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1、ngyng）：各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉素5.未培养（piyng）微生物定义（dngy）：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约为99。v研究方法 1模拟自然培养法: 原位培养、培养条件优化、 单细胞操作 2.宏基因组分析法 二、发酵工业菌种分离筛选 菌种选择的总趋势v野生菌变异菌v自然选育代谢控制育种v诱发基因突变基因重组的定向育种 v1.分离的思路v新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。v实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必

2、须重新进行分离纯化。 v有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。设计筛选方案时必须考虑两个要点： 1.选择性 2.灵敏度 2.新种分离与筛选的步骤 样品的采集样品的处理目的菌富集培养分离纯化性能测定 1.样品的采集原则：（1）样品的来源越广泛，获得新种的可能性越大，特别是在一些苛刻的环境如：高温、高压、高盐等极端环境中。（2）了解目标产物的性质和可能目标产物的微生物种类及其生理特征： 微生物在代谢上具有一定的规律，次生代谢在进化上后移，芽孢菌以上才有筛选意义。分离不同种类的微生物时，还要考虑微生物的生理特性。如：要筛选纤维素酶产生菌，要到富含纤维素的土壤中采样，如深林土壤

3、。采样的注意事项1、采样时应尽可能保持相对无菌；2、所采集的样本必须具有某种代表性；3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长2. 样品的处理（1）物理方法： 热处理、膜过滤、离心法（2）化学方法：通过在培养基中加入某些化学成分来增加特定微生物的数量。（3）诱饵法：将一些固体物质，如：石蜡、

4、花粉、蛇皮（sh p）、毛发等，加到待分离的土壤或水中做成诱饵，将期菌落长成后再进行平板分离，可获得某些特殊的微生物种类3.富集培养（piyng）就是给混合菌群提供一些（yxi）有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件，以促使目标菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。方法：（1）控制培养基的营养成分（2）控制培养条件（3）添加抑制剂 添加专一性抑制剂也可达到抑制不需增殖的微生物的目的.如土样悬浮液中加数滴10%酚可抑制霉菌和细菌的生长,而放线菌仍生长;又如添加青霉素,链霉素之类抗生素能抑制细菌的生长. 4.分离纯化 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化

5、。在这步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。5.生产性能的测定一、菌种分离的一般过程:土样的采取土样预处理 富集培养 菌种初筛-菌种复筛-性能鉴定-菌种保藏目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物。二、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。 复筛 复筛是在初筛的基础上进一步鉴定菌株的生产能力的筛选，采用摇瓶培养，一般一个菌株重复35瓶（较优的菌株）培养后的发酵液采用精确的分析方法测定。实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线

6、菌及霉菌采样（造纸厂）80度30分钟处理 以1%CMC（羧甲基纤维素）为唯一碳源、pH10.5的平板上，培养34天，然后再平板上加入1%刚果红染色，Nacl脱色后选择有透明圈的菌落从285个土样中获得62株:26株为组成型，36株为诱导型实验题（或许会有用）：淀粉酶可以通过微生物发酵生产，为了提高酶的产最，请你设计一个实验，利用诱变育种方法，获得产生淀粉酶较多的菌株。写出主要实验步骤。根据诱发突变率低和诱发突变不定向性的特点预期实验结果。（提示：生产菌株在含有淀粉的固体培养基上，随其生长可释放淀粉酶分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈。）1.主要实验（shyn）步骤：将养好的生产菌株分两组

7、。一组用一定（ydng）剂量的诱变剂处理，另一组不处理做对照。制备（zhbi）含淀粉的固体培养基。把诱变组的大量菌株接种于多个（du ）含淀粉的固体培养基上，同时接种对照组，相同条件下培养。比较两组菌株菌落周围透明圈的大小，选出透明圈变大的菌株。预期实验结果：由于诱发突变率低，诱变组中绝大多数菌落周围的透明圈大小与对照组相同。由于诱发突变不定向性，诱变组中极少数菌落周围的透明圈与对照组相比变大或变小2.氨基酸产生菌的筛选 样品 预处理 初筛（除真菌） 在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板（copy 法） 平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸 对应到copy前相应位置，找到目的菌落 u

8、.v线杀死长好的菌落 再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂 培养后 产氨基酸菌落周围有生长圈 目的菌落进行液体培养，对产物进行定量测定 筛选产物含量高的菌株 发酵工业菌株的鉴定： 通常把鉴定微生物技术分为四个不同的水平：（1）细胞的形态和习性水平：例如用经典的的研究方法，观察细胞的形态特征、运动性、酶反应、营养要求和生长条件（2）细胞组分水平：包括细胞组成成分如：细胞壁成分、细胞氨基酸库、脂类、醌类以及光合作用色素等的分析，所用的技术除常规的实验室技术外，还使用红外光谱、气相色谱和质谱分析等技术。（3）蛋白质水平：包括氨基酸序列分析、凝胶电泳和血清学反应等技术（4）基因或核酸水平：包括核酸分子杂

9、交（DNA与DNA 、 DNA 与RNA）、（G+C）含量的测定、遗传信息的转化和转导、16SrRNA或18SrRNA寡核苷酸组分分析、以及DNA或RNA的核苷酸序列分析等。 三发酵工业培养基设计培养基：指用于维持微生物细胞生长繁殖和产物形成的营养物质。二、发酵工业（gngy）培养基的营养成分及来源（一）碳源：1、作用（zuyng）（1）提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源（nngyun）和合成菌体所必需的碳骨架 （2）提供合成（hchng）目的产物所的原料2.常用的碳源：（1）糖类：葡萄糖、淀粉、糖蜜（2）油和脂肪：豆油、菜子油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉籽油等（3）有机酸：乳酸、柠檬酸、乙酸（

10、4）烃和醇类：正烷烃、乙醇（5）生物质：木材、秸秆、草类等3.发酵培养基的选择原则：*（1）必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。*（2）有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。*（3）有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。*（4）有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。*（5）尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。*（6）原料价格低廉，质量稳定，取材容易。*7）所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。（8）有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”的物质。淀粉水解糖的制备第一步：利用淀粉

11、酶将淀粉液化转化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加；（液化）第二步：利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖。（糖化）*3.酸酶结合法：4.淀粉水解糖的制备方法（目的使淀粉变成葡萄糖）：酸解法；酶解法；酸酶结合水解法。5.糖蜜可分为：甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。糖蜜前处理的方法：加酸通风沉淀法；加热加酸沉淀法添加絮凝剂澄清处理法；（1）酸酶法：先将淀粉酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酶将其水解为葡萄糖。 用酸酶法水解淀粉制糖，酸液化速度快，且糖化是由酶来进行的，对液化要求不高，可采用较高的淀粉乳浓度，以提高生产效率。（2）酶酸法：将淀粉先用淀粉酶液化到一定程度，然后用酸水解成葡萄糖。糖蜜预处

12、理的方法 （1） 加酸通风沉淀法 （2） 加热加酸沉淀法（3）添加絮凝剂澄清处理法絮凝剂:聚丙烯酰胺（二）氮源1、无机氮源氨盐、硝酸盐和氨水所以选择合适（hsh）的无机氮源有两层作用（zu （1）满足（mnz）菌体生长 （2）稳定（wndng）和调节发酵过程中的pH2、有机氮源来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。（三）生长调节物质生长调节物质：发酵培养基中某些成分的加入有助于调节产物的形成，这些添加的物质称为生长调节物质。包括生长因子、前提、产物抑制剂和促进剂。1、生长因子：凡是微生

13、物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。2、前体：前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接在微生物生物合成过程中合成到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高的一类化合物。（采用少量多次的流加工艺）如：苯乙酸、甘氨酸、吲哚、氨茴酸等（二）培养基的类型（1）斜面培养基（2）种子培养基（包括摇瓶种子和小罐种子培养基）：（3）发酵培养基发酵培养基是发酵生产中最主要的培养基，它不仅耗用大量的原材料，而且也是决定发酵生产成功与否的重要因素。1）根据菌体自身生长规律和产物合成的特点来设计培养基： 对菌体生长与产物相偶联的发酵

14、类型，充分满足细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的产物。 对于生产氨基酸等含氮的化合物时，它的发酵培养基除供给充足的碳源物质外，还应该添加足够的铵盐或尿素等氮素化合物。2）发酵培养基的各种营养物质的浓度应尽可能高些，这样在同等或相近的转化率条件下有利于提高单位容积发酵罐的利用率，增加经济效益。3）发酵培养基需耗用大量原料，因此，原料来源、原材料的质量以及价格等必须予以重视。（四）培养基的设计与优化：看课本大概了解一下P49四发酵工业的无菌技术一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐灭菌（sterilization）:用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命物质的过程。消毒（disinfection）:

15、用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。除菌（degermation）: 用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。 防腐（antisepsis）: 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖 。1.染菌的不良后果: 1.消耗营养物 2.合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难 3.改变pH 4.分解产物 5.噬菌体破坏极大2.染菌危害的具体分析（1）染菌对不同菌种发酵的影响A细菌v谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。v肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长（shngzhng）和合成代谢产物。B. 霉菌（mj

16、n）vPenG：青霉素水解酶上升（shngshng），PenG迅速破坏，发酵一无所获。v柠檬酸：pH2.0，不易（b y）染菌，主要防止前期染菌。C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都应全部废弃。v青霉素：怕染细短产气杆菌v链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌v四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌怕染青霉菌v肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌怕染噬菌体，易造成连续污染（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响（1） 种子扩大时期染菌:（2）发酵前期染菌：（3）发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 a）

17、抗生素发酵 b）柠檬酸发酵 a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制细菌b. 污染酵母：加入0.0250.035g/L CuSO4抑制酵母；通风加大，加速产酸。柠檬酸发酵c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下降，黄曲霉自溶。 d.青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。（4）发酵后期污染a）染菌量不太多，可继续发酵b）污染严重，则提前放罐6.发酵染菌后的措施发酵过程一旦发生染菌，应根据污染微生物的种类、染菌的时期和杂菌的危害程度等进行挽救和处理，同时也要对有关的设备也要进行相应的处理。（1）种子培养期染菌的处理：一发现种子染菌，该种子不能再接入发酵罐中，应弃之，并对种

18、子罐、管道等进行仔细检查和彻底的灭菌。同时采用备用种子，选择生长正常无染菌的种子接入种子罐。（2）发酵前期染菌的处理：此时培养基的碳、氮源含量还比较高，终止发酵，将培养基加热至规定的温度，重新灭菌后，再接入种子进行灭菌。如此时染菌已造成较大的危害，碳、氮源消耗得比较多，则可放掉一部分的料液，补充新鲜的培养基，重新灭菌后，在接种发酵。（3）发酵中期、后期染菌的处理：可以适当的加入杀菌剂或抗生素以及正常的发酵液，以抑制杂菌的生长，也可采取降低培养温度、降低通风量、停止搅拌等进行处理。若代谢产物已经达到一定值，只要明确是染菌就放罐。染菌后对设备的处理：必须对空罐进行彻底的清洗（qngx），空罐加热灭

19、菌至120以上、30min后才可用。亦可用甲醛熏蒸（xnzhng）或甲醛溶液浸泡12h以上等。杀菌剂的添加（tin ji）：前期无必要，增加（zngji）成本； 发现后加入，效果要具体评价2. 污染原因分析 主要原因：种子带菌 无菌空气带菌 设备渗漏 灭菌不彻底 操作失误 技术管理不善v从污染时间看：早期污染可能与接种操作不当有关；后期污染可能与及中间补料有关。v从杂菌种类看：耐热芽孢杆菌：与有关球菌、无芽孢杆菌：与 有关浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏霉菌：与有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长 v从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所污染

20、的是同一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别罐连续染菌，一般是设备问题。发酵工业的无菌技术灭菌方法1.干热灭菌法 2.湿热灭菌法 3.射线灭菌法 4.化学药剂灭菌法5.过滤除菌法6.火焰灭菌法 热阻：微生物的热阻就是指微生物对热的抵抗能力。对数残留定律：（一）分批灭菌（实罐灭菌） 定义：将配制好的培养基同时放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，通常也称为实罐灭菌。二、连续灭菌1.定义：将配制好的培养基在向发酵罐输送的同时加热、保温和冷却进行灭菌。分批灭菌和连续灭菌的优缺点比较灭菌方式优 点 缺 点连续灭菌1.灭菌温度高，可减少培养基中营养物质的损失；2.操作条

21、件恒定，灭菌质量稳定3.易于实现管道化和自控操作4.避免了反复的加热和冷却，提高了热的利用率；5.发酵设备利用率高。1.对设备的要求高，需另外设置加热、冷却装置；2.操作较麻烦；3.染菌的机会较多；4.不适合于含大量固体物料的灭菌；5.对蒸汽的要求高。分批1.设备要求低，不需另外设置加热、冷却装置；2.操作要求低，适于手动操作；3.适合于小批量生产规模；4.适合于含有大量固体物质的培养基的灭菌。1.培养基的营养物质损失较多，灭菌后培养基的质量下降；2.需进行反复的加热和冷却能耗较高；3.不适合于大规模生产过程的灭菌；4.发酵罐的利用率较低。由表可见，无论在理论上或者在实践上，与间歇灭菌过程相比

22、，连续灭菌的优点十分明显（mngxin）。因此，连续灭菌越来越多地被用培养基的灭菌。 但是出于对设备的考虑，中小型罐还是采用分批灭菌比较好。五、空气除菌：看课本（kbn）了解流程P73空气除菌系统包括：冷却、分离（fnl）油水、加热、 五发酵工业的种子的制备（种子扩大（kud）培养）种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。1.优良种子应具备的条件：（1）.生长活力强，延迟期短；（2）.生理状态稳定；（3）.浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求；（4）.无杂菌

23、污染，保证纯种发酵；（5）适应性强，生产能力稳定种子的制备分为两个阶段：1.实验室种子制备阶段：琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养等或液体摇瓶培养 ）2.生产车间种子制备阶段：种子罐扩大培养 种龄：是指种子的培养时间。接种龄 :种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间接种量：移入的种子液体积和接种后培养液体的体积的比例 影响种子质量的因素（了解p81）1原材料质量2. 培养温度 3. 湿度4. 通气与搅拌 5. 斜面冷藏时间 6. 培养基7.PH六.发酵动力学发酵动力学的概念和研究内容：是研究发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在规律。研究内容

24、：包括了解发酵过程中菌体生长速率、基质消耗速率和产物生成速率的相互关系，环境因素对三者的影响，以及影响其反应速度的条件。比生长速率的定义P87Monod方程（fngchng） 88页 上式中: S限制性基质（j zh）浓度，mol/m3Ks底物（d w）亲和常数（也称半饱和速度常数），表示微生物对底物的亲和力 , mol/m3 ； Ks越大，亲和力越小， 越小。（单一（dny）限制性基质：就是指在培养微生物的营养物中，对微生物的生长起到限制作用的营养物。当SKS时, m ;若继续提高底物浓度,细胞生长速率基本不变当SKS时,此时 mS/ KS,此时细胞的比生长速率与限制性基质浓度成正比,微生物

25、的生长就呈现一级反应特点.此时S， 减速期， 根据发酵时间过程分析，微生物生长与产物合成存在以下三种关系：与生长相关生长偶联型与生长部分相关生长部分偶联型与生长不相关无关联（1）.与生长相关生长偶联型：乙醇发酵产物的生成是微生物细胞主要能量代谢的直接结果，菌体生长速率的变化与产物生成速率的变化相平行。（2）.与生长部分相关生长部分偶联型：柠檬酸、氨基酸发酵产物间接由能量代谢生成，不是底物的直接氧化产物，而是菌体内生物氧化过程的主流产物（与初生代谢紧密关联）。（3）与生长不相关无关联：抗生素发酵产物生成与能量代谢不直接相关，通过细胞进行的独特的生物合成反应而生成。公式：93页公式:94页七.发酵

26、工业中氧的供需呼吸强度（比耗氧速率） QO2 ：单位质量干菌体在单位时间内消耗氧的量。 单位：mmolO2/（kg干菌体h）。耗氧速率（r）：表示单位体积培养液在单位时间内的吸氧量。当溶解氧浓度达某一值后，增加而不变，此时的溶解氧浓度称为呼吸临界氧浓度用表示。 2.提高氧传递的能力：根据气液传质方程式N KLa （C*-CL）看出，影响发酵过程（gung）中传递速率N（或供氧）的主要因素有推动力（C*-CL）和液相溶氧系数KLa。若能改变这两个因素，则能改变N，即改变发酵罐的供氧能力。（一）、影响氧传递（chund）推动力的因素：提高（t go）C*的方法和降低CL的方法：提高C*的方法（fn

27、gf）：影响C*的因素有温度、溶液的性质、氧分压等，即 C*，则T 或营养物质含量或氧分压（即提高罐压或通入纯氧）降低CL：降低CL可通过减少空气流量等方法来达到，但CL不能C临界，否则会影响微生物的呼吸。同时减少空气流量本身会使KLa。（二）、影响KLa（液相体积溶氧系数）的因素、搅拌:搅拌器的设计对N的影响（包括搅拌器的型式、搅拌器相对位置、搅拌转速n和叶径d、档板、搅拌组数对溶氧的影响）。、空气线速度：VS，则KLa。但当VS过大，会发生“过载”现象（或称“气泛”现象）。、空气分布器：空气分布管的形式、喷口直径、管口与罐底距离对溶氧速率有较大的影响。、发酵罐的结构（罐内液注的高度、发酵罐的体积）：通常发酵罐体积大的氧的利用率高；增加发酵液体积会使通风效率降低。、发酵液的理化性质：通常发酵液浓度增大、粘度增大时，KL值降低。3.溶解氧系数的测定方法：亚硫酸盐氧化法；取样极谱法；排气法。4.空气除菌的方法：加热灭菌；电除尘；介质过滤除菌（分为绝对过滤、介质过滤，机制主有惯性碰撞、阻截、布朗运动、重力沉降、和静电吸引等）。影响微生物耗氧的因素（一）微生物本身遗传特征的影响v1、微生物种类不同，其生理特性不同，