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1、50年代末又出现淀粉凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。目前，电泳技术已广泛应用于分析化学、生物化学、临床化学、药理学、免疫学、微生物学、遗传学等科学中。 电泳种类按分离原理的不同，电泳分为 4类：移动界面电泳、区带电泳、等电聚焦电泳和等速电泳（见图）。移动界面电泳是将被分离的离子（如阴离子）混合物置于电泳槽的一端（如负极），在电泳开始前，样品与载体电解质有清晰的界面。电泳开始后，带电粒子向另一极（正极）移动，泳动速度最快的离子走在最前面，其他离子依电极速度快慢顺序排列，形成不同的区带。只有第一个区带的界面是清晰的，达到完全分离，其中含有电泳速度最快的离子，其他大部分区带重叠。区带电泳是在一定的支

2、持物上，于均一的载体电解质中，将样品加在中部位置，在电场作用下，样品中带正或负电荷的离子分别向负或正极以不同速度移动，分离成一个个彼此隔开的区带。区带电泳按支持物的物理性状不同，又可分为纸和其他纤维膜电泳、粉末电泳、凝胶电泳与丝线电泳。等电聚焦电泳是将两性电解质加入盛有pH梯度缓冲液的电泳槽中，当其处在低于其本身等电点的环境中则带正电荷，向负极移动；若其处在高于其本身等电点的环境中，则带负电向正极移动。当泳动到其自身特有的等电点时，其净电荷为零，泳动速度下降到零，具有不同等电点的物质最后聚焦在各自等电点位置 ，形成一个个清晰的区带，分辨率极高。等速电泳是在样品中加有领先离子（其迁移率比所有被分

3、离离子的大）和终末离子（其迁移率比所有被分离离子的小），样品加在领先离子和终末离子之间，在外电场作用下，各离子进行移动，经过一段时间电泳后，达到完全分离。被分离的各离子的区带按迁移率大小依序排列在领先离子与终末离子的区带之间。由于没有加入适当的支持电解质来载带电流 ，所得到的区带是相互连接的（图d），且因“ 自身校正”效应，界面是清晰的，这是与区带电泳不同之处。电泳分离原理示意图 a 移动界面电泳 b 区带电泳 c 等电聚焦电泳 d 等速电泳 L 领先离子 T 终末离子 应用电泳已日益广泛地应用于分析化学、生物化学、临床化学、毒剂学、药理学、免疫学、微生物学、食品化学等各个领域。在直流电场中，

4、带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳（electropho-resis）。1809年俄国物理学家Pece首先发现了电泳现象，但直到1937年瑞典的Tiselius建立了分离蛋白质的界面电泳（boundary electrophoresis）之后，电泳技术才开始应用。本世纪60-70年代，当滤纸、聚丙烯酰胺凝胶等介质相继引入电泳以来，电泳技术得以迅速发展。丰富多彩的电泳形式使其应用十分广泛。电泳技术除了用于小分子物质的分离分析外，最主要用于蛋白质、核酸、酶，甚至病毒与细胞的研究。由于某些电泳法设备简单，操作方便，具有高分辨率及选择性特点，已成为医学检验中常用的技术。电泳又名 电着 （ 著

5、 ） ，泳漆，电沉积。创始于二十世纪六十年代，由福特汽车公司最先应用于汽车底漆。由于其出色的防腐、防锈功能，很快在军工行业得到广泛应用。近几年才应用到日用五金的表面处理。由于其优良的素质和高度环保，正在逐步替代传统油漆喷涂。电泳原理：电泳是电泳涂料在阴阳两极，施加于电压作用下，带电荷之涂料离子移动到阴极， 并与阴极表面所产生之碱性作用形成不溶解物，沉积于工件表面。它包括四个过程：1 ）电解（分解） 在阴极反应最初为电解反应，生成氢气及氢氧根离子 OH ，此反应造成阴极面形成 一高碱性边界层，当阳离子与氢氧根作用成为不溶于水的物质，涂膜沉积，方程式 为： H2OOH+H 2 ）电泳动（泳动、迁移

6、） 阳离子树脂及 H+ 在电场作用下，向阴极移动，而阴离子向阳极移动过程。3 ）电沉积（析出） 在被涂工件表面，阳离子树脂与阴极表面碱性作用，中和而析出不沉积物，沉 积于被涂工件上。4 ）电渗（脱水） 涂料固体与工件表面上的涂膜为半透明性的，具有多数毛细孔，水被从阴极涂 膜中排渗出来，在电场作用下，引起涂膜脱水，而涂膜则吸附于工件表面，而 完成整个电泳过程。 电泳表面处理工艺的特点：电泳漆膜具有涂层丰满、均匀、平整、光滑的优点，电泳漆膜的硬度、附着力、 耐腐、冲击性能、渗透性能明显优于其它涂装工艺。电泳电泳（Electrophoresis）是指带电荷的粒子或分子在电场中移动的现象称为电泳.大分

7、子的蛋白质,多肽,病毒粒子,甚至细胞或小分子的氨基酸,核苷等在电场中都可作定向泳动.1937年Tiselius成功地研制了界面电泳仪进行血清蛋白电泳,它是在一U型管的自由溶液中进行的,电泳后用光学系统使各种蛋白所形成折光率差别成为曲线图象,将血清蛋白分为白蛋白,1-球蛋白,2-球蛋白,-球蛋白和-球蛋白五种,随后,Wielamd 和Kanig 等于1948年采用滤纸条做载体,成功地进行了纸上电泳.从那时起,电泳技术逐渐被人们所接受并予以重视,继而发展以滤纸,各种纤维素粉,淀粉凝胶,琼脂和琼脂糖凝胶,醋酸纤维素薄膜,聚丙烯酰胺凝胶等为载体,结合增染试剂如银氨染色,考马斯亮蓝等大大提高和促进生物样

8、品着色与分辨能力,此外电泳分离和免疫反应相结合,使分辨率不断朝着微量和超微量（1ng0.001ng）水平发展,从而使电泳技术获得迅速推广和应用.在此主要介绍常用电泳的一般原理及其应用.（一）电泳的基本原理 生物大分子如蛋白质,核酸,多糖等大多都有阳离子和阴离子基团,称为两性离子.常以颗粒分散在溶液中,它们的静电荷取决于介质的H+浓度或与其他大分子的相互作用.在电场中,带电颗粒向阴极或阳极迁移,迁移的方向取决于它们带电的符号,这种迁移现象即所谓电泳.如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中,使颗粒具有恒定迁移速率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷Q和电位梯度E.它们与介质的摩擦阻力f抗衡.

9、在自由溶液中这种抗衡服从Stokes定律.F=6rv这里v是在介质粘度为中半径为r的颗粒的移动速度.但在凝胶中,这种抗衡并不完全符合Stokes定律.F取决于介质中的其他因子,如凝胶厚度,颗粒大小,甚至介质的内渗等.电泳迁移率（mbility）m规定为在电位梯度E的影响下,颗粒在时间t中的迁移距离d.dm= - 或 m=V / EtE迁移率的不同提供了从混合物中分离物质的基础,迁移距离正比于迁移率. （二）影响电泳的因素1. 电泳介质的pH值溶液的pH值决定带电物质的解离程度,也决定物质所带净电荷的多少.对蛋白质,氨基酸等类似两性电解质,pH值离等电点越远,粒子所带电荷越多,泳动速度越快,反之

10、越慢.因此,当分离某一种混合物时,应选择一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差别的pH值,以利于各种蛋白质的有效分离.为了保证电泳过程中溶液的pH值恒定,必须采用缓冲溶液.缓冲液的离子强度溶液的离子强度（Ion intensity）是指溶液中各离子的摩尔浓度与离子价数平方的积的总和的1/2.带电颗粒的迁移率与离子强度的平方根成反比.低离子强度时,迁移率快,但离子强度过低,缓冲液的缓冲容量小,不易维持pH恒定.高离子强度时,迁移率慢,但电泳谱带要比低离子强度时细窄.通常溶液的离子强度在0.020.2之间.I=1/2CiZi2 （I:离子强度;Ci:离子的摩尔浓度;Zi:离子价数. ）0.154M Na

11、Cl溶液的离子强度为:I= 1/2（0.15412+0.15412）=0.1540.015M Na2SO4溶液的离子强度为:I= 1/2（0.015212+0.01522）=0.0453. 电场强度电场强度（电势梯度Electric field intensity）是指每厘米的电位降（电位差或电位梯度）.电场强度对电泳速度起着正比作用,电场强度越高,带电颗粒移动速度越快.根据实验的需要,电泳可分为两种:一种是高压电泳,所用电压在5001000V或更高.由于电压高,电泳时间短（有的样品需数分钟）,适用于低分子化合物的分离,如氨基酸,无机离子,包括部分聚焦电泳分离及序列电泳的分离等.因电压高,产热

12、量大,必须装有冷却装置,否则热量可引起蛋白质等物质的变性而不能分离,还因发热引起缓冲液中水分蒸发过多,使支持物（滤纸,薄膜或凝胶等）上离子强度增加,以及引起虹吸现象（电泳槽内液被吸到支持物上）等,都会影响物质的分离.另一种为常压电泳,产热量小,室温在1025分离蛋白质标本是不被破坏的,无需冷却装置,一般分离时间长.4. 电渗现象在电场中液体对于一个固体的固定相相对移动称为电渗.在有载体的电泳中,影响电泳移动的一个重要因素是电渗.最常遇到的情况是-球蛋白,由原点向负极移动,这就是电渗作用所引起的倒移现象.产生电渗现象的原因是载体中常含有可电离的基团,如滤纸中含有羟基而带负电荷,与滤纸相接触的水溶

13、液带正电荷,液体便向负极移动.由于电渗现象往往与电泳同时存在,所以带电粒子的移动距离也受电渗影响;如电泳方向与电渗相反,则实际电泳的距离等于电泳距离加上电渗的距离.琼脂中含有琼脂果胶,其中含有较多的硫酸根,所以在琼脂电泳时电渗现象很明显,许多球蛋白均向负极移动.除去了琼脂果胶后的琼脂糖用作凝胶电泳时,电渗大为减弱.电渗所造成的移动距离可用不带电的有色染料或有色葡聚糖点在支持物的中心,以观察电渗的方向和距离.（三）电泳的分类目前所采用的电泳方法,大致可分为3类:显微电泳,自由界面电泳和区带电泳.区带电泳应用广泛,区带电泳可分为以下几种类型:按支持物的物理性状不同,区带电泳可分为:（1）滤纸为支持

14、物的纸电泳;（2）粉末电泳: 如纤维素粉,淀粉,玻璃粉电泳;（3）凝胶电泳:如琼脂,琼脂糖,硅胶,淀粉胶,聚丙烯酰胺凝胶电泳;（4）缘线电泳:如尼龙丝,人造丝电泳2. 按支持物的装置形式不同,区带电泳可分为:（1）平板式电泳:支持物水平放置,是最常用的电泳方式;（2）垂直板电泳:聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳.（3）柱状（管状）电泳:聚丙烯酰胺凝胶可灌入适当的电泳管中做成管状电泳.3.按pH的连续性不同,区带电泳可分为:（1）连续pH电泳:如纸电泳,醋酸纤维素薄膜电泳;（2）非连续pH电泳:如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳;（四）电泳所需的仪器电泳所需的仪器有:电泳槽和电源.1. 电泳槽电泳槽是电泳

15、系统的核心部分,根据电泳的原理,电泳支持物都是放在两个缓冲液之间,电场通过电泳支持物连接两个缓冲液,不同电泳采用不同的电泳槽.常用的电泳槽有:（1）圆盘电泳槽:有上,下两个电泳槽和带有铂金电极的盖.上槽中具有若干孔,孔不用时,用硅橡皮塞塞住.要用的孔配以可插电泳管（玻璃管）的硅橡皮塞.电泳管的内径早期为57mm,为保证冷却和微量化,现在则越来越细.（2）垂直板电泳槽:垂直板电泳槽的基本原理和结构与圆盘电泳槽基本相同.差别只在于制胶和电泳不在电泳管中,而是在块垂直放置的平行玻璃板中间.（3）水平电泳槽:水平电泳槽的形状各异,但结构大致相同.一般包括电泳槽基座,冷却板和电极.电源要使荷电的生物大分

16、子在电场中泳动,必须加电场,且电泳的分辨率和电泳速度与电泳时的电参数密切相关.不同的电泳技术需要不同的电压,电流和功率范围,所以选择电源主要根据电泳技术的需要.如聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS电泳需要200600V电压.（五）电泳技术的应用1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳可用做蛋白质纯度的鉴定.聚丙烯酰胺凝胶电泳同时具有电荷效应和分子筛效应,可以将分子大小相同而带不同数量电荷的物质分离开,并且还可以将带相同数量电荷而分子大小不同的物质分离开.其分辨率远远高于一般层析方法和电泳方法,可以检出10-910-12g的样品,且重复性好,没有电渗作用.2. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可测定蛋白质分子量.其原理是带大量

17、电荷的SDS结合到蛋白质分子上克服了蛋白质分子原有电荷的影响而得到恒定的荷/质比.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量已经比较成功,此法测定时间短,分辨率高,所需样品量极少（1100g）,但只适用于球形或基本上呈球形的蛋白质,某些蛋白质不易与SDS结合如木瓜蛋白酶,核糖核酸酶等,此时测定结果就不准确.3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于蛋白质定量.电泳后的凝胶经凝胶扫描仪扫描,从而给出定量的结果.凝胶扫描仪主要用于对样品单向电泳后的区带和双向电泳后的斑点进行扫描.4.琼脂或琼脂糖凝胶免疫电泳可用于检查蛋白质制剂的纯度;分析蛋白质混合物的组分;研究抗血清制剂中是否具有抗某种已知抗原的抗体;检验两种抗

18、原是否相同.（六）电泳后结果检测对于不同的目的,应采用不同的检测方法.用染料和生物大分子结合形成有色的复合物是电泳后检测最常用的方法.（七）聚丙烯酰胺凝胶电泳结果不正常现象和对策1. 指示剂前沿呈现两边向上或向下的现象.向上的微笑现象说明凝胶的不均匀冷却,中间部分冷却不好,所以导致凝胶中分子有不同的迁移率所致.这种情况在用较厚的凝胶以及垂直电泳中时常发生.向下的皱眉现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的,特别是当凝胶和玻璃板组成的三明治底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象.2.拖尾现象是电泳中最常见的现象.这常常是由于样品溶解不佳引起的,克服的办法是在加样前离心,选用

19、合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液,加增溶辅助试剂.另一方法是降低凝胶浓度.3.纹理现象常常是由于样品中不溶颗粒引起的,克服办法是增加溶解度和离心除去不溶性颗粒.4. 蛋白带偏斜常常是由于滤纸条或电极放置不平行所引起的,或由于加样位置偏斜而引起.5. 蛋白带过宽,与邻近蛋白泳道的蛋白带相连,这是由于加样量太多或加样孔泄漏引起的.6. 蛋白带模糊不清和分辨不佳是由于多种原因引起的.虽然梯度凝胶可以提高分辨率,但与其他方法相比,常规聚丙烯酰胺凝胶电泳是分辨率较低的方法.为了提高分辨率,不要加过多的样品,小体积样品可给出窄带.加样后应立即电泳,以防止扩散.选择合适的凝胶浓度,使组分得以充分的分离.通常靠近

20、前沿的蛋白带分辨率不佳,所以应根据分子量与凝胶孔径的关系,灌制足够长度的凝胶,以使样品不会走出前沿.样品的蛋白水解作用也引起扩散而使分辨率降低.水解作用通常发生在样品准备的时候,系统中的内源性蛋白酶会水解样品蛋白,如果在缓冲液中加蛋白酶抑制剂可以减少这种情况的发生.常用于生物化学技术。蛋白 常规电泳操作方法一、纸电泳法 1.仪器装置 包括电泳室及直流电源两部分常用的水平式电泳室装置如图，包括两个电泳槽A和一个可以密封的玻璃（或相应材料）盖B；两侧的电泳槽均用有机玻璃（或相应材料）板C分成两部分；外格装有铂电极（直径0.50.8cm）D；里格为可放滤纸E的有机玻璃电泳槽架F，此架可从槽中取出；两

21、侧电泳槽A内的铂电极D经隔离导线穿过槽壁与外接电泳仪电源相连。 电源为具有稳压器的直流电源，常压电泳一般在100500V，高压电泳一般在50010 000V。2. 操作法 （1） 电泳缓冲液 枸橼酸盐缓冲液（pH3.0） 取枸橼酸 （C6H8O7H2O）39.04g与枸橼酸钠（C6H5Na3O72H2O）4.12g，加水4000ml，使溶解。 （2） 滤纸 取色谱滤纸置1mol/L甲酸溶液中浸泡过夜，次日取出，用水漂洗至洗液的pH值不低于4,置60烘箱烘干，备用。可按需要裁成长27cm、宽18cm的滤纸，或根据电泳室的大小裁剪，并在距长度方向一端58cm处划一起始线，每隔2.53cm处做一记号

22、备点样用。 （3） 点样 有湿点法和干点法。湿点法是将裁好的滤纸全部浸入枸橼酸盐缓冲液（pH3.0）中，湿润后，取出，用滤纸吸干多余的缓冲液，置电泳槽架上，使起始线靠近阴极端，将滤纸两端浸入缓冲液中，然后用微量注射器精密点加供试品溶液，每点10l,共3点，并留2个空白位置。 干点法是将供试品溶液点于滤纸上，吹干、再点，反复数次，直至点完规定量的供试品溶液，然后用喷雾器将滤纸喷湿，点样处最后喷湿，本法适用于稀的供试品溶液。（4） 电泳 于电泳槽中加入适量电泳缓冲液,浸没铂电极，接通电泳仪稳压电源挡,调整电压梯度为1820V/cm，电泳约1小时45分钟，取出,立即吹干,置紫外光灯（254nm）下检

23、视，用铅笔划出紫色斑点的位置。（5） 含量测定 剪下供试品斑点和与斑点位置面积相近的空白滤纸，剪成细条，分别置试管中，各精密加入0.01mol/L盐酸溶液5ml，摇匀，放置1小时，用3号垂熔玻璃漏斗滤过，也可用自然沉降或离心法倾取上清液，按各药品项下的规定测定吸收度，并按吸收系数计算含量。二、醋酸纤维素薄膜电泳法1.仪器装置 电泳室及直流电源同纸电泳。2.试剂 （1） 巴比妥缓冲液（pH8.6）取巴比妥2.76g，巴比妥钠15.45g，加水溶解使成1000ml。（2） 氨基黑染色液 取0.5g的氨基黑10B,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。（3） 漂洗液 取乙醇45ml

24、、冰醋酸5ml及水50ml，混匀。（4） 透明液 取冰醋酸25ml，加无水乙醇75ml，混匀。3.操作法 （1） 醋酸纤维素薄膜 取醋酸纤维素薄膜，裁成2cm8cm的膜条，将无光泽面向下，浸入巴比妥缓冲液（pH8.6）中,待完全浸透，取出夹于滤纸中，轻轻吸去多余的缓冲液后,将膜条无光泽面向上,置电泳槽架上,经滤纸桥浸入巴比妥缓冲液（pH8.6）中。（2） 点样与电泳 于膜条上距负极端2cm处，条状滴加蛋白含量约5的供试品溶液23l,在1012V/cm电位梯度下电泳。电泳区带距离以45cm为宜。（3） 染色 电泳完毕，将膜条取下浸于氨基黑染色液中，23分钟后，用漂洗液浸洗数次，直至脱去底色为止。

25、（4） 透明 将洗净并完全干后的膜条浸于透明液中1015分钟，取出平铺于洁净的玻板上，干后即成透明薄膜，可于分光光度计上测定和作标本长期保存。（5） 含量测定 未经透明处理的醋酸纤维素薄膜电泳图可按各药品项下规定的方法测定，一般采用洗脱法或扫描法，测定各蛋白质组分的相对百分含量。洗脱法将洗净的膜条用滤纸吸干，剪下供试品溶液各电泳图谱的电泳区带，分别浸于1.6的氢氧化钠溶液中，振摇数次，至洗脱完全， 于一定波长下测定吸收度。同时剪取与供试品膜条相应的无蛋白部位，同法操作作对照。先计算吸收值总和，再计算各蛋白组分所占百分率。扫描法 将干燥的醋酸纤维素薄膜用色谱扫描仪通过反射 （未透明薄膜） 或透射

26、（已透明薄膜）方式在记录器上自动绘出各蛋白组分曲线图，横坐标为膜条的长度，纵坐标为吸收度，计算各蛋白组分的百分含量。亦可用微机处理积分计算。三、琼脂糖凝胶电泳法1.仪器装置 电泳室及直流电源同纸电泳。（1） 醋酸锂盐缓冲液（pH3.0） 取冰醋酸50ml，加水800ml混合后，用氢氧化锂调节pH至3.0，再加水至1000ml。（2） 甲苯胺蓝溶液 取甲苯胺蓝0.1g，加水100ml使溶解。（1）制胶 取琼脂糖约0.2g，加水10ml，置水浴中加热使溶胀完全,加温热的醋酸锂盐缓冲液（pH3.0）10ml，混匀，趁热将胶液涂布于大小适宜（2.5cm7.5cm或4cm9cm）的玻璃板上，厚度约3mm

27、，静置，待凝胶结成无气泡的均匀薄层，即得。（2） 标准品溶液及供试品溶液的制备 照各药品项下规定配制。（3） 点样与电泳 在电泳槽内加入醋酸锂盐缓冲液（pH3.0）,将凝胶板置于电泳槽架上，经滤纸桥浸入缓冲液。于凝胶板负极端分别点样1l，立即接通电源，在电压梯度约30V/cm，电流强度12mA/cm的条件下，电泳约20分钟，关闭电源。（4） 染色与脱色 取下凝胶板，用甲苯胺蓝溶液染色，用水洗去多余的染色液至背景无色为止。四、聚丙烯酰胺凝胶电泳法通常由稳流电泳仪和圆盘或平板电泳槽组成。其电泳室有上、下两槽,每个槽中都有固定的铂电极，铂电极经隔离电线接于电泳仪稳流挡上。（1）溶液A取三羟甲基氨基甲

28、烷36.6g，四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L盐酸溶液48ml，再加水溶解并稀释至100ml,置棕色瓶内，在冰箱中保存。（2）溶液B取丙烯酰胺30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g，加水溶解并稀释至100ml,滤过，置棕色瓶内，在冰箱中保存。（3）电极缓冲液（pH8.3）取三羟甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀释至1000ml，置冰箱中保存，用前稀释10倍。（4）溴酚蓝指示液取溴酚蓝0.1g,加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml与90乙醇5ml,微热使溶解，加20乙醇制成250ml。（5）染色液取0.25（W/V）考马斯亮蓝G溶液2.5ml，加12.5（W/V）三氯醋酸溶液至10ml。（6）稀染色液取上述染色液2ml，加12.5（W/V）三氯醋酸溶液至10ml。（7）脱色液 7醋酸溶液。（1）制胶 取溶液A2ml，溶液B5.4ml，加尿素2.9g使溶解，再加水4ml，混匀，抽气赶去溶液