体内研究IL2基因瘤苗抗肿瘤效应及安全性检测硕士论文Word格式文档下载.docx

1、 指导教师签名：日期： 年 月 日 日期：目录中文摘要 1英文摘要 3引言 61 试验材料 91.1 细胞株 91.2 细胞培养 91.3 杂交试验 91.4 动物模型 91.5 免疫组化 92 试验方法 102.1 细胞培养 102.2 大肠癌基因瘤苗生物活性的鉴定 102.3 瘤苗安全性的检测 102.4 体内实验检测基因瘤苗的抗肿瘤效应。 113 结果 133.1 ELISA检测IL-2蛋白水平得表达 133.2 瘤苗细胞的安全性检测结果 133.3 体内实验研究瘤苗的抗肿瘤效应 154 讨 论 205 结论 24参考文献 25综述 26致谢 32发表论文情况 33中文摘要及其安全性检测

2、摘 要目的:本课题研究转导白细胞介素-2（IL-2）基因的人大肠癌细胞瘤苗的抗肿瘤效应及其安全性检测。方法：结肠癌细胞株COLO205采用脂质体法稳定转染IL-2基因， 应用ELISA法检测瘤苗的IL-2的表达，筛选高表达IL-2基因的细胞克隆作为基因瘤苗。将已构造好的结肠癌裸鼠模型分为两组，采用瘤体内注射的方法，注射经60Gy60Co照射的瘤苗细胞（治疗组）和PBS缓冲液（对照组）,密切观察肿瘤生长状况，五周后处死所有裸鼠，取出肿瘤，观察并称重，免疫组化法检测IL-2 基因的表达。把已制备好的大肠癌基因瘤苗用60Co进行照射，将照射瘤苗细胞继续培养，用苔盼蓝染色法测定细胞的存活率，将照射的瘤

3、苗细胞和未照射组的瘤苗进行荷瘤试验。结果: 获得基因瘤苗最高表达为COLO205-H5量为139.13 ng/1107/24h。瘤体内注射瘤苗组的裸鼠肿瘤生长缓慢，较早达到平台期，而对照组的肿瘤生长迅速，差异有显著性。（ t=2.7,p0.05）治疗组肿块的重量也明显小于对照组（t=7.2，p0.01）。移植瘤治疗组IL-2免疫组化结果显示阳性，而对照组为阴性,说明了瘤苗在移植瘤体内存活并分泌IL-2。照射60Gy60Co瘤苗细胞培养在25天内全部死亡，荷瘤试验显示照射后的瘤苗未能成瘤，而未经照射组均已成瘤。结论:通过体内实验研究证实了IL-2基因转导结肠癌细胞制备的瘤苗具有一定的抗肿瘤效应，

4、经60Gy60Co照射后能消除其致瘤性，为肿瘤的治疗提供了一定的实验基础。关键词:大肠癌,白细胞介素-2,基因瘤苗，移植瘤英文摘要The study about ANTI-TUMOR EFFECT AND SAFETY OF IL-2 GENE VACCINE IN VIVOABSTRACTObjective: To investigate the anti-tumor effect of IL-2 gene vaccine and detect its safety. Methods: Eukaryotic expression vectors containing human IL-2 g

5、ene was stably transfected into colorectal cancer cell line colo205 by lipofectamine. The clones stably overexpression IL-2 gene were identified by ELISA detection, the clones of highly stably overexpressiong of IL-2 were obtained and used for subsequent test. The athymic nude mice carrying the huma

6、n colon cancer were subdivided into two groups: treatment groups and placebo groups. The cell clones containing IL-2 gene were irradiated by 60Co（60Gy） and used as treatment group, the phosphate-buffered saline （PBS） administration was used for the placebo group. After 5 weeks, killing all mice , un

7、loading the tumor lump and determining its weight, detecting IL-2 gene expression by using immunohistochemical staining. Proliferative viability of IL-2 gene vaccine irradiated by 60Co （60Gy） was tested by typan exclusion assay in vitro, tumorgenesis capacity of IL-2 gene vaccine irradiated by 60Co（

8、60Gy） was tested in xenograft tumor models in athymic nude mice in vivo. Result: We obtained clones of highly expressing IL-2 gene in colon cancer cell line colo205, and the secretion level of cell clones of highly expressing IL-2 gene was 139.13ng/1107/24h. The nude mice in treatment group show the

9、 slower tumor growth and smaller tumor weight compared with those in placebo group（t=2.7,p0.05；t=7.2，p0.01）. Immunohistochemical staining shows IL-2 gene overexpression in mice of treatment group while little expression of IL-2 gene in placebo group. The IL-2 gene cell vaccine irradiated by 60Co（60G

10、y） shows lower proliferative viability and detach the culture plate after 25 days by using typan exclusion method in vitro, the IL-2 gene cell vaccine irradiated by 60Co （60Gy） have little tumorgenesis capacity in nude mice in vivo. Conclusion: We studied anti-tumor effect of colon cancer cell line

11、colo205 transferred IL-2 gene in vivo and its safety detection, our results show the cell vaccine possess some anti-tumor effect and cancer cell vaccine irradiated by 60Co （60Gy） loss its tumorgenesis.KEY WORDS: colorectal cancer, interleukin-2, gene vaccine，xenograft tumor 引言大肠癌是一种常见的恶性肿瘤，近年来发病率呈现逐

12、年升高的趋势。目前，大肠癌的治疗方法主要是以手术为主、辅以局部或全身的放化疗，并有了很高的提高，但50%左右的病人仍然死于转移和复发1。近30年来，随着人类对大肠癌的发生、发展的分子机理不断深入的研究，人类对大肠癌在基因水平上已有深入的研究。大肠癌的发生、发展是一个多步骤，多阶段的复杂过程2，其主要是由癌基因的激活和抑癌基因的失活、DNA修饰功能缺失和机体免疫功能低下等引起的3。大肠癌的基因治疗已取得一定的临床实验疗效，并将被人们更加重视，将会为结直肠癌患临床治疗带来新的选择方法,尤其对出现转移的晚期的大肠癌患者带来福音。大肠癌的发生、发展经历了多基因、多步骤的过程，其中与环境、饮食、生活习惯

13、和遗传因素协同作用有重要的关系4 5。大肠癌在发生发展过程中经历一系列的基因突变和（或）缺失，造成其不仅在生物学特征方面不同于正常的细胞，而且在免疫学方面也发生显著变化6。如一些基因突变和异常表达，使肿瘤细胞表面出现新的抗原，一些基因缺失或表达下降，造成某些抗原丢失7，这些改变使得肿瘤与机体免疫系统之间曾出现错综复杂的关系：一方面肿瘤细胞表面存在特异性抗原，机体免疫系统能识别这些抗原并产生一系列免疫应答，最终排斥肿瘤8；另一方面，机体免疫系统受包括肿瘤本身在内的许多因素影响，发生免疫耐受，使肿瘤逃避宿主免疫攻击，得以生长并发生侵袭转移9。基因治疗诞生于上世纪80年代末及90年代初，作为一种新兴

14、的治疗手段已正式进入临床试验，恶性肿瘤是主要的候选疾病10。但肿瘤属复杂基因疾病，可能涉及多种基因的异常，发病过程是多阶段多步骤的，至今只有部分基因被鉴定，肿瘤发病的分子机制尚未完全清楚。目前主要存在的障碍有如何选择有效的靶基因、如何实现有效的基因转导11。 基因治疗是从基因水平调控细胞中缺陷基因的表达，修补有缺陷的基因，或以正常基因矫正、替代缺陷的基因，达到治疗缺陷所致的遗传病免疫缺陷；或因癌基因的激活和（或）抑癌基因失活所致的肿瘤等疾病治疗12。目前采用的主要策率有：突变基因的矫正、前提药物的激活、免疫应答的增强、溶瘤病毒等13。 目前针对大肠癌基因治疗主要有：自杀基因治疗、原癌基因和抑癌

15、基因有关的基因治疗、免疫基因治疗、联合基因治疗14 15，而免疫基因治疗是当前研究的一个热点。无论先天性的还是获得性的免疫反应都被认为机体抗肿瘤重要的机制16。大肠癌细胞具有抗原性，能诱导机体产生免疫应答，但绝大多数肿瘤仍能继续生长并发生转移，说明机体的免疫系统未能发挥抗肿瘤作用。免疫学研究发现，肿瘤抗原尤其是弱抗原在肿瘤长期的刺激下，可作用于不同分化的状态的抗原特异性淋巴细胞，使其处于特异的免疫无应答状态17。无论先天性的还是获得性的免疫反应都被认为机体抗肿瘤重要的机制18。肿瘤细胞还可以通过不表达抗原表位、抗原调变脱落或加工缺陷、缺乏MHC-I类分子或免疫共刺激分子等途径逃避机体免疫系统的

16、攻击。在癌症患者外周血中常出现T细胞亚群的紊乱，表现为CD4细胞（Th）减少，CD8细胞（TcTs）增加，CD4CD8细胞比值下降或倒置，同时NK、LAK细胞也存在不同的程度的活性下降。此外，血清细胞因子谱也常出现紊乱，表现为血清TGF-、IL-10、VEGF、和PEG等细胞因子浓度升高，而IL-2、INF-、GM-CSF和IL-12等浓度的下降19。人们设想通过免疫调节剂增强肿瘤免疫原性、解除机体免疫耐受，以调整免疫应答达到祛除肿瘤的目的20。肿瘤免疫治疗已有一个多世纪的历史。早期应用灭活的肿瘤细胞、细胞滤过或粗提取物进行主动免疫治疗，但效果不佳。其后应用经物理、化学或生物学方法，如加热、冷

17、冻、放射线治疗、加入神经氨酸酶或病毒等方法，处理肿瘤细胞制成肿瘤疫苗。或将作为佐剂的BCG或BCG-多糖类物质与肿瘤疫苗联合注射。以上方法应用于肾癌和黑色素瘤治疗取得了一定的疗效。此后人们探索将一些外源性基因导入肿瘤细胞，以增强其免疫原性，有利于被机体免疫系统识别，激发特异性细胞毒性反应21。据Wiley网站公布的基因治疗临床试验资料显示恶性肿瘤已成为其主要研究领域，占总方案数的66.2。当前大肠癌基因治疗主要涉及免疫基因治疗、纠正突变的P53基因、抑癌基因的激活和腺病毒介导癌细胞裂解等策略。其中免疫基因治疗约占三分之二，多数采用的策略是经逆转录病毒将细胞因子基因导入肿瘤细胞，制成“瘤苗”，注

18、入患者体内后通过局部分泌细胞因子改变肿瘤微环境，增强宿主的特异性抗肿瘤免疫反应22 23。白细胞介素2具有广泛的免疫调节作用，其在结直肠癌的生物治疗中的价值已得到肯定24。IL-2主要有活化的Th1或CD4+T细胞产生25，通过自分泌和旁分泌方式作用于靶细胞，有效地激发宿主特异性抗肿瘤免疫反应（CTL、CD4+和CD8+ ）和非特异免疫反应（NK、LAK、巨噬细胞等）26。临床应用IL-2单用或联合LAK、TIL治疗大肠癌取得了一定的疗效，但其疗效成剂量依赖性，而相应的毒副反应却限制了其大剂量应用27，因此难以充分发挥疗效。本研究采用逆转录病毒作为载体于体外将外源性的IL-2基因转到至同种异体

19、的人大肠癌细胞株，筛检扩增建立高表达的细胞克隆，建立肿瘤细胞疫苗。在体外检测外源性IL-2基因的整合和表达情况，并冻存于液氮中（本实验小组先前已完成）。复苏基因瘤苗，采用ELISA检测瘤苗的表达IL-2，选用高表达量的细胞瘤苗，作为后续实验使用。基因瘤苗安全性处理采用照射60Co的方法，剂量为60Gy。照射过60Co后基因瘤苗细胞无论在体内还是在体外均失去无限增殖的能力，通过60Co照射灭活了其致瘤性，具有安全性。建立大肠癌动物模型，给予瘤体内注射基因瘤苗细胞，而对照组给予PBS,两组结果对比，在体内进行检测证明转导IL-2基因人大肠癌基因瘤苗的有效性。为IL-2基因瘤苗治疗大肠癌的有效性、安

20、全性提供了重要的试验依据，丰富了大肠癌的基因治疗。1 试验材料1.1 细胞株人大肠癌细胞株SW1116、COLO205和HT-29由本实验组冻存于上海交通大学医学院生化实验室，IL-2基因转导人大肠癌细胞瘤苗SW1116、COLO205、HT-29，由本实验组先前完成并冻存于上海交通大学医学院生化实验室。1.2 细胞培养RPMI1640培养液、0.25胰酶、胎牛血清购于GBCO1.3 杂交试验ELISA试剂盒购于Diaclone公司。1.4 动物模型Balb/c裸小鼠24只购于并饲养于中国科学院上海试验动物中心。1.5 免疫组化兔抗人IL-2基因的多克隆抗体 和HRP标记的羊抗兔抗体购于Sig

21、ma公司。2 试验方法2.1 细胞培养大肠癌细胞系及肿瘤疫苗细胞培养于1640基础培养液中，含10%的胎牛血清的，于37，5%CO2，相对湿度为90%的培养箱中培养。定期换液和细胞计数。2.2 大肠癌基因瘤苗生物活性的鉴定抗体夹心ELISA法检测IL-2表达（蛋白质水平检测）各细胞克隆培养上清样品在室温下解冻，适当稀释，按说明书配置各试剂，取待测样品、标准液及对照液各100l分别加入96孔反应板微孔内，于各孔内加入50l生物素标记的抗IL-2检测抗体，室温下孵育1小时，漂洗3次。加入100l链球菌素亲和素辣根过氧化物酶溶液，室温下孵育30分钟，漂洗3次。加入100l显色剂TMD,避光孵育15分

22、钟后加入100lH2SO4溶液终止反应，立刻上酶标仪检测。根据标准样品的不同稀释的浓度及相应的OD值作标准曲线，查看所侧细胞上清样品的IL-2分泌量，用Excel完成。挑选稳定高表达的细胞克隆作为后继的动物试验所用的瘤苗。2.3 瘤苗安全性的检测2.3.1 照射60Co对基因瘤苗细胞生长的影响胎盘蓝排斥试验测定细胞的存活率将照射后的瘤苗细胞用1 x PBS洗2次，025胰酶消化，然后用1ml完全新鲜培养液悬浮，取4滴于载玻片上，用苔盼蓝染色染色23分钟，细胞中深蓝色颗粒浸润即为死亡细胞，透亮的则为活细胞。4滴样品各随机取视野计算100个细胞，细胞存活率=活细胞数100。把4个数值平均，即为某一

23、天细胞的存活率，总细胞数x存活率即得某天的活细胞数。2.3.2 基因瘤苗荷瘤试验把基因瘤苗按是否照射60Co，分为两组：照射组和未照射组，注射瘤苗细胞悬液于裸鼠侧背部皮下，进行荷瘤试验，每组六只裸鼠，密切观察两组裸鼠生长状况，看是否长出移植瘤（具体的步骤见下面“裸鼠移植瘤模型的建立”）。实验分两组：照射60Co转染IL-2的COLO205瘤苗细胞组和照射60Co转染IL-2的COLO205细胞组,每组6只裸鼠，共12只。2.4.1 结肠癌细胞系COLO205裸鼠移植瘤模型的建立1） Balb/c裸小鼠12只，鼠龄45周，体重1525g，购于中国科学院上海实验动物中心。裸鼠饲养于无菌室层流架无特

24、定病原体（SPF）环境中，给予高压灭菌的水和饲料自由食用。2） COLO205大肠癌细胞生长至亚融合状态时，弃完全培养液，PBS洗涤3， 0.05%typsin/0.02% EDTA消化成单细胞悬液，800 rpm5 min，4离心；用PBS重悬细胞，细胞数调整至1108/ml。3） 在每只裸小鼠侧背部皮下注射肿瘤细胞悬液50l（5106细胞）。4） 待移植瘤直径达到0.5cm左右时，实验分为两组：治疗组和对照组。应用我们制备的转导了IL-2基因的COLO205瘤苗对肿瘤组织行瘤内注射，对照组注射PBS。2.4.2 基因瘤苗治疗移植瘤把制备好经检测高表达的转染IL-2人大肠癌COLO205细胞

25、基因瘤苗进行复苏，复苏后基因瘤苗细胞存活率达到80%以上，待细胞生长至亚融合状态，进行安全型处理后（用60Gy60Co照射）为治疗组，对照组为PBS。当荷瘤裸鼠移植瘤直径达0.5cm左右时,进行治疗试验。治疗组向移植瘤内注射基因瘤苗（细胞量大约为1107个/每只裸鼠，制成细胞悬液），对照组为PBS,两组液体体积相等，每隔1周注射一次。从首次注射之日起密切观察两组裸鼠生长状况，每隔3天用游标卡尺检测肿瘤长径和短径，计算并比较肿瘤的体积。计算公式为肿瘤体积：V=（长径短径）/23/6。两组间体积比较采用t检验，EXCEL 、SPSS11.5完成。2.4.3 移植瘤的处理观察5周后处死小鼠，解剖裸鼠

26、，取出肿瘤称重，OCT包埋，冰冻切片机切片，免疫组化检测IL-2的表达。两组间重量比较采用t检验，SPSS11.5完成。免疫组织化学检测：1） 冰冻切片经冷丙酮室温固定30分钟后，TBS洗5分钟。2） 0.6的H2O237孵育20分钟，以去除内源性的过氧化物酶活性。3） TBS洗5分钟，1:20正常羊血清37封闭30 min。4） 加入一抗37孵育2h。5） TBS洗3遍后加入HRP标记的二抗37孵育1h，6） TBS洗3遍，DAB显色，显微镜下控制显色时间，约5-10分钟，苏木素衬染细胞核后封片观察。3 结果3.1 ELISA检测IL-2蛋白水平得表达 ELISA检测IL-2蛋白水平得表达结

27、果如表1表示。其中IL-2表达最高的克隆是编号为COLO205-H5混合克隆，表达量为139.13 ng/1107/24h，表达最高的单克隆编号为COLO205-11，表达量为129.23 ng/1107/24h，平均表达量为61.51 ng/1未转染IL-2的三个结肠癌细胞株培养液上清中均未检测到IL-2的表达。细胞株总体IL-2表达克隆数 范围 平均值单克隆IL-2表达混合克隆IL-2表达SW11621 028.31 8.3 / / /HT-2924 1.8938.27 15.1922 1.89 38.27 15.792 9.3210.63 10.23COLO20516 0139.13 6

28、1.5111 0129.23 59.435 24.12139.13 64.25表1 基因转导大肠癌细胞株IL-2的表达情况（单位：ng/1107/24hr）（schedule 1 state of gene transducted colorectal cancer cell strain express IL-2 unity：107/24h）3.2 瘤苗细胞的安全性检测结果3.2.1 照射60Co对瘤苗细胞活力的影响经60Co照射后基因瘤苗细胞体外培养，发现随天数的增加，细胞存活率下降，活细胞数减少，照射后一周内细胞的存活率约为50，25天内基因细胞瘤苗全部死亡，结果见表2（同种细胞两株细胞

29、的活力检测的结果）。上述结果表明照射后的细胞活力明显下降，在第15天时候细胞几乎全部死亡，因此，经60Co照射后瘤苗细胞已经失去了肿瘤性的无限增殖能力，失去了致瘤性。剂量 天数60Gy1 3 6 8 10 13 15 20 25 存活率（） 100 97 53 28 8 2 0.3 0.06 0 100 95 52 25 5 1 0.2 0表2 照射60Co对瘤苗细胞活力的影响（schedule 2 influence of radiation tumor vaccine with 60Co）3.2.2 体内实验检测瘤苗的安全性未照射60Co基因瘤苗组在第16天出现了肿瘤，而照射组未能成瘤,见图1。体内和体外实验均说明了我们应用60Co处理过瘤苗细胞已失去肿瘤细胞的无限增殖的能了，失去了致瘤性，用来治疗肿瘤是安全可行的。 A 未照射60Co B 照射60Co图1 两组瘤苗细胞的荷瘤实验结果（graph 1 result of two group tumor vaccine cell bearing tumor ）3.3 体内实验研究瘤苗的抗肿瘤效应3