性，各种组分的线性范围与最小检出限）。二、材料与方法（一）试剂甲醇：HPLC级0.02M乙酸铵：称取0.7708g乙酸铵于用水定溶500mL烧杯苯甲酸：吸取10mL1mg/mL苯甲酸储备液于100mL容量瓶中，并用水定溶

24、，此溶液中苯甲酸浓度为100ug/mL。山梨酸：吸取10mL1mg/mL山梨酸储备液于100mL容量瓶中，并用水定溶，此溶液中山梨酸浓度为100ug/mL。糖精钠：吸取10mL1mg/mL糖精钠储备液于100mL容量瓶中，并用水定溶，此溶液中糖精钠浓度为100ug/mL。安赛蜜：吸取10mL1mg/mL安赛蜜储备液于100mL容量瓶中，并用水定溶，此溶液中安赛蜜浓度为100ug/mL。对羟基苯甲酸甲酯：称取0.05g对羟基苯甲酸甲酯用10mL乙醇溶解,用水定溶于50mL容量瓶, 吸取上述溶液5mL于50mL容量瓶，并用水定溶，此溶液中对羟基苯甲酸甲酯浓度为100ug/mL。对羟基苯甲酸乙酯：称

25、取0.05g对羟基苯甲酸乙酯用10mL乙醇溶解,用水定溶于50mL容量瓶, 吸取上述溶液5mL于50mL容量瓶，并用水定溶， 此溶液中对羟基苯甲酸乙酯浓度为100ug/mL。对羟基苯甲酸丙酯：称取0.05g对羟基苯甲酸丙酯用10mL乙醇溶解,用水定溶于50mL容量瓶, 吸取上述溶液5mL于50mL容量瓶，并用水定溶，此溶液中对羟基苯甲酸丙酯浓度为100ug/mL。对羟基苯甲酸丁酯：称取0.05g对羟基苯甲酸丁酯用10mL乙醇溶解,用水定溶于50mL容量瓶, 吸取上述溶液5mL于50mL容量瓶，并用水定溶，此溶液中对羟基苯甲酸丁酯浓度为100ug/mL。（二）设备与仪器高效液相色谱：Agilen

26、t1100，美国安捷伦公司，配有四元梯度洗脱泵、在线真空脱气机、柱温箱及VWD检测器；超纯水仪：MILLIPORE-Q。（三）色谱条件的选择色谱柱：Zorbax SB-C18（4.6150mm i.d，5m）；流动相: 0.02M乙酸铵溶液（A）/甲醇（B）流速为：1.00mL/min；，进样量：10L首先试验了在乙酸铵与甲醇不同比例（体积比90：10，80：20，20：80）的流动相的安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯分离情况，图谱图一图三。图一 乙酸铵与甲醇的比例为90：10的图谱图二 乙酸铵与甲醇的比例为80：20的图谱

27、图三乙酸铵与甲醇的比例为20：80的图谱由此可见在波长230nm,0.02M乙酸铵与甲醇体积比为90：10时前四个组分分离效果比较好,后四组没分离出来。 在波长230nm,0.02M乙酸铵与甲醇体积比为80：20时只有三个组分被分离出来，其他都未被分离。其后改变波长使其为254nm，0.02M乙酸铵与甲醇体积比为20：80后四组分分离效果较好,借此可以看出要8种添加剂同时都被很好的分离出来需采用梯度，借此我们试验了不同比例梯度，如下所示：表4梯度洗脱程序条件时间（t/min）流速 （mL/min）流动相两组分的组成比例A/%B/%190%10%820%80%1417表5检测器波长切换程序时间（

28、t/min）波长 （nm）2309254图四 梯度洗脱后8种添加剂的分离图由图四可见8种添加剂在流动相乙酸铵与甲醇体积比在0min8min体积比90：10 在8min14min体积比20：80 在14min17min体积比90：10，0min9min波长为230nm，9min17min波长为254nm的条件下所呈现的谱图中各组分的分离效果较好。表6梯度洗脱程序条件730%70%11表7检测器波长切换程序图五 梯度洗脱后8种添加剂的分离图由图五可见8种添加剂在流动相乙酸铵与甲醇在0min7min体积比90：10 在7min11min体积比30：70 在11min17min体积比90：10，0min9min波长为230nm，9min17min波长为254nm的条件下所呈现的谱图中分离效果不好，有拖尾现象，各组分之间没能完全分开。表8梯度洗脱程序条件