染性腹泻样品采集与检测_精品文档_精品文档.ppt

1、诺如病毒感染性腹泻样品采集与检测广东省疾病预防控制中心广东省疾病预防控制中心 （20152015年年1111月月2525日）日）不同类型标本的采集要求不同类型标本的采集要求样品采集、运输和保藏样品采集、运输和保藏诺如病毒检测方法及结果分析诺如病毒检测方法及结果分析主主 要要 内内 容容原则不同类型标本的采样原则不同类型标本的采样原则一、病例v根据初步流行病学根据初步流行病学调查的的结果，尽量采集重点果，尽量采集重点 病例：如首病例：如首发病例病例/指示病例、住院病例、指示病例、住院病例、发病病厨工、重点厨工、重点岗位的病例等的位的病例等的标本；本；v疫情疫情进展展过程中，程中，应选取各取各阶段

2、一定比例的段一定比例的现症病例采集症病例采集标本。本。一、病例v发病病3天内的天内的粪便（最好）便（最好）带便肛拭子或呕吐物便肛拭子或呕吐物标本本v一式两份（致病菌、病毒）一式两份（致病菌、病毒）v病例数病例数20例以下，全部采集例以下，全部采集20例及以上，至少采集例及以上，至少采集20例病例例病例标本本v发病超病超过3天的和已痊愈病例可不采天的和已痊愈病例可不采样v保存条件及登保存条件及登记样本相关信息：姓名、性本相关信息：姓名、性别、年年龄，发病病时间、采集、采集时间等等v附件附件8和附表和附表8-1二、厨工v食源性暴食源性暴发溯源可采集厨工的溯源可采集厨工的粪便（最好）便（最好）或或带

3、便肛拭子便肛拭子标本本v涉疫涉疫单位的厨工人数在位的厨工人数在30人以下，全部采人以下，全部采样；30人及以上，尽量采集接触直接入口食品人及以上，尽量采集接触直接入口食品岗位位 的厨工：如参与蛤、牡蛎、的厨工：如参与蛤、牡蛎、贻贝等等贝壳壳类海海产 品加工，从事沙拉、凉菜、面包品加工，从事沙拉、凉菜、面包/糕点制作，糕点制作，从事餐具清洗消毒及食品分从事餐具清洗消毒及食品分发的厨工以及近期的厨工以及近期出出现过胃胃肠不适症状的厨工，至少采集不适症状的厨工，至少采集30人。人。三、食品和水v由于目前国家没有食品和水中由于目前国家没有食品和水中诺如病毒如病毒检测的的标准方法，食品和水等准方法，食品

4、和水等样本的采本的采 集和集和检测工作根据工作根据实际情况确定。情况确定。v流行病学依据流行病学依据 四、环境样品v可根据疫情可根据疫情调查需要采集各需要采集各类场所所（如厨房、（如厨房、厕所等）的所等）的环境涂抹境涂抹标本。本。原则样品采集、运输和保藏样品采集、运输和保藏（附件（附件8 8）一、采样对象与数量v标本种本种类粪便（最好）便（最好）带便肛拭子和呕吐物便肛拭子和呕吐物特殊情况特殊情况时采集唾液用于人体易感性采集唾液用于人体易感性检测可根据疫情可根据疫情调查需要采集食品、水及各需要采集食品、水及各类场所所（如厨房、（如厨房、厕所等）的所等）的环境涂抹境涂抹样品品v采采样数：病例数数：

5、病例数20例以下，全部采集例以下，全部采集20例及以上，至少采集例及以上，至少采集20例病例例病例标本本二、采集要求v粪便、便、带便肛拭子和呕吐物便肛拭子和呕吐物粪便可用便盒采集便可用便盒采集肛拭子用采肛拭子用采样棉棉签蘸生理蘸生理盐水或病毒保存液、或水或病毒保存液、或PBS液液 后，插入肛后，插入肛门4-5cm（幼儿（幼儿2-3cm）处，轻轻旋旋转擦取擦取 直直肠表面表面带便粘液，置于含病毒保存液的采便粘液，置于含病毒保存液的采样管中。管中。呕吐物可注入呕吐物可注入灭菌容器内菌容器内v采集的最采集的最优时间在在发病后病后48-72小小时内内v采集量采集量3g/3ml左右左右v采采样时，如，如

6、发现手套被手套被污染染应及及时更更换，采，采样容器外部容器外部 被被污染染时需独立包装，以避免需独立包装，以避免样品品间的交叉的交叉污染。染。v样本采集后，立即冷藏保存。本采集后，立即冷藏保存。v唾液唾液 用用灭菌平皿或广口容器留取菌平皿或广口容器留取1ml，或用棉拭子，或用棉拭子 沾两沾两颊黏膜及舌底擦拭留取。黏膜及舌底擦拭留取。v食品食品将残余食物用将残余食物用灭菌菌镊子或匙采取，置于子或匙采取，置于灭菌容器；菌容器；如无残余食物，可用干如无残余食物，可用干净拭子在盛放拭子在盛放过可疑食物可疑食物 的容器内涂擦，然后置于装有的容器内涂擦，然后置于装有2ml生理生理盐水或病毒水或病毒 保存液

7、保存液试管内。管内。由于目前没有由于目前没有标准准检测方法，方法，暂时无法确定采集无法确定采集 量，可根据病毒的最低感染限、所用方法的最低量，可根据病毒的最低感染限、所用方法的最低 检出限和可能的用量出限和可能的用量协商确定。商确定。v水水用干用干净无菌瓶采集疑似被无菌瓶采集疑似被污染的染的饮用水或生活用水或生活 用水。用水。由于目前没有由于目前没有标准准检测方法，方法，暂时无法确定采无法确定采 集量，可根据病毒的最低感染限、所用方法的集量，可根据病毒的最低感染限、所用方法的 最低最低检出限和可能的用量出限和可能的用量协商确定。商确定。v环境涂抹境涂抹标本本可用无菌拭子涂擦，放入病毒保存液或可

8、用无菌拭子涂擦，放入病毒保存液或PBS液液 容器内。容器内。三、标本运送与贮存v标本采集后冷藏于本采集后冷藏于10以下立即送以下立即送检，同，同时附附 样品送品送检表（附表表（附表8-1）。）。v标本在采集交送本在采集交送过程中尽量固定、防止泄漏，程中尽量固定、防止泄漏，如需如需长途运途运输，应放在有密封圈的螺口管中；放在有密封圈的螺口管中；注意防止交叉注意防止交叉污染。染。v如不能尽快开展如不能尽快开展检测，应贮存在存在-20冰箱短冰箱短 期保存。期保存。原则诺如病毒检测方法及结果分析诺如病毒检测方法及结果分析标本处理v粪便便流程如下流程如下图。制成制成10%的便的便悬液后，立即液后，立即检

9、测或置或置-20冰箱冰箱 保存保存备用。用。注意注意:便便悬液如果液如果过浓，可能，可能导致提取的核酸中致提取的核酸中 抑制物抑制物过多，影响核酸多，影响核酸检测结果。果。标本处理（标本处理（10%10%便悬液制备）便悬液制备）0.1ml/0.1g 粪便标本（固体豌豆粒大小）粪便标本（固体豌豆粒大小）900l PBS漩涡振荡器剧烈震荡漩涡振荡器剧烈震荡3次，每次次，每次15s4 5000 rpm离心离心5min或或 3000 rpm离心离心30min室温静止室温静止10min10min10%便悬液上清便悬液上清标本处理v肛拭子和肛拭子和环境涂抹境涂抹标本本经漩漩涡振振荡器震器震荡15秒后，吸上

10、清立即秒后，吸上清立即检测 或置或置-20冰箱保存冰箱保存备用。用。v呕吐物呕吐物置于漩置于漩涡震震荡器充分混匀，器充分混匀，4,5000r/min 离心离心5min，或，或3000r/min离心离心30min，吸上清，吸上清，立即立即检测或置或置-20冰箱保存冰箱保存备用。用。标本检测核酸检测v核酸提取（多种商核酸提取（多种商业试剂，如，如Qiagen、罗氏等）氏等）病毒病毒RNA提取提取试剂（推荐）（推荐）病毒病毒总核酸提取核酸提取试剂进行行PCR实验时，容易受到来自人、，容易受到来自人、细菌等非菌等非 目目标物种基因的影响，物种基因的影响，产生假阳性。生假阳性。核酸提取完成后，尽快放入冰

11、箱，如果核酸提取完成后，尽快放入冰箱，如果3天内天内检测，10以下保存即可，否以下保存即可，否则放入放入-70冰箱保存。冰箱保存。注意尽量不要注意尽量不要让核酸被核酸被环境中、手套上的境中、手套上的细菌、菌、灰灰尘中含有的中含有的RNA酶降解，也不要反复降解，也不要反复冻融。融。核酸检测v荧光逆光逆转录聚合聚合酶链反反应(real-time RT-PCR)诺如病毒核酸如病毒核酸检测的首的首选方法，特异性和敏感方法，特异性和敏感性性较高，出高，出现假阳性的机率也假阳性的机率也远低于低于传统RT-PCR，但受病毒核酸，但受病毒核酸变异影响异影响较RT-PCR大。大。目前国内商目前国内商业化的化的试

12、剂可可检测GI和和GII组病毒，病毒，但但对于于G组病毒的病毒的检测效果效果还不清楚，有些不清楚，有些试剂的的GI组检测效果也相效果也相对较差，因此如果差，因此如果检测结果果为阴性，不能完全排除阴性，不能完全排除该病毒感染。病毒感染。核酸检测v逆逆转录聚合聚合酶链反反应（RT-PCR）国国际上常用上常用检测方法，准确、灵敏方法，准确、灵敏虽敏感性和特异性敏感性和特异性较real-time RT-PCR方法低，方法低，但可以但可以进行病毒基因型的分型行病毒基因型的分型测序研究，序研究，对于流于流行病学具有重要意行病学具有重要意义。注意事注意事项：1.粪便中抑制便中抑制PCR反反应的成分多，可能造

13、成假阴的成分多，可能造成假阴 性，可通性，可通过稀稀释标本降低抑制物本降低抑制物浓度来解决。度来解决。2.由于由于诺如病毒基因如病毒基因变异大，目前异大，目前还没有一没有一对引引物能把所有基因型都物能把所有基因型都检测出来，出来，这也可能造成也可能造成假阴性假阴性结果。果。3.采用套式采用套式PCR方法可方法可进一步提高一步提高检测的灵敏度的灵敏度和特异性，但非常容易造成和特异性，但非常容易造成实验室室污染，因此染，因此操作操作时需做好防需做好防污染措施。染措施。抗原检测酶链免疫法（ELISA）v操作操作简便、便、结果果较稳定。在定。在标本数量多、种本数量多、种类主主要要为粪便的暴便的暴发疫情

14、疫情检测中可考中可考虑使用此方法。使用此方法。v由于病毒抗原制由于病毒抗原制备复复杂，病毒，病毒变异大，只能异大，只能检出出与抗体同源或相近的病毒，因此与抗体同源或相近的病毒，因此对于某些型的病于某些型的病毒可能无法毒可能无法检测到。到。现有有质量量较好的好的试剂盒盒对于于目前引起暴目前引起暴发的主要基因型一般可以的主要基因型一般可以检出。出。v由于由于粪便成分复便成分复杂，影响因素多，可能出，影响因素多，可能出现假阳假阳性，性，应结合合临床症状和流行病学特征分析床症状和流行病学特征分析结果。果。检测结果分析根据既往社区根据既往社区诺如病毒感染如病毒感染监测数据和近年数据和近年诺如如病毒感染暴

15、病毒感染暴发标本本检测情况等，情况等，对暴暴发疫情疫情标本本检测结果提出以下分析供参考，同果提出以下分析供参考，同时需需综合考合考虑疫情疫情现场流行病学流行病学调查结果等情况。果等情况。v粪便便标本：如果在非流行季本：如果在非流行季节，诺如病毒如病毒检出阳出阳性率高于性率高于20%，可能，可能为诺如病毒暴如病毒暴发；在流行季；在流行季节，诺如病毒如病毒检出阳性率高于出阳性率高于40%，可能，可能为诺如如病毒暴病毒暴发。v肛拭子肛拭子标本：如果在非流行季本：如果在非流行季节，诺如病毒如病毒检出出阳性率高于阳性率高于20%，可能，可能为诺如病毒暴如病毒暴发；在流行；在流行季季节，诺如病毒如病毒检出阳性率高于出阳性率高于25%，可能，可能为诺如病毒暴如病毒暴发。v各各类标本如低于上述比例，需考本如低于上述比例，需考虑是否存在其他是否存在其他主要病原体。主要病原体。v当用某一种方法当用某一种方法检测诺如病毒如病毒为阴性，而流行阴性，而流行病学无法排除病学无法排除诺如病毒感染如病毒感染时，建，建议选用另一用另一 种方法种方法检测诺如病毒。如病毒。