玉米醇溶蛋白提取工艺研究Word格式.docx

1、Key words :Zein; The ethanol extraction; Alkali mention acid sinking method第一章 前言玉米是全世界产量最高的粮食作物之一，在农业和工业上都有着重要作用，玉米可以用来生产淀粉，副产物主要为玉米醇溶蛋白（Zain），玉米醇溶蛋白占总蛋白量的50%60%之间，玉米醇溶蛋白是由蛋白质组成的混合物，组成玉米醇溶蛋白的蛋白质平均分子量在25000到45000之间，是一种天然高分子材料。近年来，环境问题日益突出，玉米醇溶蛋白由于其环境友好性、可持续生产等诸多优点，在食品和医药行业发挥着重要的作用，玉米醇溶蛋白的提取也成为越来越多科研

2、人员的研究课题，并不断开拓其应用领域。1.1组成 玉米醇溶蛋白，是玉米中的天然高分子蛋白质，包括和两种。Zain可溶于体积分数为95%的乙醇溶液，Zain中的组氨酸、精氨酸、脯氨酸、蛋氨酸含量较少。Zain可溶于体积分数为60%的乙醇溶液，由于Zain性质不稳定，易产生沉淀和凝固，不适于工业生产。所以工业上生产中常用Zain。成品玉米醇溶蛋白中富含谷氨酰胺、亮氨酸、脯氨酸和丙氨酸，但是缺乏一些能带电的极性、酸性和碱性基团氨基酸。水解玉米醇溶蛋白的氨基酸组成见表1。1.2构型玉米醇溶蛋白性质的除了与氨基酸组成有关之外，还与其分子的结构和形状有密切关系。实验证明，玉米醇溶蛋白由分子量在25000到

3、40000之间的蛋白质组成的混合物，分子间用二硫键链接，分子呈棒状或扁长椭球体结构，轴径比为25:1或10:1。玉米醇溶蛋白受肽主链上的羟基与亚氨基的氢键作用，形成-螺旋体，-螺旋体在溶液中显示较强的旋光性，由于-螺旋体的构象符合立体化学结构，所以-螺旋体很稳定。表1 水解玉米醇溶蛋白的氨基酸组成表氨基酸种类含量/g.100g-1蛋氨酸2.4苏氨酸2.7丙氨酸9.8酪氨酸5.1缬氨酸1.9半胱氨酸0.8亮氨酸19.3精氨酸1.6脯氨酸9.0组氨酸异亮氨酸6.2天门冬氨酸1.8苯丙氨酸7.6谷氨酰胺21.4丝氨酸1.0色氨酸0.21.3特性1.3.1成膜性玉米醇溶蛋白易形成薄膜，其中富含含硫氨基

4、酸，这些氨基酸可以形成很强的分子内二硫键，它们和分子间的疏水键一起构成了玉米醇溶蛋白成膜特性的基础。通过“分子梳”法可以观察到，玉米醇溶蛋白呈棒状、哑铃状分叉等结构形态，蜿蜒的棒状结构缠绕形成一张精致的大网，这种网状结构是玉米醇溶蛋白成膜特性的结构基础。当成膜液涂布以后，溶液挥发，薄膜脱水，蛋白质浓度增大，当达到一定得浓度时，分子间形成维持薄膜网状结构的氢键、二硫键和疏水键，从而形成玉米醇溶蛋白膜。其最佳的成膜条件为：乙醇与玉米醇溶蛋白的比例为1:10，乙醇浓度为80%，成膜介质为不锈钢，40下干燥成膜，此外，添加油酸可提高玉米醇溶蛋白膜的抗张强度，添加甘油可以提高它的透明度。1.3.2溶解性

5、玉米醇溶蛋白具有独特的溶解性。玉米醇溶蛋白中不但存在很多的疏水性氨基酸，而且含有较多的含硫氨基酸，但是分子内缺少能带电的极性、酸性和碱性基团氨基酸。这就决定了玉米醇溶蛋白不溶于水，也不溶于无水乙醇，但是它可以溶于60%到90%的乙醇和乙二醇溶液，还可溶于强碱、十二烷基磺酸钠高浓度尿素、丙二醇和醋酸等有机溶剂。在食品和医药领域里，常常采用乙醇做为溶剂。1.3.3其他性质（1）可降解性，玉米醇溶蛋白不溶于水，可被微生物和蛋白酶分解，具有可降解性。（2）肠溶性，成膜后酸性条件下稳定，中性及碱性条件下不稳定，在肠道中溶解，胃中不溶解。（3）可塑性，对于脂肪酸、酯、乙二醇类等可塑剂，可赋予其柔软性、黏着

6、性，增强其热可塑性。（4）具有依存水分的玻璃态，玉米醇溶蛋白膜具有较好的耐热性，使用温度优于普通塑料薄膜，其分解温度在262左右，玻璃化温度为171，用高于玻璃化的温度处理薄膜，可部分修饰薄膜中的缺陷。瓦楞纸。1.4本课题研究背景意义及内容玉米醇溶蛋白目前主要用于食品与医药工业，作为包膜剂及辅料。由于它是用可再生材料制成的，而且是无毒且生物可降解的，符合目前的环保趋势，所以商业价值很高。我国是玉米生产大国，原料丰富，但是我国玉米深加工程度与发达国家相比仍存在很大差距,没有形成玉米醇溶蛋白的规模化生产。 主要原因是玉米醇溶蛋白的生产成本过高。要发挥玉米醇溶蛋白的作用，就必须要克服成本过高的问题。

7、玉米醇溶蛋白的开发应用首先依赖于醇溶蛋白的提取和纯化，找到更高效更经济的提取方法是当务之急。本课题主要研究的内容是如何优化玉米醇溶蛋白的提取过程，选择合适的提取剂，降低玉米醇溶蛋白的提取成本。采用乙醇浸提法和碱提酸沉法，从蛋白粉中提取玉米醇溶蛋白，并从温度、料液比、浸提时间、pH等几个方面考虑其对提取率的影响，根据正交试验结果，确定玉米醇溶蛋白的最佳提取条件。用这种方法提取玉米醇溶蛋白，估计成本在20 25元/kg，随着成本的降低，产量的增加，玉米醇溶蛋白将得到更好的应用，在未来创造越来越多的商业价值。第二章 实验材料与方法2.1材料与仪器2.1.1材料玉米蛋白粉，新疆天达生物工程有限公司产淀

8、粉酶，杰能科酶制剂有限公司产糖化酶，江阴星达生物有限公司产碱性蛋白酶，北京诺维生物有限公司产2.1.2仪器 HHS 型水浴锅，巩义市英峪予华仪器厂产RE52AA 型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂产UV2000 型紫外可见分光光度计，尤尼柯仪器有限公司产JY922D 型粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司产2.2操作方法2.2.1乙醇浸提法提取工艺玉米蛋白粉粉碎（ 过80 目筛） 加入浓度为80%的乙醇溶液（ 料液比1 g /10 mL） 调节温度（ 60 ） 浸提（ 24 h） 离心（ 4 000 r /min） 取上清液冷水稀释乙醇体积分数至40%静置离心（ 4 000 r /min） 洗涤

9、沉淀冷冻干燥粉碎玉米醇溶蛋白。2.2.2碱提酸沉法提取工艺玉米蛋白粉粉碎（ 过80目筛） 加入浓度为80%的乙醇溶液（ 料液比1 g /10 mL） 调节温度（ 60 ） 调节pH 值至12 （ 0.1 mol /L 的NaOH ） 浸提（ 24 h ） 离心 （ 4000 r /min ） 取上清液 调pH 值至6.0 （ 0.1 mol /L的HCl） 静置离心（ 4000 r /min） 洗涤沉淀冷冻干燥粉碎玉米醇溶蛋白。2.2.3玉米醇溶蛋白的沉淀目前常用的沉淀方法也比较多，较为典型的有：用冷水作为沉淀剂的方法；用一定浓度的NaC1水溶液作为沉淀剂的方法；在溶液浊点以下静置提取液以析出

10、醇溶蛋白的方法；将醇溶蛋白提取液浓缩，然后用冷水或盐水进行沉淀。用冷水沉淀以及静置析出的方法，由于最后清液中残存有大量乙醇而导致沉淀不彻底，收率不高。浓缩后用冷水或盐水进行沉淀效果比较好。但用高浓度盐溶液沉淀时会有大量无机离子吸附于蛋白质上而一起沉淀出来，如不反复浸泡冲洗沉淀物，必将使大量无机离子残存于产品中。无机离子的存在会提高醇溶蛋白的亲水性而最终降低产品的耐水性能。因此，醇溶蛋白提取液浓缩后用冷水作沉淀剂能提高产品的性能。在这个工艺中，沉淀剂温度和沉淀剂用量对收率有显著的影响沉淀温度为0，沉淀剂与浓缩提取液比为30：l时，能获得高产率。2.3测定方法用凯氏定氮法测定实验制得的玉米蛋白粉的

11、蛋白含量，取含量最高的样品为标准样品，称取250mg样品于250 mL 容量瓶中用体积分数80% 的乙醇完全溶解并定容，再将该标准溶液用体积分数80% 的乙醇准确配制成浓度为10% 100% 的梯度溶液。在278 nm处测定各梯度溶液的吸光值，制作标准曲线。回归方程为y = 1.8156x+0.0093，r=0.9999。曲线在01g/L 浓度范围内呈良好的线性关系。采用Folin 酚法，测定蛋白质的变性率。称取10 g 玉米蛋白，过80 目筛，放入烧杯中，加入80%的乙醇溶液100 mL，搅拌溶解， 8 500 r /min 离心10 min，静置1 h，取上层清液2 800 r /min离

12、心10 min，取10 mL 上层清液测定分散蛋白质含量，测定3 次取平均值。蛋白质分散指数（ PDI） =水中分散蛋白质/总蛋白质100%蛋白变性率=提取蛋白PDI /标准蛋白PDI玉米醇溶蛋白含量及其提取率的计算：根据回归方程为y = 1.8156x+0.0093，r=0.99992。计算不同条件下提取液中玉米醇溶蛋白的含量，并以此为基础计算提取率。提取液中玉米醇溶蛋白的含量=提取液中玉米醇溶蛋白的含量 提取液的总体积配制标准溶液的蛋白质样品的纯度玉米醇溶蛋白的提取率=提取液中玉米醇溶蛋白的质量/蛋白粉中玉米醇溶蛋白的质量 100%蛋白粉中玉米醇溶蛋白的质量=玉米蛋白粉的质量 蛋白粉中蛋白

13、质的含量65%其中，玉米蛋白粉中醇溶蛋白含量按总蛋白含量的65%计。第三章 实验结果与讨论3.1乙醇浸提法最佳提取条件的确定3.1.1温度对玉米醇溶蛋白提取率的影响称取玉米蛋白粉样品5份，每份5.00 g，加入80%乙醇50.0 mL 作溶剂，在不同水浴中浸提4 h，将浸提液离心分离后取上清液，稀释至一定倍数测其吸光度值，计算提取率，结果见图1。图1 温度对玉米醇溶蛋白提取率的影响由图1可以看出，在30-60时，玉米醇溶蛋白的提取率随着温度的升高逐渐增加，60 时达到最大值79.89%，之后有下降趋势。温度过高提取率反而下降的原因可能是玉米醇溶蛋白在温度过高时会发生部分变性，影响提取率。3.1

14、.2料液比对玉米醇溶蛋白提取率的影响准确称取玉米蛋白粉样品5份，每份5.00g，分别以不同的液料比加入80% 乙醇作溶剂，在60 下水浴浸提4 h，将浸提液离心分离后取上清液，稀释至一定倍数测其吸光度值，计算提取率，结果见图2。 由图2 可以看出，玉米醇溶蛋白的提取率随着料液比中液体比值的增加而增加；液料比为1g/8mL时玉米醇溶蛋白的提取率达最大值81. 26%，之后继续增大料液比中液体比值，提取率下降。图2 料液比对玉米醇溶液提取率的影响3.1.3浸提时间对玉米醇溶蛋白提取率的影响准确称取脱色玉米蛋白粉样品5份，每份5.00 g，加入80%乙醇50.0 mL 作溶剂，在60 水浴浸提不同时

15、间，将浸提液离心分离后取上清液，稀释至一定倍数测其吸光度值，计算提取率，结果见图3。图3 浸提时间对玉米醇溶液提取率的影响由图3可以看出，随着浸提时间的延长，玉米醇溶蛋白提取率不断增加。 在5h内醇溶蛋白提取率升高较快，在5h后提取率有所下降。这表明醇溶蛋白在浸提5h时接近溶解饱和度，此时玉米醇溶蛋白的提取率为78.73%。3.1.4乙醇浓度对玉米醇溶蛋白提取率的影响准确称取玉米蛋白粉样品5份，每份5.00g，分别加入不同浓度的乙醇溶液50.0 mL 作溶剂，在60 水浴中浸提4 h，将浸提液离心分离后取上清液，稀释至一定倍数测其吸光度值，计算提取率，结果见图4。图4 乙醇浓度对玉米醇溶蛋白提

16、取率的影响由图4可以看出，随着乙醇浓度的增大，提取率不断增加。当乙醇浓度达到80%后，玉米醇溶蛋白的提取率有所下降，此时玉米醇溶蛋白的提取率为76.54%。3.1.5乙醇浸提法提取玉米醇溶蛋白的正交试验以温度/（ 因素A），料液比/（gmL -1）（因素B），浸提时间/h（ 因素C），乙醇浓度/%（ 因素D） 为考察对象，对提取率进行测试，结果见表2，表3。由表3可以看出,对蛋白质提取率的影响程度依次为乙醇浓度 提取时间 料液比 温度。乙醇浓度对蛋白提取具有显著的作用。提取蛋白质的最佳工艺条件为：提取温度60 ，料液比1g /8 mL，浸提时间5h，乙醇浓度80%。此时，提取率可达82.21%

17、。表2 乙醇浸提法提取玉米醇溶蛋白的水平因素表水平因素温度A（）料液比B（g.mL-1）浸提时间C（h）乙醇浓度D（%）150647526085803701085表3 乙醇浸提法提取玉米醇溶蛋白的正交试验结果序号提取率76.3576.2976.3076.7076.6576.67783.31975.09K176.3175.6771.33K276.3374.67K375.1176.0083.00R1.560.671.0011.673.2碱提酸沉法最佳提取条件的确定3.2.1温度对玉米醇溶蛋白提取率的影响准确称取玉米蛋白粉样品5 份，每份5.00g，加入80%乙醇，料液比1：10，在不同浸提温度下，

18、水浴浸提4h，将浸提液离心分离，洗涤沉淀，计算提取率，结果见图5。图5 温度对玉米醇溶蛋白提取率的影响由图5可以看出，随着温度的升高，玉米醇溶蛋白的提取率也随之提高，温度为70 时提取率达最大值，之后继续升温，提取率有所下降。这是由于高温导致玉米蛋白变性。3.2.2液料比对玉米醇溶蛋白提取率的影响准确称取玉米蛋白粉样品5份，每份5.00g，分别以不同液料比加入80% 乙醇，在25 水浴中浸提4 h，将浸提液离心分离，洗涤沉淀，计算提取率，结果见图6。由图6可以看出，随着料液比中溶剂比例的提高，玉米醇溶蛋白的提取率也随之上升，当液料比为1g /10 mL 时提取率达最大值，之后继续增大溶剂用量，

19、提取率有所下降。图6 液料比对玉米醇溶蛋白提取率的影响3.2.3pH对玉米醇溶蛋白提取率的影响准确称取玉米蛋白粉样品5份，每份5.00g，分别以不同pH加入80%乙醇（料液比为1g/10mL），在25 水浴中浸提4 h，将浸提液离心分离，洗涤沉淀，计算提取率，结果见图7。图7 pH 对玉米醇溶蛋白提取率的影响由图7可以看出，随着pH 的提高，玉米醇溶蛋白的提取率也随之上升，当pH = 10时提取率达最大值，之后继续增大pH 值，提取率有所下降。3.2.4碱提酸沉法提取玉米醇溶蛋白的正交试验以温度/（因素A），料液比/（gmL-1）（因素B），pH（因素C）为考察对象，对提取率进行测试。正交试验

20、结果见表4，表5表4 碱提酸沉法提取玉米醇溶蛋白的水平因素表pHC12表5 碱提酸沉法提取玉米醇溶蛋白的正交试验结果料液比B（g.mL-1）75.3575.6575.5475.6075.4873.6377.6574.9475.5174.7476.1077.1675.4175.660.131.373.53由表4可以看出，各因素对蛋白质提取率的影响程度依次为pH液料比温度, pH和料液比对蛋白质提取具有显著的作用。最佳工艺条件为：提取温度60，料液比1g/8mL，浸提时间5h，乙醇浓度80%。此时提取率为75.87%。第四章 结 论乙醇浸提法和碱提酸沉法都可以用来提取玉米醇溶蛋白，乙醇浸提法的最佳

21、条件为：提取温度60 ，料液比1g/8mL，浸提时间5h，乙醇浓度80%，提取率为82.21%；碱提酸沉法的最佳条件法为：提取温度60 ，料液比1g/10 mL，浸提时间5h，乙醇浓度80%，提取率为75.87%。提取率相近，但不同的提取方法对玉米醇溶蛋白变性程度影响差异显著，由2.3计算可知碱提酸沉法提取玉米醇溶蛋白的变性率为65.68%，乙醇浸提法提取玉米醇溶的变性率为10.23%，乙醇浸提法变性率低。乙醇浸提法提取玉米醇溶蛋白，不仅节约了原料资源，而且纯度较高，所以在工业生产中，为了提取纯度高、颗粒均匀、分散性好的产品，常采用乙醇浸提法提取玉米醇溶蛋白。参 考 文 献1陈涛,刘耕,李理.

22、玉米醇溶蛋白的特性与应用J.粮食工程,2003,（6）:50-51.2蔡同一,赵文娟.玉米深加工及其综合利用J.食品科学,2000,21（1）:6. 3项恒绪,陈琦,敬思群.玉米醇溶蛋白提取工艺选择与优化J.郑州轻工业学报,2011,26（1）:12.4胡学烟,孙冀平.玉米蛋白粉开发与利用J.粮食与油脂,2001,11:325Kong B H，Xiong Y L.Antixoidant activity of zein hydrolysatesin a Liposome system and the possible mode of actionJ.Food Chem,2006,54（16）:606姚晓敏,孙向军,卢杰.可食性玉米醇溶蛋白的研究J.食品工业科技,2002,23（1）:207 Landry R. Protein D istribu tion in G lu ten Products Isolated DuringandA fterW et-m il ling ofM aize Gra ins J. C ereal C h