细菌内毒素与热原的区别Word格式.docx

1、Saccharide）和微量蛋白（Protein）的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等）及其它微生物（如衣原体、立克次氏体、螺旋体等）的细胞壁层的脂多糖，其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。（附图1）、O特异性链：位于脂多糖分子最外层的多糖链，是由35个单糖（一般不多于25个）连成为一个多糖链。其单糖包括戊糖、氨基戊糖、已糖、氨基已糖、脱氧已糖等，单糖的种类、位置和排列顺序和空间构型，因菌种不同而异。因此，它决定菌

2、体热原的特异性。二核心多糖：核心多糖的变异性较小，位于类脂A和0特异性链（内层）之间，在结构上分为内核心和外核心。外核心含有数种己糖，包括葡萄糖、半乳糖、乙酰氨基葡萄糖等组成。内核心含有庚糖及特殊的酮糖（3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖KDO）。这部分结构对不同菌株的LPS基本相似，而且KDO是以不耐酸的酮糖链与类脂A的氨基葡萄糖连接，是构成内毒素脂多糖的核心部分。三类脂A：位于LPS分子结构的外层，是由氨基葡萄糖、磷酸和脂肪酸（1018C）组成，故称之为糖磷脂，也是细菌外膜的一种，形成单体聚合物。具有疏水性（强）和亲水性（弱）的双相性。但是，类脂A可从O-特异链及核心多糖分离出来，游离的类脂A可

3、自身凝聚成大分子的复合体而难溶于水，并具有生物活性。所以，类脂A（Lipida）是内毒素多种生物活性或毒性反应的主要基团。该基团没有种属特异性，所以各属细菌的类脂A结构相似，其毒性反应相似。如发热、血液流动力学改变、弥漫性血管内凝血，并导致休克等。由于类脂A有4条主链和2条支链的脂肪酸与内酰胺连接组成，所以提纯的内毒素LPS是极为不稳定的。这就要求内毒素应在低温条件下保存，在工作中内毒素稀释应尽可能地缩短时间，并要现配现用。三、内毒素的生物活性与疾病的相关性据文献报道，在很早期（约19世纪末）的意大利学者Centanne通过菌属自溶的方法，从革兰氏阴性杆菌中提取出一种类似毒素的物质，因为这种物

4、质对动物体产生致热活性的同时，亦产生出一种病理学病性反应，而被命名为致热毒素（Pyrotoxina）。同时由德国的Buchner也从多种细菌中提取到相似的致热毒素，并证实了这种毒素在导致白细胞数目的改变同时，具有增强机体对细菌感染时的免疫能力。因此建立了“发热疗法”。在美国纽约的临床医师，WilliamBColey用加热法杀死录杆菌和化脓性链球菌，将上清滤液用于各种恶性肿瘤（特别是肉瘤）的治疗，取得较好的疗效。他将这种细菌上清液命名为Coley氏毒素。此后murrayJ.Shear证实Coley氏毒素中具有抗肿瘤作用的物质为内毒素。直到1933年Boivin等学者在研究鼠伤寒杆菌的致病机理时，

5、从鼠伤寒杆菌中提取出内毒素。在50年代以后，对内毒素的化学成分和化学结构的研究得到迅速发展。经过大量实验表明，内毒素具有极强的生物学活性，特别是革兰氏阴性菌感染和静脉注射提取的内毒素溶液时，可导致动物体发生内毒素休克和死亡。内毒素的致病机理，主要是由于革兰氏阴性杆菌（如大肠杆菌、沙门氏杆菌、伤寒杆菌，布氏杆菌、变形杆菌金黄色葡萄球菌等）和其它微生物（病毒、立克次氏体、衣原体螺旋体等）感染时，这类菌属随病灶渗液进入血液循环，并扩散到各种组织器官和体液细胞内繁殖，这类菌属在体内死亡和解体后，才稀放出大量的细菌内毒素脂多糖（LPS），据初步实验表明，当机体内毒素浓度國值0.005ng/ml时,可诱生

6、内源性热原质如肿瘤坏死因子、白细胞介素和2干扰素等。这些因子刺激体温调节中枢导致机体发热，细菌内毒素直接或间接作用于肝脏和胰腺时，可使肝细胞损伤，使糖原异生酶（如葡萄糖66磷酸酶、糖原合成酶）的活性降低，抑制糖原的异生和分解。同时内毒素作用于胰腺导致胰腺功能障碍，并形成胰岛素抵抗，造成血糖升高致使并发心肌炎和心肌肿大的系列高血糖症状。所以，革兰氏阴性菌属感染或在病灶中的细菌进入体液细胞繁殖，当其死亡或解体后产生的内毒素，可多次进入血液，引起反复发作，其病理变化极为广泛，几乎所有的器官和组织都可被侵犯，而引起各器官的功能障碍。其中以网状内皮系统最常见，淋巴、脾、肝、肾、骨髓中均有上皮细胞增生，形

7、成肉芽肿，以肝脏有肉芽肿外，还可发生冲血、水肿和肝细胞坏死，最终导致肝硬化的发生。其它器官亦有相似的毒性反应。细菌内毒素与热原检验没有本质区别，在2005版中国药典颁布后，药典标准尽量多的采用细菌内毒素检验，减少实验动物的使用，一则是对于动物保护组织的响应，另外是出于节约成本的考虑。但是中药品种依然均采用热原法，因为中药中成分复杂，相互作用关系不清，所以仍然采用热原检查法，保证其安全性。热原系指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。这里所指的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。致热

8、能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。热原通常是磷脂多醇与蛋白质结合而成的复合物。磷脂多醇是复合物的活性中心，致热作用最强。其化学组成因菌种不同而有所差异。分子量为51045105，分子量越大致热作用也越强。注入人体的注射剂中含有热原量达1g/kg就可引起不良反应，发热反应通常在注入1小时后出现，可使人体产生发冷、寒颤、发热、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40以上，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。该现象称为“热原反应”。热原没有多少这一概念，中国药典2005年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检

9、查采用鲎试剂法。1、热原检查法由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。中国药典2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001g/ml,试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂。2细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒

10、素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法，前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来测定内毒素。鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为0.0001g/ml,比家兔法灵敏10倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂，但其对革兰阴性菌以外的内毒素不灵敏，目前尚不能完全代替家兔法 一热原（pyroge

11、n）是微生物产生的内毒素，是由磷脂、脂多糖和蛋白质组成的复合物，微量即可引起恒温动物体温异常升高。其中脂多糖具有很强的热原活性。由革兰氏阴性杆菌产生的热原致热能力最强，真菌、病毒也可以产生热原。一、热原的性质及除去热原的方法 1.高温法 热原的耐热性能良好，60加热1h不被分解破坏，100不降解，但18034h、20060min或2503045min可使热原彻底破坏。因此耐热物品如玻璃制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，均可采用此法破坏热原。但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。2.吸附法 热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于

12、活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用，故广泛用于注射剂生产，但应注意吸附药液所造成的主药的损失。3.超滤法 热原分子量为1106左右，体积较小，约15nm，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用3.015nm超滤膜可将其除去。4.蒸馏法 热原能溶于水但不挥发，但可随水蒸气的雾滴进入注射用水中，因此制备注射用水时，原水中的热原可经蒸馏除去，但需多次蒸馏，并加有隔沫装置，单次蒸馏往往效果不理想。5.酸碱法 热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，破坏热原。6.其它 包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。二、热原

13、的检查方法 中国药典2005年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采用鲎试剂法。1.热原检查法 由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。中国药典2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001g/ml，试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂。2.细菌内毒素检查法 细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内

14、毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素的量用内毒素单位（eu）表示。细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法，前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来测定内毒素。鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为0.0001g/ml，比家兔法灵敏10倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂，但其对革兰阴性菌以外的内毒素不灵敏，目前尚不能完全代替家兔法。二细菌内毒素，英

15、文称作Enolotoxin，是G-菌细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。内毒素的主要化学成分为脂多糖中的类脂A 细菌内毒素这个概念在1890年的时候就已被提了出来，它是在研究发热物质过程所引成的，1933年Boivin最先由小鼠伤寒杆菌提取出来，进行化学免疫学方面的研究，到1940年时候，Morgan使用志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，到了1950年以后，随着生物学，物理化学，免疫学以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系

16、也更加明确起来。细菌英文叫Bacteria：为原核生物中的一类单细胞微生物由二分裂法繁殖。若按革兰氏染色法可将细菌分为G+菌和G-菌两大类。这两类细菌细胞壁的结构和化学组成存在很大差异。唯有肽聚糖为其共同成分，但其含量的多少和肽链的性质有所不同，见上图表 细胞壁较薄，厚约1015nm，结构也较复杂。肽聚糖含量低，仅占细胞干生10%左右，层薄又较疏松，因肽聚糖之间仅四肽侧链直接联结，缺乏五肽桥；肽聚糖居于细胞最内层，外面由内向外还有脂蛋白，外膜和脂多糖的三层聚合物。（1）脂蛋白（lipoprotein）由类脂和蛋白质构成，联结在外膜与肽聚糖层之间，类脂一端经非共价键联结到外膜的磷脂上，另一端由共

17、价键联结到肽聚糖肽链中的二氧基庚二酸残基上，使外膜和肽聚糖层构成一个整体。（2）外膜（outermembrane）是革兰氏阴性菌细胞壁的重要结构，位于肽聚糖的外侧，其结构类似细胞膜，为液态的磷脂双层，其中镶嵌一些特异蛋白质，穿透外膜的内外双层，呈液态镶嵌体。外膜中间有微小孔道，容许水溶性的小分子通过，以进行细胞内外的物质运输和交换。除此之外，外膜还能防止胰蛋白酶和溶菌酶等进入，起到保护性屏障作用。（3）脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）由多糖O抗原、核心多糖和类脂A（lipidA）组成（图1-8），位于最外层。多糖O抗原向外，由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，即革兰氏阴

18、性菌的菌体抗原（O抗原），有特异性。核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脱氧辛酸（2-keto-3-deoxyoctonicacid,KDO）等组成，所有革兰氏阴性细菌都有此结构。类脂A是以脂化的葡萄胺二糖为单位，通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物，具有致热作用，是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分。细菌内毒素即：许多病原性细菌所产生的毒素。一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素（Exotoxin）；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。加一类为内毒素（Endot

19、oxin）。是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有结构。细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。鲎试剂法是利用鲎血细胞溶解物与微量）细菌（主要是革兰氏阴性细菌,G-）的内毒素反应,从而检出被检物中内毒素的一种生物体外检测新技术.因为其具有快速、简便、经济、灵敏度高、重现性好、一次可同时测几个样品等优点,自从一九*年美国学者Levin和Bang发现此法以来1,鲎法正被日益广泛地应用于医药卫生、食品卫生、环境卫生、分子生物学、以及微生物学中.鲎法大致可分为凝胶法、比浊法色原基质法、以及免疫法等.本文依据文献报道,总结

20、了近年来国内外学者在用这些方法测定细菌内毒素时发现的一些影响因素及其消除方法的研究进展,以供试验者参考.1试验条件与操作培养条件、操作环境可能引起各次实验之间、各实验室之间的结果差异2.1.时间鲎试剂在液态时极不稳定,室温放置太久会影响反应灵敏度,故加样结束后,应立即放入恒温水浴中.3延长保温时间,可提高LAL的灵敏度.4有研究者5发现细菌内毒素国家标准品和工作标准品的不同混合时间与相对活性之间具有一定的规律,即分钟时混合点的活性最强,混合时间越长,活性反而降低,但在三十分钟以内的各混合点测定的灵敏度均在规定范围之内.在显色法中灵敏度与时间有关,故实验过程中既要严格控制每个环节的保温时间,又要

21、严格控制终止时间267.12温度凝胶试验规定的孵化温度为37.但在夏季高温季节,如果同时作几个样,阳性对照不成立的现象时有发生,故应改为冰浴.3郭录平4通过实验证明,保温在25-41内,随着温度的升高,LAL的灵敏度也随着升高；在41-46之间,对灵敏度无明显影响；48会破坏鲎试剂.另外在显色法中的灵敏度也与控制温度有关67.1.3pH值高国政等人8用动态浊度法详细研究了样品pH值对细菌内毒素测定的影响,结果发现:样品pH在6-8间实验结果稳定；3或12时,实验受到抑制,平均回收率56.8%.最后得出结论:使用TAL时,供试品应预调在6.5-7.5为好；使用LAL时,pH应预调在6.20.1或

22、6.7-7.8为好.也有人认为479鲎试验的应为6.5-8.5,以7.0-7.5为佳.必要时可用无内毒素的HCl或NaOH调节值2.14试验器具内毒素稀释不宜用注射器,而应用经过校正的刻度吸管.因为注射器刻度不准,而且,针栓壁磨沙面易吸附内毒素而使其浓度不够,造成凝胶反应不成立310.普通玻璃及塑料管也会影响实验结果29,用硬的玻璃管及AR玻璃管较为合适.一般硼酸玻璃管测得的效价较低,而且LAL的灵敏度愈低,管对测定的结果影响愈大.操作中常用的聚丙烯塑料管可能干扰结果.15操作程序有实验者发现311:操作次序也影响试验结果.应该先吸取供试品、然后加入阴性对照及阳性对照液,最后按供试品管、阳性对

23、照管、阴性对照的顺序逐一精确加入鲎试剂.未按此程序容易出现阳性反应不成立的现象.1.6处理作用PedersenMR和HansenEW12将内毒素溶液用玻璃试管干燥,在氧丙环（EthyleneOxide,EO）450或900mg/l中暴露1-46小时后,内毒素的LAL活性减少至百分之三十.将多粘菌素B（PolymyxinB,PB）加入到内毒素稀释液中会减少其活性百分之七十五.内毒素经过EO处理会减少LAL活性百分之七十,进一步加入PB会减少LAL的活性百分之九十九.EO对内毒素的反应会减少其LAL活性,也会减少其热源反应,增加与PB的亲和性.BambaT13等学者研究了平滑型G-细菌的内毒素（S

24、moothgram-negativebacteria,S-form）经过高温蒸气处理后的灭活效果,观察到不同种细菌的抗热性显著地不同,减弱率与浓度有关.低浓度（10ng/ml）内毒素处理后的活性可降低至可测定的限度下.粗糙型（Roughstrains,R-form）细菌的内毒素减弱时间曲线与个别平滑型相似.平滑型,尤其是Rc突变体（Rcmutant）细菌的内毒素灭活性能够被Mg2+,Ca2+等二价阳离子显著影响.FDA认为不同的产品处理和储存条件可能会引起对某一样品试验的分析误差.GuilfoyleDE14等人通过实验发现培养细菌的培养基以及溶剂的储藏温度均不会引起任何问题.然而,因为溶液在瓶

25、中没有充分震荡,溶剂与橡胶塞接触,约有百分之二十到四十的内毒素丢失.解决此问题的方法是应将试剂直立地存放在无污染的瓶中,并规定在内毒素试验之前统一的混合步骤.姜素云等15通过考察细菌内毒素的稳定性后发现,溶解后的细菌内毒素应用液（0.5-1.0Eu/ml）在0-4放置一周活性不变；1.0-20Eu应用液若置冰箱,可冷冻保藏20天,但反复冻融活性会逐渐降低.2供试品2.1多糖2我们已经知道每毫升含皮克级的内毒素会使鲎试剂呈阳性,而多于10pg/ml浓度的产碱杆菌多糖（1-3-D-葡聚糖）（curdlan,1-3-beta-D-glucan）也会使常规的内毒素实验呈阳性,因为LAL中含G因子16.

26、据报道1718,能激活鲎试剂旁路（G途径）的物质主要是（1-3）-D-葡聚糖（包括（1-4）-D-葡聚糖和（1-6）-D-葡聚糖）以及LAL-RM（LAL-ReactionMaterial）两类,如真菌多糖（Fugalpolysaccharide）、中空纤维滤膜洗涤液、肾透析仪（人工肾,血液透析仪）洗涤液等.实验室常用的酒精,棉球等也含有较多的（1-3）-D-葡聚糖.低于一定浓度的（1-3）-D-葡聚糖或LAL-RM不足以使鲎试剂的凝集反应产生阳性结果,但如果有细菌内毒素共同作用的情况下,凝集反应会变得更为激烈和迅速,很容易使反应出现阳性结果.我国已生产出含有能抑制或阻断鲎试剂G因子旁路反应物

27、质的试剂增抗液（AntienhancementSolution）.CooperJFWearyME19等学者发现商品的LAL试剂对葡聚糖的反应存在很大的差异,所以实验室间LAL实验的结果可能出现矛盾.动态LAL方法（Kineticmethods）对筛选可能被葡聚糖污染了的物质非常有用.葡聚糖在非口服制剂中不常见,只限于被微生物或纤维素物质污染的产品.并设计了一种能确定葡聚糖存在与否的LAL试验方法.另外,丹麦科学家20发现,细菌内毒素与鲎试剂的凝集反应可被二甲亚砜与多粘菌素B（dimethylsulfoxideandpolymyxinB）合用,或抗鲎C因子的单克隆抗体（monoclonalantibodyagainstLimulusfactorC）所抑制.他们还发现-葡聚糖（beta-glucan）激活途径能完全被昆布糖（laminarin）所阻碍,而不影响内毒素的激活途径.人血浆与LAL反应是通过-葡聚糖途径激活的,而非内毒素途径.八十年代后,日本最先研制成功只与内毒素起反应的特异鲎试剂,如:Endospecy,以及只与（1-3）-葡聚糖反应的鲎试剂:SLP试剂及Gluspecy.212.2蛋白2.2.1阳离子蛋白几位德国科学家21发现阳离子蛋白（Cationicproteins）如溶菌酶、核糖核酸酶A、以及人的免疫球蛋白G（lysozy