重组腺病毒AdGFPC197 的构建及其抗肿瘤活性研究7解析Word文档格式.docx

1、 Hela 细胞 ; 人 端粒 酶 逆 转录 酶 ; C 197; 细胞 凋 亡 ; 端粒 酶活性中图分类号 : R966文献标识码 : A 文章编号 : 1007-7847（201503-0237-05 Construction of Recombinant Adenovirus Ad-GFP-C197 and its Antitumor ActivityWU Xian, CHEN Jia-sheng, CAO Ying,QIU Yu-chang,PANG Jian-xin * （Center of Drug Evaluation and Research, School of Pharma

2、ceutical Sciences,Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong, China Abstract:Telomerase plays a critical role in maintaining telomere length, and it is one of the markers of the tumors. A recombinant adenovirus vector , Ad-GFP-C197, was constructed to express intact C-terminus of human

3、 telomerase reverse transcriptase （aminoacid 936-1132,C197, and its effect on the growth of Hela cells was evaluated. Western blot assay showed C 197were expressed in Hela cells after infection with Ad-GFP-C197. Furthermore, Ad-GFP-C197significantly inhibited the proliferation and promoted apoptosis

4、 of Hela cells, as well as suppressed telomerase activity in Hela cells. The results highlight the potential of C-197in tumor therapy.Key words:adenovirus; Hela cell; human telomerase reverse transcriptase; apoptosis; telomerase ac - tivity（Life Science Research , 2015, 19（3 :237 241收稿日期 :2014-12-16

5、; 修回日期 : 2015-02-09基金项目 : 广 州 市 科学研究 专 项 基 金项目 （2014J100195作者简介 : 邬 贤 （1991- , 女 , 广 东 广 州 人, 硕士研究生 , 主要从事 抗 肿瘤药 理 及新 药 评价 研究; *通 讯作者:庞 建 新 （1965- , 男 , 广 东 广 州 人, 南 方 医科 大 学 药 学院教授 , 博 士 , 主要从事 抗 肿瘤免 疫 及新 药 评价 研究 , Tel:020-61648673, E-mail :pjx。板 ,在 hTERT 的 作 用 下使 端粒 末 端 得 以 延 长 。 hTERT 有 3个 结 构 域

6、, 分别是 N 末 端 部 分, 具 有 逆 转录活 性的中 间 部 分 （逆 转录 区 , 以及一 小 段 C 末 端 序 列 4。 N 末 端 主要 是 与 hTR 结 合 部 位, C 末 端 主 要 是 与 DNA 结 合 部 位 , 这 两 部 分 是 hTERT 与 其 他 逆 转录酶 的 主要区 别。 逆 转录 区 是 催 化 活 性 部 位, 几 乎 所 有的 逆 转录酶 在 该 区 的 活 性基 团 都高度 保 守 。 目 前 对 hTERT 不同 片 段的 研 究 较 多的是 将 hTERT 的 N 末 端 和 逆 转录 区 的 保 守 基因 进 行 缺失突 变或识别 hT

7、ERT 自然 存 在的 不同 mRNA 剪 切 体, 观 察 这 些 突 变体或 剪 切 体 对 肿瘤 细胞增殖 的 影响 和 端粒 酶活 性 5 7。 另 外 , 一 些 剪 切 体可以 翻译 成 蛋白 质 , 表 现 出 不同 的 生 理 和病 理 功 能, 如 抑 制 细胞增殖 、 抑 制 Wnt 信 号途 径 等 端粒 外 功 能 8,9。目 前 对 hTERT C 末 端 的 研究 较 少, 有 研究 表 明 , hTERT 的 C 末 端 可 调节 hTERT 在 细胞 内 定 位 10, 对 端粒 酶 的 功 能 不 可或 缺 11。在 前 期 的 研究 中, 我 们 曾 经 构

8、 建 了表达 hTERT C 末 端 197个 氨 基酸 （hTERT 936-1132, C 197 的 真 核 表达 质 粒 12, 但表达 量 不 高。 在 此 基础 上 , 本 研究 构 建 了 能大量 表达 C 197片 段的 重 组 腺 病 毒 Ad-GFP-C197, 为 进 一 步 研究 hTERT 的 C 末 端 功 能 打 下 基础。 同 时 还 发 现 , 过 表达 C 197可 明 显 抑 制 Hela 细胞增殖 , 促 进其凋亡 , 降 低 细胞 端粒 酶 的 活 性, 为 肿瘤 的 生 物 治 疗 提 供 新的 思 路 。1材料与方法1.1材料1.1.1菌 种 、

9、细胞 系 、 载 体BJ5183、 DH5 、 HEK293细胞 、 Hela 细胞 、 重 组 腺 病 毒 系 统 AdEasy-1（包 含 骨架 质 粒 PAdEasy-1和 穿 梭 质 粒 PAdTrack-CMV 均 由 本 实 验室保存 。 1.1.2实 验 试 剂 和 设 备胎 牛 血 清 、高 糖 培 养 基 购 自 美 国 Hyclone 公 司 ; Sal 和 Ecor 限 制 性 内 切 酶 、 T4DNA 连 接 酶 、 Ex -Tag 酶 、 Pme 酶 、 Pac 酶 均 购 自 美 国 Thermo 公 司 ; 小 量 质 粒 提 取试剂盒 、 琼 脂 糖 凝胶 D

10、NA 回 收 试剂盒均 购 自 美 国 OMEGA 公 司 ; Trizol 试剂盒 购 自 上 海 生 物 技术 有 限 公 司 ; 台 盼 兰 试剂 盒 购 自 碧 云天 公 司 ; 凋亡 检 测 试剂盒 购 自 美 国 BD 公 司 ; PVDF 膜 、 TRAP 法 端粒 酶活 性 检 测 试剂 盒均 购 自 美 国 Millipore 公 司 ; ECL 显 色 试剂盒 购 自 美 国 Thermo 公 司 ; EB 溶 液 购 自 美 国 Sigma 公司 ; 6-his tag 抗 体、 凝胶 成 像 分析 仪 （美 国 Kodak 公 司 ; GDPDH 抗 体、 羊 抗 鼠

11、IgG 二 抗均 购 自 美 国Santa 公 司 ; 细胞 恒 温 培 养 箱 （美 国 Thermo 公 司 ; 高 速 离 心 机 （美 国 Backman 公 司 ; 荧 光 倒 置 显 微 镜 （日 本 Nikon 公 司 。1.2方法1.2.1目的基因 获 取根据 GenBank 公 布的人 hTERT 基因 序 列 , 选 取 C 端 936-1132氨 基 序 列 片 段 （命 名 为 C 197 , 在 该 片 段中的 C 端 引 入 Ecor 限 制 性 酶 切 位点, 在 N 端 引 入 6个 his 标 签 和 Sal 限 制 性 酶 切 位 点, 片 段 总 长 度为

12、 650bp , 合 成 后 克 隆 至 pGSI 载 体 （上 海 生 工 公 司 合 成 。1.2.2重 组 腺 病 毒 大 质 粒 的 构建 和 鉴 定 将含 有 目 的基因的 pGSI 载 体 进 行 双 酶 切 （Sal 和 Ecor 酶 , 酶 切 片 段 经 琼 脂 糖 凝胶电泳 分 离后 , 回 收含 有 his tag 的 C 197基因。 穿 梭 质 粒 PAdTrack-CMV 分别用 Sal 和 Ecor 限 制 性 内 切 酶进 行 双 酶 切 , 随 后 在 T4DNA 连 接酶 作 用 下 与 C 197基因 进 行 连 接 , 获得 重 组 质 粒 PAdTra

13、ck-C197。 用 Pme 酶 线 性 化 PAdTrack-C197, 将 其转 化 进入 到 含 有 骨架 质 粒 PAdEasy-1的 BJ5183细 菌 中 进 行 同 源 重 组, 得 重 组大 质 粒 PAd-C197。以 重 组大 质 粒 PAd-C197为 模 板 , C197基因的 上 下 游 引 物 （上 游 引 物 序 列:5 -AGGGTCGACACCAT - GCATCATCACCATCACCAT-3 , 下 游 引 物 序 列:5 -TGGATATCTCAGTCCAGGATGGTCTTGAA -3 进 行 PCR 扩 增 鉴 定和基因 序 列 测 序 , 同 时

14、用 Sal 和 Ecor 限 制 性 内 切 酶 对质 粒 进 行 双 酶 切 鉴 定。 1.2.3重 组 腺 病 毒 Ad-GFP-C197的 包 装 将 重 组大 质 粒 PAd-C197进 行 Pac 线 性 化 , 用 脂 质 体 2000将 线 性 化 产 物 转 染 进 入 HEK293细胞 中 进 行 腺 病 毒 包 装 , 待 细胞 出 现 CPE 病变 现 象 时 , 收 集 细胞 , 反 复 冻 融 3次 , 离 心 （3000r/min, 4 收 集上 清 , 得 到病 毒 原 液 Ad-GFP-C197。 空 载 体 对 照 病 毒 Ad-GFP 按照 同 样的 方 法

15、 进 行 包 装 。1.2.4重 组 腺 病 毒 的 纯 化 及 滴 度 测定 Ad-GFP-C197和 Ad-GFP 在 HEK293细胞 中 扩 增 后 , 氯 化 铯 密度 梯 度 离 心 法纯 化 病 毒 ; 最 后 转入 透 析 袋 , 4 透 析过 夜 13后 分 装 保存 , 分别 取 一 管 用 绿 色 荧 光 蛋白 标记 法 14检 测病 毒 滴 度。 1.2.5C197蛋白 在 Hela 细胞 中 的 表 达 Hela 细胞接 种 于 6孔板 （每 孔 2 105个 细胞 ,分别 将 Ad-GFP-C197和 Ad-GFP （MOI= 100 转 染 Hela 细胞 48h

16、 , 提 取 6孔板 中 细胞 的 总 蛋白 行 免 疫 印迹 实 验 。1.2.6Ad-GFP-C197对 Hela 细胞 凋 亡 及 增殖的 影 响收 集 Ad-GFP-C197和 Ad-GFP 转 染 24h 、 48h 和 72h 的 Hela 细胞 , 按照 Annexin V-PE 凋 亡 试剂盒 说明 书 处理 样 品后上 流 式 细胞 仪 进 行 检 测 并 收 集 数 据 , 根据 早 期 凋亡细胞 占 活细胞 数的 比 例 来 计 算 凋亡 率 并 进 行统 计 ; 同 时将 Hela 细胞 铺 于 24孔板 中 （每 孔 1 104个 , 共 7块 板 , 每 组 实 验

17、 6个 复 孔 。用 Ad-GFP-C197和 Ad-GFP 分 别 感 染 各 组 细胞 , 每 天 取 1块 板 进 行实 验 , 用 胰酶 消 化 各 组 细胞 , 采 用 台 盼 兰 计 数 法对 活细胞进 行 计 数, 并 绘 制 细胞增殖 曲 线 图。 1.2.7TRAP 法 检测 Hela 细胞 的 端粒 酶活性 收 集 Ad-GFP-C197转 染 24h 、 48h 和 72h 后 的 Hela 细胞 , Ad-GFP 转 染 72h 的 Hela 细胞 以及 正 常 的 Hela 细胞 。 分别 提 取 总 蛋白 并 调 成一 致 浓 度, 按照 TRAPEZE Telom

18、erase Detection Kit 说明 书 操 作; 产 物 行 12.5%聚 丙烯 酰 胺 凝胶电泳 后 用 EB 溶 液 染色 , 于 凝胶 成 像 系 统下 拍 照 。 1.2.8统计 方法均采 用 GraphPad Prism 5统 计 作 图 软 件 进 行 统 计 学 分析。 结果 均 以 s 表示 。组 间 比较 采 用 方 差分析, 以 P 0.05为差异有 统 计 学 意义 。 2结果2.1获得 目的基因从 含 有 目 的基因 C197的 pGSI 质 粒 中, 用Sal 和 Ecor 酶进 行 双 酶 切 , 酶 切 产 物经 琼 脂 糖 凝胶电泳 可 见 650bp

19、 特 异性 条 带 , 大 小 与目 的基 因相 符 。 结果 见 图 1。2.2PAd-C197大 质粒 的 鉴 定以大 质 粒 PAd-C197为 模 板 , C197基因的 上 下 游 引 物进 行 PCR , 且 将 PAd-C197大 质 粒 进 行 Sal 和 Ecor 双 酶 切 , 均 得 到 目 的 条 带 （650bp , 测 序 结果显示 该 片 段 序 列与 我 们 预 计 的 序 列 一 致 , 表 明 重 组大 质 粒 PAd-C197构 建 正 确 , 结果 见 图 2。 2.3重 组腺 病毒 包装 及 扩 增Pac 酶 切 线 性 化 的 重 组大 质 粒 PA

20、d-C197转 染 至 HEK293细胞 , 1周 后 镜 下 可 见 细胞 呈 彗 星 状 绿 色 荧 光 , 见 图 3; 表 明 重 组大 质 粒 在 细胞 内 得 到 表达 , 可 视 为 重 组 腺 病 毒 包 装 成 功 。 2.4病毒滴度 的 测定Ad-GFP-C197和 Ad-GFP 经 扩 增 纯 化 后 , 采 用 绿 色 荧 光 蛋白 法 进 行 病 毒 滴 度测定, 结果显示 Ad-GFP-C197的 滴 度为 3.14 1011pfu/mL, 对 照 病 毒 Ad-GFP 的 滴 度为 2.34 1011pfu/mL。 2.5C197在 Hela 细胞 内 的表 达A

21、d-GFP-C197转 染 Hela 细胞 48h 后 , 和 空 载 体病 毒 Ad-GFP 组相 比 , Ad-GFP-C197组的 C197蛋白 成 功表达 , 进 一 步 说明 了重 组 腺 病 毒 Ad-GFP-C197构 建 成 功 。 结果 见 图 4。 2.6Hela 细胞 凋亡 和增殖 情况与 Ad-GFP 组 比较 , Ad-GFP-C197转 染 Hela 细胞 后 , 在第 3d 开 始 出 现 增殖 抑 制作 用, 细胞增 图 1双 酶 切 获得 目的基因 C 1971: DL2000DNA marker 条 带 ; 2: C 197cDNA 条 带 （ 650bp

22、。 Fig.1Obtained the C 197by restriction enzyme assay 1:DNA marker DL2000; C 197cDNA （ 650bp .图 2PAd-C197重 组 大 质粒 的 鉴 定（ A PCR 结果 。 1: PAd-GFP 组 ; PAd-C197组 （ 650bp ; M : BM2000Marker 条 带 。（ B 双 酶 切 结果 。 1 3: 10000Marker 。 Fig.2Identification of recombinant plasmid PAd-C197 （ A The result of PCR. 1:P

23、Ad-GFP group ;PAd-C197group （ 650bp ; M:BM2000plus DNA Marker. （ B Restriction enzyme assay.1 3:M:BM10000 plus DNA Marker.bp 12700500bp M 12123M bp 10000700 500 700 10PE-A PE-A PE-A图 3PAd-C197转 染至 HEK293细胞 荧光 显 微镜 图 （ 100（ A Hela 细胞 图 ;（ B 绿 色 荧 光 图 。Fig.3Fluorescent images of HEK-293cells after tra

24、ns fection with PAd-C197（ 100（ A Image of Hela cells ;（ B Fluorescent image of Hela cells.殖速 率 明 显 降 低 ; 在 转 染 后 24h 、 48h 、 72h , Ad-GFP-C197转 染 的 Hela 细胞 的 凋亡 率 明 显 高 于Ad-GFP 对 照 组, 表 明 Ad-GFP-C197能Hela 细胞增殖 并 诱 导 Hela 细胞凋亡 。 结果 见 图 5。 2.7TRAP 法 检测 Hela 细胞 的 端 粒 酶活性 依 据 TRAP 方 法检 测 端粒 酶活 性, 结果显示 ,

25、 每 一组都 出 现 了 36bp 的 条 带 , 说明 TRAP 方 法 操 作 成 功 , 阴 性 对 照 组 无 端粒 酶活 性。 与 端粒 酶 阳 性 对 照 组和 空 白 对 照 组相 比 , Ad-GFP 转 染 组的 端粒 酶活 性 不受影响 , 而 Ad-GFP-C197转 染 组 的 端粒 酶活 性在第 2d 开 始 出 现 降 低 ,第 3d 降 低得 更 明 显 。 说明 Ad-GFP-C197能 够 明 显 地 抑 制 Hela 细胞 中 端粒 酶活 性。 结果 见 图 6。 3讨论端粒 酶 在 除 造 血 组 织 和 生 殖细胞 外 的 正 常 组 织 中 不表达 或

26、 低 表达 , 而 在 80% 90%的 肿瘤 中 表 达 异 常 增 高, 所 以 端粒 酶 的 激活 可能是 肿瘤 发生 过 程 中的关 键 因 素 。 而 端粒 酶 逆 转录酶 hTERT 是 端粒 酶活 性的 限 速酶 , hTERT 的表达 异 常 增 加 也 通 常 被 认 为是 肿瘤 发生 前 期 标 志 15 17。已有 研究 表 明 在体 外 降 低 hTERT 的 表达 ,可以 缩 短 端粒 长 度、 诱 导细胞凋亡 以及 抑 制 肿瘤 细胞 的 生 长 , 于 是 hTERT 成为 抗 肿瘤 研究 中一个新的 特 异性 靶 点 18, 19。端 （RNA结 合 区 、 逆

27、 转录 区 （A（B图 4免疫 印迹 法 检测 C197蛋白 在 Hela 细胞 中的表 达水平1 2: Ad-GFP-C197组 ;3: Ad-GFP 组 。Fig.4Western blot assay was used to determine ex pression of C197protein in Hela cellsLane 1 2:Ad-GFP-C197group; Lane 3:Ad-GFP group.图 5重 组腺 病毒 Ad-GFP-C197对 Hela 细胞 增殖和 凋亡 的 影响（AHela 细胞 增殖 曲线 （n =6;（BHela 细胞 凋 亡 情况 （n =3

28、;*P 0.05、 *P 0.05,与 Ad-GFP 对 照 组 相比 。Fig.5The effect of Ad-GFP-C197on the proliferation apoptosis of Hela cells（AProliferation curve of Hela cells（n =6;（BApoptosis of Hela cells （n =3;0.05,*P 0.05,compared with the Ad-GFP group. 123C197GAPDHt /d（ATime after infection（B图 6TRAP 法 检测 Hela 细胞 中 端 粒 酶活性每 一 个 泳道 都 能 见 36bp 大 小 条 带 （ S-IC 。 阴 性对 照 组 ; 端粒 酶 阳 性对 照 组 （ 能 见 相 差 6个 碱 基的 梯 度条 带 ; 3: Ad-GFP 转 染组 ; 4, 5: 分 别 是 Ad-GFP-C197转 染 24h 和 48h 组 ; 6, 7: Ad-GFP-C197