绘制吸收光谱及测定摩尔吸光系数Word下载.docx

1、三.实验仪器和试剂1.Agilent8453 UV-Vis分光光度计;2.移液枪（德国BRAND公司生产）;3.50ml容量瓶2支; 废液池（烧杯）一只；4.氨基酸储备液：色氨酸0.400 g/l，苯丙氨酸2.00 g/l;5.去离子水四.实验步骤1.吸收光谱的测定（1） 用氨基酸储备液及去离子水在50ml容量瓶中配置氨基酸溶液，色氨酸浓度为40mg/l, 苯丙氨酸800mg/l；（2） 分别取上述溶液，用1cm石英比色皿，以水作参比溶液，在波长范围为190nm400nm间测定他们的吸收光谱。2.导数光谱：应用软件中的Math下的Derivate功能，设置参数，分别计算出两种氨基酸标准溶液的1

2、阶导数光谱图。五.数据处理1.以为横坐标，A为纵坐标作出吸收光谱2.根据=，先在吸收光谱上找出峰值波长及相应的吸光度，然后计算试液的摩尔浓度，注意浓度换算。3.一阶导数光谱的绘制：对于测量到的一组波长等间隔的吸光度值，可用窗口移动多项式最小二乘拟合求导法获得对应波长的导数值： （1） 式中j为数据序列中的次序（第j个点）；C为卷积系数，为一矢量；N为归一化因子；2m+1为窗口宽度；x为变量的间隔（这里为波长），其上标s为导数的阶数。计算一阶导数时（s=1），常用二次多项式进行拟合。则卷积系数C中第i个元素为：Cii，（i-m,-m+1,m-1,m）。而归一化系数为例如取m = 3（窗口宽度为7

3、）时，C（-3，-2，-1，0，1，2，3），N = 28。这样的参数代入式（1）计算所得，即为一阶导数光谱。 要求对测得光谱计算一阶导数光谱，并作图。图1. 色氨酸和苯丙氨酸的紫外吸收光谱图 如图1，色氨酸在276nm处有最大吸收峰，A=1.23;苯丙氨酸在258nm处有最大吸收峰,A0.72。图2. 色氨酸和苯丙氨酸的一阶导数光谱图六.讨论与思考1比较导数光谱和吸光度光谱的区别，说明导数光谱的作用。2一阶导数光谱的峰值，对应于原光谱的什么位置？原光谱的峰值所得的一阶导数值为多少？3为什么色氨酸的最大吸收波长比丙氨酸大，且摩尔吸光系数也大得多？补充实验：测定苯蒸气的紫外吸收光谱一实验步骤：1

4、取一干燥的1cm石英比色皿，以空气作参比，在波长范围为190nm300nm间扫空白。2加一滴苯在上述比色皿中，快速盖上盖子，待12min后再测定它的吸收光谱。二讨论与思考：1请查阅文献，并指出文献上所提到的苯的吸收峰的波长。2. 为什么苯在这个波长处有吸收峰的出现，即发生了什么跃迁？3. 为什么用紫外分光光度计无法测得苯的精细结构？实验二.氨基酸的荧光激发、发射及同步荧光光谱的测量一. 实验目的学习荧光分析法的基本原理和LS55B发光分析仪的操作。荧光是分子从激发态的最低振动能级回到原来基态时发射的光。利用物质被光照射后产生的荧光辐射对该物质进行定性分析和定量分析的方法，称为荧光分析。在一定光

5、源强度下，若保持激发波长不变，扫描得到的荧光强度与发射波长的关系曲线，称为荧光发射光谱；反之，保持不变，扫描得到的荧光强度与的关系曲线，则称为荧光激发光谱。在一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及所选测量波长等因素有关。酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Try）、苯丙氨酸（Phe）是天然氨基酸中仅有的能发射荧光的组分，可以用荧光分析法测定。它们的激发光谱和发射光谱有互相重叠的现象。同步扫描荧光光谱技术可以简化、窄化光谱，提高选择性。1.LS-55型发光谱仪;色氨酸4mg/l，苯丙氨酸100mg/l;5.去离子水;1打开

6、电脑和光谱仪主机，将仪器预热20分钟左右。设定仪器参数：全波长预扫描参数，用储备液在50ml容量瓶中配置溶液，加水定溶后，使得色氨酸浓度为0.1mg/l, 苯丙氨酸10mg/l；对两种溶液进行预扫描，并记录扫描结果。同时查看其拉曼波长、瑞利散射波长、以及双倍频峰波长。2从预扫描得到激发和发射波长的初步结果（200 600nm），分别对两种氨基酸溶液测量它们的荧光激发、发射和同步荧光光谱。激发光谱参数：扫描波长范围200 - 350nm。（Phe）=287nm， 扫描速度=1000nm/min, Ex-Slit=10nm, Em-slit=5nm,记录信息；（Try）=357nm, 扫描速度=1

7、000nm/min, Ex-Slit=10nm, Em-slit=7.5nm,记录信息。发射光谱参数：扫描波长范围200 - 400nm；ex（Phe）=206nm, 扫描速度=1000 nm/min, Ex-Slit=10nm, Em-slit=5nm,记录信息；ex（Try）=217nm, 扫描速度=1000 nm/min, Ex-Slit=10nm, Em-slit=7.5nm,记录信息记住取文件名。同步荧光光谱：扫描波长范围200-350nm, （-）（Phe）=81nm,扫描速度=1000nm/min, Ex-Slit=10nm, Em-slit=15nm,记录信息； （）（Try）

8、=140nm,扫描速度=1000nm/min, Ex-Slit=10nm, Em-slit=12.5nm。（注意：由于物质的荧光性质受许多条件的影响，以上实验参数仅供参考，具体参数的选择视实际情况而定。）五数据处理1用实验获得的数据绘制两种氨基酸的激发、发射、同步光谱图（如图3、4）。2从激发和发射光谱中找出最大激发波长和最大发射波长值，以及它们相对应的峰高。在它们的同步荧光光谱中也确定最大波长和对应的峰高。图3. 苯丙氨酸荧光谱图苯丙氨酸扫描激发波长在206nm和260nm两处出现最高峰，本实验选择206nm为最大激发波长。此外，激发波长曲线在280300nm处出现了一个十分完美的峰，请注意

9、，此峰为倍频峰，非激发波长峰（由于发射波长固定为287nm，因此激发波长曲线实际在200286nm之间。图4. 色氨酸的荧光光谱图色氨酸扫描激发波长在217nm和277nm处有两个最大峰，本实验选择217nm固定为最大激发波长。六讨论与思考1对待测溶液进行预扫描的有何作用？2观察激发波长的整数倍处荧光发射光谱在有何特点？该波长是否适合于进行定量分析？3同步荧光技术有哪些优点？比较激发、发射和同步荧光光谱中的峰值及对应波长，比较他们的不同，并解释原因。4通过两种氨基酸的化学结构，是否可以不经试验判断其荧光强度的大小次序。 苯丙氨酸 色氨酸5比较紫外分光光度法和荧光分析法的区别和各自的优缺点。注意

10、事项：1实验报告以电子版的形式在交作业专区跟帖子上传。也可书面提交。2实验结束后实验数据放置在网上ftp:/192.168.17.5可自己下载。实验三 红外吸收光谱的测定通过红外吸收光谱的测定，掌握Nicolet FT-IR的使用方法。1本实验用Nicolet FT-IR测定有机物以及高分子的红外吸收光谱。2红外光谱作为“分子的指纹”广泛用于分子结构和物质化学组成的研究。根据分子对红外光吸收后得到谱带频率的位置、强度、形状以及吸收谱带和温度、聚集状态等的关系便可确定分子的空间构型，求出化学键的力常数、键长和键角。从光谱分析的角度看主要是利用特征吸收谱带的频率推断分子中存在某一基团或键，由特征吸

11、收谱带频率的变化推测临近的基团或键，进而确定分子的化学结构，当然也可由特征吸收谱带强度的改变对混合物及化合物进行定量分析。对苯二酚的红外吸收谱图1如上，可以看到在3500cm-1处有个大的吸收峰，这是羟基的吸收峰，3000 cm-1左右是C-H的吸收峰，1500 cm-1是C=C的吸收峰。图1 对苯二酚的红外吸收光谱1.Nicolet FT-IR傅立叶红外光谱仪（美国热点公司）;2.压片机（美国热点公司）;3.多功能反射头（美国热点公司）4.对苯二酚5.聚苯乙烯薄膜；6.自备样品（塑料）;7.KBr固体四.实验内容1.图 16 CO2分子的反对称伸缩振动（分辨率1和4 cm-1） 2260 2

12、280 2300 2320 2340 2360 2380 Wavenumbers （cm-1）Single BeamR枝P枝空气中CO2的测定（1）实验步骤：不放样品的情况下测试空气中的红外吸收谱图，在不扣除背景的情况下在nm下可以看到CO2的红外吸收谱图，在分辨率为4cm-1和1cm-1两种情况下分别测试。（2）分析两种分辨率下的谱图的异同。观察CO2的红外吸收精细结构。2.邻苯二酚的测定（1）压片：将少量邻苯二酚固体加入到KBr粉末中，碾碎并拌匀，用压片机压成薄片。（2）测试：将压好的样品薄片放置在红外光谱仪中，测定样品的红外吸收光谱，需要扣除背景。（3）谱图解析：将测得的谱图在谱图库中查

13、询比对，看看是不是自己测得的物质，并记录匹配度；分析谱图，将各种官能团指出来。3.聚苯乙烯薄膜的测定（1）测试：将聚苯乙烯薄膜放置在红外光谱仪中，测定样品的红外吸收光谱，需要扣除背景。4.自备样品（塑料）的测定（1）红外吸收谱图的测定：测试：将自备塑料样品放置在红外光谱仪中，测定样品的红外吸收光谱，需要扣除背景。谱图解析：将测得的谱图在谱图库中查询比对，看看自己测得的是何种物质，并记录匹配度；（2）反射红外谱图的测定：将自备塑料样品放置在多功能反射头上，仔细小心的旋转压力，测定样品的红外吸收光谱，需要扣除背景。实验报告以电子版的形式在BBS上跟帖上交。实验结束后实验数据放置在网上ftp:实验二

14、 红外吸收光谱的测定2.主意附件：压片机；多功能反射头3.测试样品：对苯二酚（A.R.）；聚苯乙烯薄膜；自备样品（塑料）;4.红外专用KBr固体（2）谱图解析：实验四 反相HPLC分析抗生素一、实验目的1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。2、了解高效液相色谱法在药物分析中的应用。二、实验原理高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成

15、本较低，应用也更为广泛。美罗培南（meropenem）是一种非肠道的注射用的抗生素，对阳性和阴性革兰氏病原体有抗菌作用（化学式见图1）。100时加热分解，得到开环物。采用反相高效液相色谱法，通过设置适宜的色谱条件，可以将原药与开环物的混合物分离并分析。实验过程中有可能会带入一些杂质，因此实验结束后必须清洗柱子。图1 美罗培南的化学分子式三、仪器与试剂1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器，PH计。2、试剂 乙腈（色谱专用），三乙胺（A.R.），浓磷酸（A.R.），美罗培南纯品。四、实验步骤1、色谱条件色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8）柱温：室温流动相：0.3%三乙

16、胺（用磷酸调节pH=5.0）的水溶液和乙腈（体积比1007）。也可以简化用纯水和乙腈（体积比1007）作流动相。检测器：DAD。检测波长：220nm进样体积：20l定量环，实际注射每次可控制在50l。2、流动相的配制0.3%三乙胺溶液：取三乙胺3.0ml于2000ml的大烧杯中，加水900ml，加入1：20稀释的磷酸水溶液约25ml，最后逐滴加入并用PH计调节pH值至5.0，加水稀释至1000ml。在上述溶液中加入72ml乙腈溶液。用5号砂芯漏斗过滤流动相，待用。3、待测溶液的配制（1） 0.5mg/ml美罗培南溶液用分析天平准确称取0.05g美罗培南于50ml小烧杯中，用流动相溶解，转移至1

17、00ml容量瓶中定容。用针式滤器过滤后置于样品瓶中待分析。（2） 开环物溶液取上述美罗培南溶液5ml于试管中，置于沸水浴中加热20分钟，自然冷却。4、色谱测定（1） 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。流量为1.00ml/min。（2） 待仪器稳定后，开始进样。将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液50ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。（3） 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积。并将测试报告打印成htm式，以便直接贴到实验报告中。（4） 实验完毕，

18、清洗系统及色谱柱。依次用乙腈-水（5：95）、乙腈-水（50：50）、纯乙腈作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。五、思考题1. 比较图2和图3可知，在缓冲液作流动相的情况下，实验得出的峰形较好。但为什么实验室尽量不用缓冲溶液作流动相？2. 流动相在使用前为什么要用砂芯漏斗过滤？3. 清洗柱子时，为什么要如上述所述一步步清洗？4. 如果增大流动相中乙腈的比例，有关组分的保留时间有何变化？5. 计算相邻2个色谱峰的分离度，及各自的理论塔板数。图2 缓冲液作流动相得出的色谱图图3 乙腈-水（5：95）作流动相得出的色谱图附：HPLC柱效检测HPLC分析所用的色谱柱在出厂时都有关于其

19、柱效的报告说明，以便购买者对照检验柱子的效能是否符合标准，也是鉴定该柱使用一段时间后其效能是否变化的参考标准之一。下面是Agilent公司关于ZORBAX Eclipse XDB-C8 4.6150mm,5m型号柱的柱效能报告：1测试条件流动相 ：80%甲醇/20%纯水柱压 ：79.3 Bar柱流速 ：1.00ml/min线性流速 ：0.164cm/sec温度 ：室温（常温23）注入体积：5l2柱效测试报告附表1 ZORBAX Eclipse XDB-C8 4.6m型号柱测试条件出峰次序样品组成浓度（g/ml）保留时间（min）1尿嘧啶51.5172苯酚2001.87634-氯硝基苯252.4814甲苯8503.069附图1混合物质分离色谱图（检测波长254nm） 如果要进行柱效检测，可按表1配制几种物质的混合溶液，在相同条件下进行HPLC分离检测，检验柱效。