食品中蜡样芽孢杆菌检测方法的分析Word下载.docx

1、【正文语种】中 文【中图分类】医药卫生Nov 2014CHINA FOOD SAFETY 63分析与检测蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）是 芽 孢 杆 菌 属（Bacillus） 中 的 一种革兰氏阳性杆菌，菌体大小为 （1.0m1.2m） （3m5m） ， 杆状菌体有成链的趋势，芽孢呈椭 圆形，中生，孢子囊不明显膨胀。蜡 样芽孢杆菌能够发酵葡萄糖产酸，不 发酵阿拉伯糖、木糖和甘露醇，可将 硝酸盐还原，过氧化氢酶试验阳性， 能产生卵磷脂酶和酪蛋白酶。最高 生长温度 35 45，最低生长温度 10 20，能够在 7% NaCl 中生长， 生长在葡萄糖洋菜上的细胞含有复红 不着色的小球

2、，不产生细胞内蛋白晶体 1。 目前，国内外对于蜡样芽孢杆菌的检测方法，主要有常规检测方法、 酶反应检测方法、PCR 技术和免疫学技 术检测方法等。1常规检测方法常规的检测方法一般分为平板计 数法和 MPN 计数法，检测步骤都包括 分离培养、 纯化培养、 证实试验等过程。 在证实试验中，有革兰氏染色、葡萄 糖发酵试验、硝酸盐还原试验、改良 V-P 试验、L- 酪氨酸分解试验、溶菌 酶试验、动力试验、溶血试验、蛋白 毒素结晶试验等 6-7。常规检测方法的优点是技术成熟、 容易操作，国家标准和行业标准中的 检验方法都是微生物实验室中常见的 基础操作，具有一般微生物检测基础 的人员都可以完成检测。同时

3、，常规 检测方法也存在以下缺点：常规检 测方法中使用的甘露醇卵黄多粘菌素 琼脂（MYP）培养基，在配置时需要使 用鸡蛋制作 50% 卵黄液加入基础培养 基中，以无菌操作取出卵黄的过程比 较麻烦，且容易污染影响检验结果 7。 另外，利用卵磷脂酶分解培养基中的 卵黄产生过大的沉淀带，导致菌落之 间会漫延连接而难以计数的缺点，给食品中蜡样芽孢杆菌检测方法的分析杨广锐石河子大学 食品学院摘要：蜡样芽孢杆菌分布广泛，是常见的食品污染菌和条件致病菌，通过产生呕吐毒素和腹泻毒素导致食物中毒。 对常规检测方法、酶反应检测方法、PCR 技术和免疫学技术检测方法进行归类分析，总结各种检测方法的优点和局限性。 关键

4、词：蜡样芽孢杆菌；检测；局限性Nov 2014CHINA FOOD SAFETY 63蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）是芽孢杆菌属（Bacillus） 中 的 一种革兰氏阳性杆菌，菌体大小为（1.0m1.2m） （3m5m） ，杆状菌体有成链的趋势，芽孢呈椭圆形，中生，孢子囊不明显膨胀。蜡样芽孢杆菌能够发酵葡萄糖产酸，不发酵阿拉伯糖、木糖和甘露醇，可将硝酸盐还原，过氧化氢酶试验阳性，能产生卵磷脂酶和酪蛋白酶。最高生长温度 35 45，最低生长温度10 20，能够在 7% NaCl 中生长，生长在葡萄糖洋菜上的细胞含有复红不着色的小球，不产生细胞内蛋白晶体1。目前，国内外对于蜡样芽孢

5、杆菌的检测方法，主要有常规检测方法、酶反应检测方法、PCR 技术和免疫学技术检测方法等。常规的检测方法一般分为平板计数法和 MPN 计数法，检测步骤都包括分离培养、 纯化培养、 证实试验等过程。在证实试验中，有革兰氏染色、葡萄糖发酵试验、硝酸盐还原试验、改良V-P 试验、L- 酪氨酸分解试验、溶菌酶试验、动力试验、溶血试验、蛋白毒素结晶试验等 6-7。常规检测方法的优点是技术成熟、容易操作，国家标准和行业标准中的检验方法都是微生物实验室中常见的基础操作，具有一般微生物检测基础的人员都可以完成检测。同时，常规检测方法也存在以下缺点：常规检测方法中使用的甘露醇卵黄多粘菌素琼脂（MYP）培养基，在配

6、置时需要使用鸡蛋制作 50% 卵黄液加入基础培养基中，以无菌操作取出卵黄的过程比较麻烦，且容易污染影响检验结果 7。另外，利用卵磷脂酶分解培养基中的卵黄产生过大的沉淀带，导致菌落之间会漫延连接而难以计数的缺点，给杨广锐石河子大学 食品学院摘要：对常规检测方法、酶反应检测方法、PCR 技术和免疫学技术检测方法进行归类分析，总结各种检测方法的优点和局限性。关键词：局限性64 食品安全导刊2014年11月T echnology 科技 分析与检测检测结果带来极大的不确定性 8。 常规检验方法需要经过分离培养、纯 化培养、证实试验等步骤，其中每个 步骤的检验时间都在 24h48h，个别试 验甚至需要 7

7、2h 才能完成，这样最终 检验完毕至少需要耗时 4d6d，费时费 力，极大限制了在食品加工中对蜡样 芽孢杆菌污染的有效监控。在 SN/T 方法中，规定可以使用 API50CHB 生 化鉴定试剂盒或 VITEK 全自动微生物鉴 定系统，或者其他等效产品用作可替 代的生化实验，此类产品可以有效的 降低检测人员的劳动强度，给检测工 作提供了很大的方便，但同时带来的 检测成本上升也是国内一般中小型食 品企业所难以承受的，因此限制了此 类产品的广泛应用。2酶反应检测方法酶反应检测方法在蜡样芽孢杆菌 检测中的应用，最突出的就是显色 培养基技术。卢勉飞等对一种蜡样 芽孢杆菌显色培养基（HKMCB）与国 外O

8、XOID 蜡样芽孢杆菌显色培养基 （OXCB）以及传统甘露醇卵黄多粘菌 素琼脂培养基（MYP）进行了比较和初 步评价，结果显示利用显色培养基检测蜡样芽孢杆菌，较传统平板具有较 高的特异性和选择性 8。张淑红等设 计蜡样芽孢杆菌显色培养基 （HKCB） 后， 进行人工污染样品和实际样品检验， 结果显示在人工污染样品和实际样品 检测中，显色培养基（HKCB）与传统 平板（MYP）可以达到相同的检测限和 灵敏度，且具有较高的特异性 9。 从对蜡样芽孢杆菌显色培养基的 研究中可以看出，酶反应检测方法的 优点在于通过直接观察菌落颜色即可 对菌种做出初步鉴定，具有快速、简 便和经济的特点，为蜡样芽孢杆菌快

9、 速检测构建了一个技术平台。酶反应 检测方法的不足在于：虽然商品化 的显色培养基已被许多国家的政府和 检测机构采用，但我国的食品卫生标 准中，尚未规定可以使用显色培养基 用于蜡样芽孢杆菌的检测，这就导致 了显色培养基暂时难以广泛应用于食 品中蜡样芽孢杆菌的检测。蜡样芽 孢杆菌与同为芽孢杆菌属的苏云金芽 孢杆菌（B.thuringiensis）、炭疽芽孢 杆菌 （B.anthracis） 、 蕈状芽孢杆菌 （B.mycoides）的形态特征、生理生化特征 非常相似， 并有着极高的 DNA 同源性。例如炭疽芽孢杆菌 Sterne 株与蜡样芽 孢杆菌模式株 NCDO1771 的 16SrRNA 序列

10、相似度达 100%，16SrRNA-23SrRNA 基因间隔序列仅有 2 个核苷酸的 差异 10，而对于苏云金芽孢杆菌，目 前还没有任何一个生化反应可以把它 与蜡样芽孢杆菌相区分，两者表型上 的区别仅仅在于能否在芽孢形成时产 生位于芽孢膜外的伴胞晶体，需用显 微镜观察。因此仅使用显色培养基检 测，仍然未能最终实现蜡样芽孢杆菌 的快速简便检测。3PCR 技术和免疫学技术检测方法利用 PCR 技术、免疫学技术进行 蜡样芽孢杆菌的检测，国内外已经进 行了广泛的研究。通过 PCR 扩增致病 性蜡样芽孢杆菌的特定基因，可以实 现对蜡样芽孢杆菌的快速检测 11。在 常规 PCR 基础上，建立和发展了扩增

11、片段长度多态性（AFLP）技术 12、过 滤富 集菌体 PCR 技术 13、实 时荧光 PCR 技术 14、 环介导等温扩增 （LAMP） 技术 15 等用于蜡样芽孢杆菌的快速 检测；利用反向被动乳胶凝集试验 （RPLA）、蛋白印记技术（Colony Blot 64 食品安全导刊2014年11月Technology科技检测结果带来极大的不确定性 8。常规检验方法需要经过分离培养、纯化培养、证实试验等步骤，其中每个步骤的检验时间都在 24h48h，个别试验甚至需要 72h 才能完成，这样最终检验完毕至少需要耗时 4d6d，费时费力，极大限制了在食品加工中对蜡样芽孢杆菌污染的有效监控。在 SN/T

12、方法中，规定可以使用 API50CHB 生化鉴定试剂盒或 VITEK 全自动微生物鉴定系统，或者其他等效产品用作可替代的生化实验，此类产品可以有效的降低检测人员的劳动强度，给检测工作提供了很大的方便，但同时带来的检测成本上升也是国内一般中小型食品企业所难以承受的，因此限制了此类产品的广泛应用。酶反应检测方法在蜡样芽孢杆菌检测中的应用，最突出的就是显色培养基技术。卢勉飞等对一种蜡样芽孢杆菌显色培养基（HKMCB）与国外OXOID 蜡样芽孢杆菌显色培养基（OXCB）以及传统甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基（MYP）进行了比较和初步评价，结果显示利用显色培养基检测蜡样芽孢杆菌，较传统平板具有较高的特异性

13、和选择性 8。张淑红等设计蜡样芽孢杆菌显色培养基 （HKCB） 后，进行人工污染样品和实际样品检验，结果显示在人工污染样品和实际样品检测中，显色培养基（HKCB）与传统平板（MYP）可以达到相同的检测限和灵敏度，且具有较高的特异性 9。从对蜡样芽孢杆菌显色培养基的研究中可以看出，酶反应检测方法的优点在于通过直接观察菌落颜色即可对菌种做出初步鉴定，具有快速、简便和经济的特点，为蜡样芽孢杆菌快速检测构建了一个技术平台。酶反应检测方法的不足在于：虽然商品化的显色培养基已被许多国家的政府和检测机构采用，但我国的食品卫生标准中，尚未规定可以使用显色培养基用于蜡样芽孢杆菌的检测，这就导致了显色培养基暂时难

14、以广泛应用于食品中蜡样芽孢杆菌的检测。蜡样芽孢杆菌与同为芽孢杆菌属的苏云金芽孢杆菌（B.thuringiensis）、炭疽芽孢杆菌 （B.anthracis） 、 蕈状芽孢杆菌 （B.mycoides）的形态特征、生理生化特征非常相似， 并有着极高的 DNA 同源性。例如炭疽芽孢杆菌 Sterne 株与蜡样芽孢杆菌模式株 NCDO1771 的 16SrRNA序列相似度达 100%，16SrRNA-23S rRNA 基因间隔序列仅有 2 个核苷酸的差异 10，而对于苏云金芽孢杆菌，目前还没有任何一个生化反应可以把它与蜡样芽孢杆菌相区分，两者表型上的区别仅仅在于能否在芽孢形成时产生位于芽孢膜外的伴

15、胞晶体，需用显微镜观察。因此仅使用显色培养基检测，仍然未能最终实现蜡样芽孢杆菌的快速简便检测。利用 PCR 技术、免疫学技术进行蜡样芽孢杆菌的检测，国内外已经进行了广泛的研究。通过 PCR 扩增致病性蜡样芽孢杆菌的特定基因，可以实现对蜡样芽孢杆菌的快速检测 11。在常规 PCR 基础上，建立和发展了扩增片段长度多态性（AFLP）技术 12、过滤富 集菌体 PCR 技术 13、实 时荧光PCR 技术 14、 环介导等温扩增 （LAMP）技术 15 等用于蜡样芽孢杆菌的快速检测；利用反向被动乳胶凝集试验（RPLA）、蛋白印记技术（Colony Blot Nov 2014CHINA FOOD SAF

16、ETY 65Immunoassay CBI）快速检测蜡样芽孢杆菌的方法均有报道 16。 将分子生物学、免疫学的技术应 用于蜡样芽孢杆菌的检测，建立了方 便、快捷的技术方法，整个检测过程 只需 6h 左右即可完成 13，甚至可以 在2h内完成 15，大幅度缩短了检测时 间，降低了成本，同时 PCR 技术、免 疫学技术检测方法还具有灵敏度高、 特异性强、实验条件简单的优点，易 于推广应用。此类检测技术的缺点在 于：对检测人员的技术水平要求较 高，需熟练掌握分子生物学等相关技 术，并且检测结果的稳定性和重现性 相对较低，技术还不够成熟，目前暂 不适合于通过国家标准等向相关企业 和检测机构推广。 PC

17、R 技术的应 用，是针对致病性蜡样芽孢杆菌致病 相关基因序列设计特异引物，一般基 于entFM13、cereolysin AB14、hblA17、 bceT17等具有毒力的特异性保守基因， 杨媛等从原料乳中检出蜡样芽孢杆菌 33株，其中 27 株获得了 hblA 基因引 物扩增片段，24 株获得了 bceT 基因引 物扩增片段，同时含有两段基因的有 20株，而两种毒性基因都不含有的有 2株 17，李煜等在 17 株蜡样芽孢杆菌 中发现其中有 1 株无溶血活性 18，胡 晓敏等报道在 1 株蜡样芽孢杆菌无溶 血活性，基因检测发现无肠毒素基因 19。由此可见，利用 PCR 技术检测蜡 样芽孢杆菌，

18、仅能检测到与特异引物 相关的致病性菌株，与特定引物不相 关的致病性菌株及不含毒力基因的非 致病性菌株则不能被检测到，这也是 PCR 技术检测的局限性。4 结语 对食品中蜡样芽孢杆菌的检测方法进行了归类分析，可以看出每一类 方法都存在固有的优点和不足，针对 现行国家标准中蜡样芽孢杆菌检测方 法费时费力、劳动强度大、检验成本 高的特点，提出以下两方面的思考。 第一，参照 ISO 中假定蜡样芽孢杆菌的 技术方法 20，实现检测标准与国际接 轨，只要在甘露醇卵黄多粘菌素琼脂（MYP）平板上出现粉红色、周围有白 色沉淀环的典型菌落且该菌落在血平 板上出现溶血现象的就可以确定是阳 性菌，这样的检测方法既可

19、以省略现 行国标中繁琐的证实试验，降低劳动 强度，缩短检验周期，又可以保证检 测结果与国外检测结果的一致性，满 足食品进入国际市场的需要，同时还 可以提高市场准入门槛，促进国内食 品生产企业提高技术水平，最终保障 食品安全。第二，加强酶反应、PCR 技 术和免疫学技术等快速检测方法的研 究，建立一套成熟、简便、可靠的检 验方法，在需要对蜡样芽孢杆菌进行 鉴定到种的情况下，实现蜡样芽孢杆 菌的快速检测。参考文献：1 R.E.布坎南 , N.E.吉本斯.伯 杰细菌鉴定手册 （ 第八版 ）M.北京 :科学出版社 , 1984: 729-751.2 张昕 , 王子军 , 冉陆.2008 年全 国突发公

20、共卫生事件网络报告食物中 毒事件分析 J.疾病监测 , 2010, 25（5）:406-409.3 周帼萍.蜡样芽胞杆菌群微生 物在我国部分食品中的分布及其可能 来源的初步分析 D.武汉 :中国科学 院武汉病毒研究所博士论文 , 2008.4 叶应妩 , 王毓三 , 申子瑜.全国 临床检验操作规程 （3 版 ）M.南京 : 东 南大学出版社 , 2006: 798-801.5 骆艺文 , 郝志凯 , 王印庚 , 等.一株引起刺参“腐皮综合征”的蜡 样芽孢杆菌 J.水产科技情报 , 2009,36（2）: 60-63.6 GB/T 4789.14-2003, 食品卫生 微生物学检验 - 蜡样芽胞

21、杆菌检验 S.7 SN/T 0176-2013,出口食品中 蜡样芽胞杆菌检测方法 S.8 卢勉飞 , 姚华卓 , 腾昆仑 , 等.蜡样芽孢杆菌显色培养基检测效果初 步评价 J.食品科技 , 2013, 38（6）: 313- 317.9 张淑红 , 吴清平 , 张菊梅 , 等.应用显色培养基检测食品中蜡样芽孢 杆菌的初步研究 J.现代预防医学 , 2009, 36（4）: 622-624, 634.10BourqueSN,ValeroJR,Lavoie M C, et al.Comparative analysisof the 16S to 23S ribosomal intergenicsp

22、acer sequences of Bacillus thuringiensisstrains and subspecies and of closely relatedspeciesJ.Appl Environ Microbiol, 1995,61（4）: 1623-1626.11 王振国 , 刘金华 , 肖成蕊 , 等.利用 PCR 技术检测致病性蜡样芽孢杆 菌的研究 J.生物技术 , 2005（5）: 45- 48.12 左庭婷 , 李岩伟 , 韩雪莲 , 等.利用扩增片段长度多态性分析鉴别炭 疽和蜡样芽孢杆菌 J.生物技术通讯 ,2012, 23（4）: 492-495.13 赵宁 ,

23、 吕琦 , 姚丽燕 , 等.原 料乳中蜡样芽孢杆菌的快速检测 J.中 国乳品工业 , 2009, 37（9）: 43-45.14 王振国 , 刘金华 , 徐宝梁 , 等.应用实时荧光 PCR 检测致病性蜡样芽 孢杆菌 J.生物技术通讯 , 2006, 17（1）:40-42.15 齐哲 , 张伟 , 刘卫华 , 等.FTA 滤膜与环介导等温扩增技术结合快速 检测消毒乳中的蜡样芽孢杆菌 J.中国 食品学报 , 2009, 9（3）: 156-161.16张伟伟 ,鲁绯 ,张金兰 ,等.食品中蜡样芽孢杆菌的研究进展 J.中 国酿造 , 2010（5）: 1-4.17杨媛 ,陈庆森 ,吴海清.原 料

24、乳中蜡样芽孢杆菌部分致病基因的 鉴定及毒力评价 J.食品科学 , 2009,30（22）: 236-239.18李煜 ,赵素娟 ,张鹏 ,等.17 株蜡样芽孢杆菌安全性评价 J.毒理学 杂志 , 2012, 26（3）: 233-235.19 胡晓敏 , 蔡亚军 , 周帼萍 , 等.蜡状芽孢杆菌群菌株中部分病原相 关因子的检测 J.微生物学报 , 2007,47（3）: 392-395.20 Microbiology of food and animalfeeding stuffs Horizontal method forthe enumeration of presumptive Baci

25、lluscereus-Colony-count technique at 30,ISO 7932-2004.Nov 2014CHINA FOOD SAFETY 65菌的方法均有报道 16。将分子生物学、免疫学的技术应用于蜡样芽孢杆菌的检测，建立了方便、快捷的技术方法，整个检测过程只需 6h 左右即可完成 13，甚至可以在内完成 15，大幅度缩短了检测时间，降低了成本，同时 PCR 技术、免疫学技术检测方法还具有灵敏度高、特异性强、实验条件简单的优点，易于推广应用。此类检测技术的缺点在于：对检测人员的技术水平要求较高，需熟练掌握分子生物学等相关技术，并且检测结果的稳定性和重现性相对较低，技术还不

26、够成熟，目前暂不适合于通过国家标准等向相关企业和检测机构推广。 PCR 技术的应用，是针对致病性蜡样芽孢杆菌致病相关基因序列设计特异引物，一般基于entFM13、cereolysin AB14、hblA17、bceT17等具有毒力的特异性保守基因，杨媛等从原料乳中检出蜡样芽孢杆菌33株，其中 27 株获得了 hblA 基因引物扩增片段，24 株获得了 bceT 基因引物扩增片段，同时含有两段基因的有20株，而两种毒性基因都不含有的有2株 17，李煜等在 17 株蜡样芽孢杆菌中发现其中有 1 株无溶血活性 18，胡晓敏等报道在 1 株蜡样芽孢杆菌无溶血活性，基因检测发现无肠毒素基因19。由此可见

27、，利用 PCR 技术检测蜡样芽孢杆菌，仅能检测到与特异引物相关的致病性菌株，与特定引物不相关的致病性菌株及不含毒力基因的非致病性菌株则不能被检测到，这也是PCR 技术检测的局限性。4结语对食品中蜡样芽孢杆菌的检测方法进行了归类分析，可以看出每一类方法都存在固有的优点和不足，针对现行国家标准中蜡样芽孢杆菌检测方法费时费力、劳动强度大、检验成本高的特点，提出以下两方面的思考。第一，参照 ISO 中假定蜡样芽孢杆菌的技术方法 20，实现检测标准与国际接轨，只要在甘露醇卵黄多粘菌素琼脂（MYP）平板上出现粉红色、周围有白色沉淀环的典型菌落且该菌落在血平板上出现溶血现象的就可以确定是阳性菌，这样的检测方

28、法既可以省略现行国标中繁琐的证实试验，降低劳动强度，缩短检验周期，又可以保证检测结果与国外检测结果的一致性，满足食品进入国际市场的需要，同时还可以提高市场准入门槛，促进国内食品生产企业提高技术水平，最终保障食品安全。第二，加强酶反应、PCR 技术和免疫学技术等快速检测方法的研究，建立一套成熟、简便、可靠的检验方法，在需要对蜡样芽孢杆菌进行鉴定到种的情况下，实现蜡样芽孢杆菌的快速检测。1 R.E.布坎南 , N.E.吉本斯.伯杰细菌鉴定手册 （ 第八版 ）M.北京 : 科学出版社 , 1984: 729-751.2 张昕 , 王子军 , 冉陆.2008 年全国突发公共卫生事件网络报告食物中毒事件

29、分析 J.疾病监测 , 2010, 25（5）: 406-409.3 周帼萍.蜡样芽胞杆菌群微生物在我国部分食品中的分布及其可能来源的初步分析 D.武汉 :中国科学院武汉病毒研究所博士论文 , 2008.4 叶应妩 , 王毓三 , 申子瑜.全国临床检验操作规程 （3 版 ）M.南京 : 东南大学出版社 , 2006: 798-801.5 骆艺文 , 郝志凯 , 王印庚 , 等.一株引起刺参“腐皮综合征”的蜡样芽孢杆菌 J.水产科技情报 , 2009, 36（2）: 60-63.6 GB/T 4789.14-2003, 食品卫生微生物学检验 - 蜡样芽胞杆菌检验 S.7 SN/T 0176-20

30、13,出口食品中蜡样芽胞杆菌检测方法 S.8 卢勉飞 , 姚华卓 , 腾昆仑 , 等.蜡样芽孢杆菌显色培养基检测效果初步评价 J.食品科技 , 2013, 38（6）: 313-317.9 张淑红 , 吴清平 , 张菊梅 , 等.应用显色培养基检测食品中蜡样芽孢杆菌的初步研究 J.现代预防医学 , 2009, 36（4）: 622-624, 634.10BourqueSN,ValeroJR, Lavoie M C, et al.Comparative analysis of the 16S to 23S ribosomal intergenic spacer sequences of Baci

31、llus thuringiensis strains and subspecies and of closely related speciesJ.Appl Environ Microbiol, 1995, 61（4）: 1623-1626.11 王振国 , 刘金华 , 肖成蕊 , 等.利用 PCR 技术检测致病性蜡样芽孢杆菌的研究 J.生物技术 , 2005（5）: 45-48.12 左庭婷 , 李岩伟 , 韩雪莲 , 等.利用扩增片段长度多态性分析鉴别炭疽和蜡样芽孢杆菌 J.生物技术通讯 , 2012, 23（4）: 492-495.13 赵宁 , 吕琦 , 姚丽燕 , 等.原料乳中蜡样芽孢杆菌的快速检测 J.中国乳品工业 , 2009, 37（9）: 43-45.14 王振国 , 刘金华 , 徐宝梁 , 等.应用实时荧光 PCR 检测致病性蜡样芽孢杆菌 J.生物技术通讯 , 2006, 17（