微生物的培养Word文档格式.docx

1、其中，糖类是最广泛利用的碳源，其次是醇类、有机酸类和脂类等。在糖类中，单糖胜于双糖和多糖，己糖胜于戊糖，葡萄糖、果糖胜于甘露糖、半乳糖；在多糖中，淀粉明显地优于纤维素或几丁质等纯多糖，纯多糖则优于琼脂等杂多糖和其他聚合物（如木质素）。（二）氮源凡是构成微生物的细胞物质或代谢产物中氮素来源的营养物质称为氮源。2、生理功能主要是提供合成原生质和细胞其他结构的原料，一般不作能源。3、氮源谱（1）氮源谱特点1）微生物的氮源谱大大广于动物或植物的。2）氨基酸自养型和异养型生物：能把非氨基酸类的简单氮源自行合成所需要的一切氨基酸，可称为“氨基酸自养型生物”；反之，凡需要从外界吸收现成的氨基酸作氮源的微生物

2、，则可称“氨基酸异养型生物”。3）无机的氮源物质一般不提供能量，只有极少数的化能自养则细菌如硝化细菌可利用铵态氮和硝态氮作为氮源和能源。4）速效氮源和迟效氮源：含蛋白质的有机氮源称为迟效性氮源；而无机氮源或以蛋白质的各种降解产物形式存在的有机氮源则被称为速效氮源。4）生理碱性、酸性、中性盐一般说来，异养微生物对氮源利用的顺序是：“NcHo”或“NcHox”类优“NH”类，更优于“No”类，而最不易被利用的则是“N”类。（三）能源能源是指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。2、能源谱（1）能作化能自养微生物能源的物质都是一些还原态的无机物质。（2）在提到能源时，很容易看到一种营

3、养物常有一种以上营养要素功能的例子，即除单功能营养物外，还存在双功能、三功能营养物的情况。（四）生长因子一类对微生物正常代谢必不可少且又不能从简单的碳、氮源自行合成的所需极微量的有机物。2、作用：辅酶或酶活化3、种类：维生素、AA、base、FA等。4、生长因子与微生物的关系（1）生长因子自养型微生物：需要外界提供生长因子的微生物，包括多数真菌、放线菌、霉菌。（2）生长因子异养型微生物 其生长需要多种生长因子的微生物，包括乳酸菌、动植物致病菌、原生动物、支原体等。（3）生长因子过量合成微生物 指在其代谢活动中不仅能合成而且可以在自己细胞中大量累积维生素等生长因子的微生物。在实践上将它们作为维生

4、素等的生产菌。5、来源：酵母膏、玉米浆、黄豆饼粉、动植物组织液、麦芽汁等，复合维生素。浓度：（五）无机盐1、种类根据微生物生长所需要的无机盐离子浓度不同，可分为：（1）大量元素：凡是生长所需浓度在10-310-4mol/L范围内的元素，可称为大量元素，包括P、S、K、Mg、Ca、Na和Fe等。（2）微量元素：凡是生长所需浓度在10-610-8mol/L范围内的元素，则称为微量元素，包括Cu、Zn、Mn、Mo、和Co等。2、功能：3、无机元素来源：加入有关化学试剂，其中首选的是K2HPO4及MgSO4除配制精细培养基，一般不加入。（六）水1、生理功能：组成成分；反应介质；物质运输媒体；热的良导体

5、。2、存在状态：游离态（溶媒）和结合态（结构组成）第二节 微生物的营养类型一、微生物营养类型的分类二、微生物的营养类型1、光能自养型（光能无机营养型）微生物2、化能自养（化能无机营养型）微生物3、光能异养型（光能有机营养型）微生物4、化能异养型（化能无机营养型）微生物（1）腐生型：从无生命的有机物获得营养物质。（2）寄生型：必须寄生在活的有机体内，从寄主体内获得营养物质才能生活称为寄生，这类微生物叫寄生微生物。第三节 营养物质进入细胞的方式一、单纯扩散1、概念：单纯扩散又称被动运送，是指细胞膜这层疏水性屏障可通过物理扩散方式让许多小分子、非电离分子尤其是亲脂性的分子被动地通过。2、特点：依靠胞

6、内外溶液浓度差，顺浓度梯度运输，不消耗代谢能，无特异性。水、二氧化碳、氧气、甘油、乙醇等。二、促进扩散促进扩散是在不需要任何能量的情况下，利用细胞膜上的底物特异性载体蛋白在膜的外侧与溶质分子结合。而在膜的内侧释放此溶质而完成物质的输送。借助载体蛋白顺浓度梯度运输，不耗能，有特异性。三、主动运送主动运送是指需要能量和载体蛋白的逆浓度梯度积累营养物质的过程，是微生物吸收营养物质的主要机制。吸收营养物的主要机制。逆浓度梯度运输，耗能，需载体蛋白，有特异性。氨基酸、乳糖等糖类、钠、钙等无机离子。亲和力改变蛋白构象改变耗能四、基团移位基团移位是一种既需要特异性载体蛋白又需耗能、且溶质在运送前后会发生分子

7、结构变化的运送方式。属主动运输，但溶质分子发生化学修饰-定向磷酸化。主要依赖磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和磷酸转移酶系统（PTS）。3 、PTS系统组成（1）热稳载体蛋白（HPr）（2）酶1（3）酶24、基团移位运输糖的过程：（1）热稳载体的激活：PEP+ HPr丙酮酸+P-HPr （E）（2）糖被磷酸化后运入膜内膜外环境中的糖先与外膜表面的Ec结合，再被转运到内膜表面，这时糖在Eb的催化下，被从P-HPr上传来的磷酸激活，并把糖-磷酸释放到细胞内。五、四种运送营养物质方式的比较第四节 培养基 培养基是一种人工配制的适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料，它具备微生物所需的六大营养元素，且

8、其间比例合适。一、选用和设计培养基的原则和方法1、四个原则（1）目的明确：培养什么微生物，获得什么产物，用途（2）营养协调：恰当配比，尤其是C/N比（100/0.5-2）（3）物理化学条件适宜1）pH：a.各大类微生物都有它们合适的生长pH范围；细菌7.08.0，放线菌7.58.5，酵母菌3.86.0，霉菌4.05.8b. 培养基调节能力pH的内源调节：a）采用磷酸缓冲液的方式：b）采用加入CaCO3做“备用碱”的方式。2）渗透压a.概念：当两种浓度不同的溶液同被一个半透性薄膜隔开时，稀溶液中的水分子会透过此膜到浓溶液中去，直到浓溶液产生的机械压力足以使两边的水分子进出达到平衡为止，这时由浓溶

9、液中的溶质所产生的机械压力即为渗透压。b.渗透压对微生物的影响等渗溶液适宜微生物的生长，高渗溶液会使细胞发生质壁分离，而低渗溶液则会使细胞吸水膨胀，对细胞壁脆弱或丧失的各种缺壁细胞（如原生质体、球状体，支原体）来说、在低渗溶液中还会破裂。3）水活度a.概念水活度是指在相同的温度和压力下，体系中溶液的水的蒸汽压与纯水的蒸汽压之比，即：它表示在天然环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水的含量。b.水活度在实际应用中的意义：各种微生物生长繁殖范围的aw值在0.998一0.6之间。在食品保藏中，当aw降低时，微生物死亡或脱水，或处于休眠状态，因此低aw环境能抑制微生物生长，延长食品保藏时间。4）氧化

10、还原势Eh：是度量某氧化还原系统中的还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标，其单位是v（伏）或mv（毫伏）。好氧微生物+0.1v以上；兼性厌氧+0.1v以上行好氧呼吸， +0.1v以下行发酵；厌氧微生物+0.1v以下生长。（4）经济节约以粗代精、以废代好、以简代繁等。2、四种方法（1）生态模拟（2）查阅文献（3）精心设计（4）试验比较二、培养基的种类1、按对培养基成分的了解来分：（1）天然培养基（2）组合培养基（3）半组合培养基2、按培养基外观的物理状态来分：（1）固体培养基（2）半固体培养基（3）液体培养基：（4）脱水培养基：含有除水以外的一切成分的商品培养基。3、按培养基的功能来分：

11、（1）种子培养基：（2）发酵培养基：（3）基础培养基：（4）选择性培养基：1） 加富性选择培养基2）抑制性选择培养基 （5）鉴别性培养基：1）概念：培养基中加入能于某一菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而用肉眼就能使该菌菌落与外形相似的它种菌落相区分的培养基就称鉴别性培养基。2）EMB培养基的成分及作用原理：第四节 培 养 基培养基是指人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合营养料。任何培养基都应具备微生物生长所需要的六大营养要素，且其间的比例是合适的。制作培养基时应尽快配制并立即灭菌，否则就会杂菌丛生，并破坏其固有的成分和性质。绝大多数微生物都可在人工培养基上生长，只有少数

12、称作难养菌的寄生或共生微生物，如类支原体、类立克次氏体和少数寄生真菌等，至今还不能在人工培养基上生长。一、培养基的配制原则（一）目的明确配制培养基首先要明确培养目的，要培养什么微生物？是为了得到菌体还是代谢产物？是用于实验室还是发酵生产？根据不同的目的，配制不同的培养基。培养细菌、放线菌、酵母菌、霉菌所需要的培养基是不同的。在实验室中常用牛肉膏蛋白胨培养基培养异养细菌，培养特殊类型的微生物还需特殊的培养基。自养型微生物有较强的合成能力，所以培养自养型微生物的培养基完全由简单的无机物组成。异养型微生物的合成能力较弱，所以培养基中至少要有一种有机物，通常是葡萄糖。有的异养型微生物需要多种生长因子，

13、因此常采用天然有机物为其提供所需的生长因子。如果为了获得菌体或作种子培养基用，一般来说，培养基的营养成分宜丰富些，特别是氮源含量应高些，以利于微生物的生长与繁殖。如果为了获得代谢产物或用作发酵培养基，则所含氮源宜低些，以使微生物生长不致过旺而有利于代谢产物的积累。在有些代谢产物的生产中还要加入作为它们组成部分的元素或前体物质，如生产维生素B12时要加入钴盐，在金霉素生产中要加入氯化物，生产苄青霉素时要加入其前体物质苯乙酸。（二）营养协调培养基应含有维持微生物最适生长所必须的一切营养物质。但更为重要的是，营养物质的浓度与配比要合适。营养物质浓度过低不能满足其生长的需要；过高又抑制其生长。例如，适

14、量的蔗糖是异养型微生物的良好碳源和能源，但高浓度的蔗糖则抑制微生物生长。金属离子是微生物生长所不可缺少的矿质养分，但浓度过大，特别是重金属离子，反而抑制其生长，甚至产生杀菌作用。各营养物质之间的配比，特别是碳氮比（CN比）直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的积累。CN比一般指培养基中元素碳和元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白的含量之比。不同的微生物要求不同的CN比。如细菌和酵母菌培养基中的CN比约为51，霉菌培养基中的CN比约为10l。在微生物发酵生产中，CN比直接影响发酵产量，如谷氨酸发酵中需要较多的氮作为合成谷氨酸的氮源，若培养基CN比为41，则菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；若培养

15、基CN比为31，则菌体繁殖受抑制，谷氨酸产量增加。此外，还须注意培养基中无机盐的量以及它们之间的平衡；生长因子的添加也要注意比例适当，以保证微生物对各生长因子的平衡吸收。（三）理化适宜微生物的生长与培养基的pH值、氧化还原电位、渗透压等理化因素关系密切。配制培养基应将这些因素控制在适宜的范围内。1. pH值各大类微生物一般都有其生长适宜的pH范围。如细菌为7.08.0，放线菌为7.58.5，酵母菌为3.86.0，霉菌为4.05.8，藻类为6.07.0，原生动物为6.08.0。但对于某一具体的微生物菌种来说，其生长的最适pH范围常会大大突破上述界限，其中一些嗜极菌更为突出。微生物在生长、代谢过程

16、中，会产生改变培养基pH的代谢产物，若不及时控制，就会抑制甚至杀死其自身。因此，在设计此类培养基时，要考虑培养基成分对pH的调节能力。这种通过培养基内在成分所起的调节作用，可称为pH的内源调节。内源调节主要有2种方式：借磷酸缓冲液进行调节：例如调节K2HP04和KH2P04两者浓度比即可获得pH6.47.2间的一系列稳定的pH，当两者为等摩尔浓度比时，溶液的pH值可稳定在6.8。以CaCO3作“备用碱”进行调节：CaCO3在水溶液中溶解度很低，故将它加入至液体或固体培养基中并不会提高培养基的pH，但当微生物生长过程中不断产酸时，却可以溶解CaCO3，从而发挥其调节培养基pH的作用。如果不希望培

17、养基有沉淀，有时可添加NaHCO3。与内源调节相对应的是外源调节，这是一类按实际需要不断从外界流加酸或碱液，以调整培养液pH值的方法。2. 氧化还原电位各种微生物对培养基的氧化还原电位要求不同。一般好氧微生物生长的Eh（氧化还原势）值为 + 0.3+ 0.4 V，厌氧微生物只能生长在+ 0.1 V以下的环境中。好氧微生物必须保证氧的供应，这在大规模发酵生产中尤为重要，需要采用专门的通气措施。厌氧微生物则必须除去氧，因为氧对它们有害。所以，在配制这类微生物的培养基时，常加入适量的还原剂以降低氧化还原电位。常用的还原剂有巯基乙酸、半胱氨酸、硫化钠、抗坏血酸、铁屑等。也可以用其他理化手段除去氧。发酵

18、生产上常采用深层静置发酵法创造厌氧条件。3. 渗透压和水活度多数微生物能忍受渗透压较大幅度的变化。培养基中营养物质的浓度过大，会使渗透压太高，使细胞发生质壁分离，抑制微生物的生长。低渗溶液则使细胞吸水膨胀，易破裂。配制培养基时要注意渗透压的大小，要掌握好营养物质的浓度。常在培养基中加入适量的NaCl以提高渗透压。在实际应用中，常用水活度表示微生物可利用的游离水的含水量。（四）经济节约配制培养基特别是大规模生产用的培养基时还应遵循经济节约的原则，尽量选用价格便宜、来源方便的原料。在保证微生物生长与积累代谢产物需要的前提下，经济节约原则大致有：“以粗代精”、“以野代家”、“以废代好”、“以简代繁”

19、、“以烃代粮”、“以纤代糖”、“以氮代朊”、“以国（产）代进（口）”等方面。培养基的种类繁多。因考虑的角度不同，可将培养基分成以下一些类型：（一）根据所培养微生物的种类作分类根据微生物的种类可分为：细菌、放线菌、酵母菌和霉菌培养基。常用的异养型细菌培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，常用的自养型细菌培养基是无机的合成培养基，常用的放线菌培养基为高氏一号合成培养基，常用的酵母菌培养基为麦芽汁培养基，常用的霉菌培养基为察氏合成培养基。（二） 根据对培养基成分的了解程度作分类1. 天然培养基指一类利用动、植物或微生物体包括用其提取物制成的培养基，这是一类营养成分既复杂又丰富、难以说出其确切化学组成的培养基。

20、例如牛肉膏蛋白胨培养基。天然培养基的优点是营养丰富、种类多样、配制方便、价格低廉；缺点是化学成分不清楚、不稳定。因此，这类培养基只适用于一般实验室中的菌种培养、发酵工业中生产菌种的培养和某些发酵产物的生产等。常见的天然培养基成分有：麦芽汁、肉浸汁、鱼粉、麸皮、玉米粉、花生饼粉、玉米浆及马铃薯等。实验室中常用牛肉膏、蛋白胨及酵母膏等。2. 合成培养基又称组合培养基或综合培养基，是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。例如高氏一号培养基、察氏培养基等。合成培养基的优点是成分精确、重演性高；缺点是价格较贵，配制麻烦，且微生物生长比较一般。因此，通常仅适用于营养、代谢、生理

21、、生化、遗传、育种、菌种鉴定或生物测定等对定量要求较高的研究工作中。3. 半合成培养基又称半组合培养基，指一类主要以化学试剂配制，同时还加有某种或某些天然成分的培养基。例如培养真菌的马铃薯蔗糖培养基等。严格地讲，凡含有未经特殊处理的琼脂的任何合成培养基，实质上都是一种半合成培养基。半合成培养基特点是配制方便，成本低，微生物生长良好。发酵生产和实验室中应用的大多数培养基都属于半合成培养基。（三）根据培养基的物理状态作分类1. 液体培养基呈液体状态的培养基为液体培养基。它广泛用于微生物学实验和生产，在实验室中主要用于微生物的生理、代谢研究和获取大量菌体，在发酵生产中绝大多数发酵都采用液体培养基。2

22、. 固体培养基呈固体状态的培养基都称为固体培养基。固体培养基有加入凝固剂后制成的；有直接用天然固体状物质制成的，如培养真菌用的麸皮、大米、玉米粉和马铃薯块培养基；还有在营养基质上覆上滤纸或滤膜等制成的，如用于分离纤维素分解菌的滤纸条培养基。常用的固体培养基是在液体培养基中加入凝固剂（约2的琼脂或512的明胶），加热至100，然后再冷却并凝固的培养基。常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅胶等。其中，琼脂是最优良的凝固剂。现将琼脂与明胶两种凝固剂的特性列在表4-4中。固体培养基在科学研究和生产实践中具有很多用途，例如用于菌种分离、鉴定、菌落计数、检测杂菌、育种、菌种保藏、抗生素等生物活性物质的效价测定及获

23、取真菌孢子等方面。在食用菌栽培和发酵工业中也常使用固体培养基。表4-4 琼脂与明胶若干特性的比较化学成分营养价值分解性融化温度凝固常用浓度透明度粘着力耐加压灭菌琼脂聚半乳糖的硫酸酯无罕见96401.52%高强明胶蛋白质作氮源极易2520512%弱3. 半固体培养基半固体培养基是指在液体培养基中加入少量凝固剂（如0.20.5的琼脂）而制成的半固体状态的培养基。半固体培养基有许多特殊的用途，如可以通过穿刺培养观察细菌的运动能力，进行厌氧菌的培养及菌种保藏等。4. 脱水培养基又称脱水商品培养基或预制干燥培养基，指含有除水以外的一切成分的商品培养基，使用时只要加入适量水分并加以灭菌即可，是一类既有成分

24、精确又有使用方便等优点的现代化培养基。（四）根据培养基的功能作分类1. 选择性培养基一类根据某微生物的特殊营养要求或其对某些物理、化学因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能，广泛用于菌种筛选等领域。混合菌样中数量很少的某种微生物，如直接采用平板划线或稀释法进行分离，往往因为数量少而无法获得。选择性培养的方法主要有两种，一是利用待分离的微生物对某种营养物的特殊需求而设计的，如：以纤维素为唯一碳源的培养基可用于分离纤维素分解菌；用石蜡油来富集分解石油的微生物；用较浓的糖液来富集酵母菌等；二是利用待分离的微生物对某些物理和化学因素具有抗性而设计的，如分离放线菌时，在培养基

25、中加入数滴10的苯酚，可以抑制霉菌和细菌的生长；在分离酵母菌和霉菌的培养基中，添加青霉素、四环素和链霉素等抗生素可以抑制细菌和放线菌的生长；结晶紫可以抑制革兰氏阳性菌，培养基中加入结晶紫后，能选择性地培养G 菌；7.5NaCl可以抑制大多数细菌，但不抑制葡萄球菌，从而选择培养葡萄球菌；德巴利酵母属中的许多种酵母菌和酱油中的酵母菌能耐高浓度（1820）的食盐，而其他酵母菌只能耐受311浓度的食盐，所以，在培养基中加入1520浓度的食盐，即构成耐食盐酵母菌的选择性培养基。2. 鉴别培养基一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找

26、到目的菌菌落的培养基。最常见的鉴别培养基是伊红美蓝乳糖培养基，即EMB培养基（表4-5）。它在饮用水、牛奶的大肠菌群数等细菌学检查和在E.coli的遗传学研究工作中有着重要的用途。表4-5 EMB培养基成分成分蛋白胨乳糖蔗糖K2HPO4伊红Y美蓝蒸馏水pH含量（g）10520.40.0651 0007.2EMB培养基中的伊红和美蓝两种苯胺染料可抑制G 细菌和一些难培养的G 细菌。在低酸度下，这两种染料会结合并形成沉淀，起着产酸指示剂的作用。因此，试样中多种肠道细菌会在EMB培养基平板上产生易于用肉眼识别的多种特征性菌落，尤其是大肠杆菌，因其能强烈分解乳糖而产生大量混合酸，菌体表面带H，故可染上

27、酸性染料伊红，又因伊红与美蓝结合，故使菌落染上深紫色，且从菌落表面的反射光中还可看到绿色金属闪光，其他几种产酸力弱的肠道菌的菌落也有相应的棕色。属于鉴别培养基的还有：明胶培养基可以检查微生物能否液化明胶；醋酸铅培养基可用来检查微生物能否产生H2S气体等。选择性培养基与鉴别培养基的功能往往结合在同一种培养基中。例如上述EMB培养基既有鉴别不同肠道菌的作用，又有抑制G菌和选择性培养G 菌的作用。3. 种子培养基种子培养基是为了保证在生长中能获得优质孢子或营养细胞的培养基。一般要求氮源、维生素丰富，原料要精。同时应尽量考虑各种营养成分的特性，使pH在培养过程中能稳定在适当的范围内，以有利菌种的正常生长和发育。有时，还需加入使菌种能适应发酵条件的基质。菌种的质量关系到发酵生产的成败，所以种子培养基的质量非常重要。4. 发酵培养基发酵培养基是生产中用于供菌种生长繁殖并积累发酵产品的培养基。一般数量较大，配料较粗。发酵培养基中碳源含量往往高于种子培养基。若产物含氮量高，则应增加氮源。在大规模生产时，原料应来源充足，成本低廉，还应有利于下游的分离提取。