细胞工程实验讲义文档格式.docx

1、灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。取材进行原代培养时常常需要将组织块消化解离形成细胞悬液，传代培养时也需要将贴壁细胞从瓶壁上消化下来，常用的消化液有胰酶（Trypsin）溶液和EDTA溶液，有时也用胶原酶（collagenase）溶液。胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常见有1：125和1：250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。组织培养用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%浓度，配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液

2、，因为这些物质会对胰酶产生抑制作用。EDTA溶液也常用来解离细胞，它的作用机制是破坏细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢固的细胞，还可以用EDTA和胰酶的混合液进行消化。EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶，配制后可过滤除菌，也可高温消毒灭菌。细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基，即指所有用于各种目的的体外培养、保存细胞用的物质，就其本意上讲为人工模拟体内生长的营养环境，使细胞在此环境中有生长和繁殖的能力。它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。细胞培养基其组成成分主要有：水、氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及其他一些入核酸降解物、激素等。大

3、多数培养液中使用酚红作为pH指示剂。红色表示中性pH，黄色代表酸性pH，紫色表示碱性pH。三、实验材料、用品1 材料：无臭氧型紫外灯、微孔滤膜（直径25 cm）：孔径为0.22m、微孔滤膜（直径90 cm）：孔径为0.22 m、过滤器（直径25 cm）。2 药品：70或75酒精、0.1新洁尔灭、煤酚皂溶液（来苏儿水）、0.5过氧乙酸，乳酸、37甲醛、高锰酸钾、NaOH、盐酸、重铬酸钾、浓硫酸（工业）、纯水。3 仪器和器材：眼科剪刀和镊子、长镊子、培养皿、培养瓶、试剂瓶（或盐水瓶）、酒精、酒精灯、棉球、试管架、吸耳球、卷纸，移液枪、枪头、一次性手套、10毫升试管、10毫升离心管、巴氏吸管、5毫升

4、（或10毫升）吸量管、不锈钢过滤器、塑料过滤器、注射器、超净工作台、干燥箱、高压灭菌锅、正压泵。 图1-1 纯水制备系统（左）和高压灭菌锅（右）图1-2 包装用铝饭盒（左）、塑料过滤器（中）和干燥箱（右）四、实验步骤1 指导教师带领参观实验室，介绍常用仪器的操作方法及注意事项。图1-3 单人单面超净工作台（左）和双人单面超净工作台（右）图1-4 CO2供气钢瓶的减压阀及压力表2清洗1）新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡5%稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。2）使用过的玻璃器皿的清洗（1）使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。（2）用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒

5、置自然干燥或烘干。（3）浸酸性洗液过夜。操作者要戴两层乳胶手套，将玻璃器皿沉人酸液中。吸管要捆扎、瓶皿装入尼龙网袋内。酸液的配制：先在耐高温塑料桶中用热水搅拌溶解重铬酸钾，冷却后缓慢加入浓硫酸，用玻棒不停搅拌，防止温度上升过快和出现重铬酸钾结晶。新配制的酸液为棕红色，遇有机溶剂和水分增多时变成绿色，表明失效。表1 酸液的配制组成强度重铬酸钾（克）浓硫酸（mL）蒸馏水（mL）弱液1001000次强液 120200强液63（4）从酸性洗液捞出后自来水冲洗10-15次去除残余酸液，蒸馏水涮洗3次，倒置烘干。（5）包装（牛皮纸或一般纸），小件物品可置于饭盒内，贴好标签。（6）高压（15磅20 min）

6、或干热（170 2 h）灭菌，取出后检查包装是否完好，标签在否。（7）烘干后，贮存备用。3）胶塞的处理 （1）新胶塞应先用清水清洗之后再用0.2NaOH煮沸10-20 min。（2）自来水清洗10次。（3）再用1稀盐酸浸泡30 min。（4）自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次。晾干，高压灭菌。旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装并高压灭菌后，便可使用。3 消毒1）物理消毒法 （1）紫外线消毒 用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。进行室内消毒时，紫外线灯应距地面25米，使各处有006微瓦能量

7、的照射。紫外线消毒时产生臭氧，对身体有害。细胞培养操作之前，先打开超净工作台和房间的紫外灯照射至少30分钟后在关闭，然后再通风30分钟才可入室工作。目前有的实验室采用电子灭菌灯代替紫外灯进行空气消毒。（2）干热灭菌 主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内，加热至160，保温90-120 min。用于RNA提取实验的用品则需180，保温5-8 h。（3）湿热灭菌 此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品（如胶塞）、金属器械、玻璃器皿、某些耐高温的塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液（如Hanks液、PBS-等）。自动高压灭菌锅操作如下：首

8、先查看高压锅内的水是否充足（到锅底水平线处），放入物品盖好盖。按start钮打开电源（参数已经设好，不必改动），开始高压，在温度达80时显示器开始显示温度，当温度达到所需的设定温度时，在显示屏的左下角有一长形的指示灯闪亮，直到高压时间结束后指示灯灭，此时蜂鸣器报警一声。当压力降至0 MPa时，蜂鸣器再报警一声。温度降至80时，蜂鸣器报警10次。显示屏温度指示消失，此时才可打开锅盖。关电源，开高压锅盖，取出已灭菌的物品，烘干。（4） 过滤除菌 用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。如过滤量大的培

9、养用液常用较大型号的金属滤器（直径90 mm、100 mm、142 mm等），配以过滤泵使用。过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器（直径20 mm、25 mm等）。滤膜孔径有0.60 m、0.45 m、0.35 m、0.22 m、0.10m等，以0.22 m除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。微孔滤膜的孔径小而均匀，对微粒的截留能力强；空隙率大，阻力小，滤速快；无介质脱落；不影响药液的pH值；吸附性小；滤膜用后弃去，不会产生交叉污染。主要缺点是易堵塞、易破碎。药液需经粗滤和精滤后才可用微孔滤膜滤过，使用前需做完整性检查，即用无菌空注射器吸一段空气然后加压，能够

10、反弹即为完整。正压式除菌滤器为金属结构，中间垫一种特制的混合纤维素酯微孔滤膜，其过滤速度较快，效果较好，被多数实验室采用。滤过除菌时，常使用0.22微米孔径的滤膜。滤器上下层各有一槽，放置硅胶垫圈，将滤膜压紧固定。滤膜使用时应注意：滤膜薄且光滑，容易移动，安装时膜位置一定要放正。过分干燥的滤膜很脆，在高压或高温干燥时易破裂，因此安装前可先用三蒸水润湿滤膜。为保证过滤效果，在使用时，每次垫两张滤膜，上面一张孔径为0.45微米，下面一张孔径为0.22微米，或两张均为0.22微米。使用无齿玻片镊子夹取滤膜，以防止镊齿弄破滤膜。加大压力时用力应均匀，用后打开滤器对光检查滤膜是否移动和有无破裂。用双层布

11、或纸包好，（小型号的可置于饭盒内），贴好标签，湿热灭菌后37烘干或自然晾干，不能高温烘干。滤膜用后丢弃。若过滤少量液体，可将小型针头滤器安装在注射器上使用。目前许多厂家有一次性针头滤器出售。国产针头滤器易污染。（5）煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。2）化学消毒法 常用的消毒液有如下几种：（1） 70（或75）酒精：超净台里常备70酒精棉球（卫生级酒精），用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。（2） 0.1新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。超净台旁应常备盛有0 .1%新洁尔灭溶液的容器及纱布。（3） 来苏儿水（煤酚皂溶液）：主要用于无菌室桌椅、

12、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷撒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。使用浓度请按瓶上说明。（4） 0.5%过氧乙酸：是强效消毒剂，10 min即可将芽孢菌杀死。用于各种物品的表面消毒，用喷撒和擦拭方式进行。（5） 乳酸蒸气：将乳酸放入坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。将门窗紧闭1-3 d。可将空气中漂浮的微生物杀死。（6） 37%甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。将37甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸气。1-3 d后方可达到消毒空气的目的。（7）甲醛消毒方法：a） 计算房间体积，按10g/m3的比例秤出甲醛。b） 将甲醛倒甲

13、醛发生器或加热盘或烧杯中，并放好加湿用水，必要时还可加入高锰酸钾（2-3g/m3 ）,然后加热（甲醛发生器用蒸汽加热，加热盘或烧杯可用热水盛入其中加热）使其蒸发成气体。c） 灭菌流程：空调器停止运转启动甲醛气体发生器或在加热盘中热甲醛让甲醛气体扩散约30分钟启动空调器让甲醛气体循环约30分钟 停止空调器，房间熏蒸消毒，时间不少于8小时房间排气，用新鲜空气置换约2小时恢复正常运行。当相对湿度在65%以上，温度在2440时，甲醛气体的消毒效果最好。4 试剂的配制1）PBS 8.0g NaCl、0.2gKCl、2.2gNa2HPO4、0.12gKH2PO4溶于1000 mL双蒸水，高压灭菌，4保存。

14、（准备盐水瓶或试剂瓶）2）干粉培养基过滤除菌（先准备好不锈钢过滤器及滤膜，安装后高压灭菌，适度烘干；铝盒4个，三角瓶2个，容量瓶，不锈钢过滤器一套，酒精灯，酒精棉球3瓶，吸耳球3个，吸量管10毫升和5毫升各5根，分装用瓶，血清，超纯水，抗生素）认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。配制方法（1L）：1）在一个尽可能接近总体积的容器中加入大约500mL双蒸水。2）在室温（20到30）的水中加入干粉培养基。3）水洗袋内残留培养基，全部转移到容器内，轻轻搅拌，不要

15、加热。4）完全溶解之后，1袋1L粉状DMEM加3.7g NaHCO3，1mmoLL丙酮酸钠，即0.11g/L，添加双抗。5）用双蒸水定容到1L，搅拌溶解。注意不要过分搅拌。6）通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH值（此步常可省略）培养基在过滤前要保持密封。7）立刻不锈钢过滤器过滤除菌，贴上标签，4保存备用。3）胰蛋白酶-EDTA消化液胰蛋白酶溶液配制：称取胰蛋白酶（1:250）粉末0.25g置烧杯中，溶于100mL PBS，搅拌混匀，置室温4 小时并不断搅拌振荡，过滤除菌。（若配制400 mL则应称取1g胰蛋白酶）EDTA 溶液配制：0.2g EDTA用400mL PBS溶解

16、后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶， 4冰箱保存。胰蛋白酶与EDTA 按1：1混合后分装，4冰箱保存。4）抗生素液双抗（青霉素、链霉素）各1克，溶于100mL纯水，过滤除菌，分装，4冰箱保存。使用前1：100稀释。五、注意事项1、清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗10-15次。因为残存的洗液对细胞粘附有很大影响。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。千万不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。枪头和试管一定要用超声清洗处理后逐个清洗。如没有洗净会影响下一次使用的效果。2、干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。当温度超过100时，不能再打开烤箱门。器皿烤完后，待温度降至

17、100之下才能开烤箱门。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。3、高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。4、牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压。需要长期保存的血清必须储存于-20-80 低温冰箱中。4冰箱中保存时间切勿超过1个月。由于血清结冰时体积会增加约10 %，因此，血清在冻入低温冰箱前，不要装得太满，必须预留一定体积空间，否则易发生污染或玻璃瓶冻裂（其他溶液冻存也是如此）。一般厂商提供的血清为无菌，无需再过滤除菌。如发现血清有悬浮物，则可将血清加入培养液内一起过滤，切勿直接过滤血清。血清解冻需采用逐步解冻法，切勿直接将血清从-20进入37解

18、冻，这样因温度改变太大，容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沉淀的发生。待全部溶解后再分装。5、滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜（有时可在上面加一层定性滤纸），包好，经高压灭菌后才能使用。过滤前可用压进空气的办法测试过滤器是否完好，压进空气时感觉到有较大的阻力，去除压力后针筒会反弹即为完好无损。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜过。压力太大时微孔滤膜可能破裂，或使某些微生物变形而通过滤膜。装滤膜时位置要准确。另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压灭菌之后，再拧紧使用。6、使用化学

19、消毒法时，配制75%酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。来苏儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激和伤害作用。7、培养基过滤器过滤除菌注意事项：（1） 细胞培养用水一般为三蒸水（经石英蒸馏器蒸馏）或超纯水，医药生产上一般为注射用水。（2） 建议尽量选择与所用量相匹配的包装一次使用，因为包装一旦打开，组分可能会变质或因受潮而结团。（3） 溶解干粉培养基时先加入终体积90%95%的培养用水，添加剂加完后再定容。（4） 如需添加的组分较多时，某一组分完全溶

20、解后，再添加另一组分。（5） 待培养基完全溶解后再加入碳酸氢钠，以免产生沉淀。（6） 所有成分完全溶解后，培养基应立即过滤或高压除菌，以免产生沉淀或有微生物污染。（7） 由于除菌过滤后，pH值可能会升高0.1-0.2个单位，因此在过滤前，可将pH调至比所需值低0.1-0.2个单位。（8） 在细胞培养过程中，建议不加或加少量的抗生素，如血清的浓度较低则所加抗生素的量也要相应降低一些。（9） 建议用1N HCl或1N NaOH来调节培养基的pH，因为用碳酸氢钠调pH值对培养液的渗透压影响比较大。8、物品放进饭盒后要贴好标签，还需要用棉布或牛皮纸包好再贴上标签。在标签处包扎好。容器，包括装PBS的玻

21、璃瓶，瓶口要拧松，不能紧，瓶口包扎牛皮纸，灭菌后立刻拧紧瓶盖，然后再取出，冷却后放入冰箱。注意检测标签是否脱落。9、根据每个实验的要求，准备好所需物品，一并放入超净台内。实验器材准备的数量要大于实际使用数，瓶盖要大于瓶数。要配备至少三套器械（一套使用，一套备用，一套清洗灭菌），循环使用。10、玻璃瓶、移液管要封闭包扎使用端，标记手持端。六、思考题1、哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。2、细胞培养常用液体如何配制和灭菌？3、简单介绍动物细胞培养实验室常用仪器的操作方法及注意事项。实验二 鸡胚胎成纤维细胞的原代培养掌握动物细胞的分离、原代培养和换液方法，能独立地进行细胞原代培养操作。细胞培养（C

22、ell culture）是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养（Primary culture）。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。鸡胚胎成纤维细胞（Chick embryonic fibroblasts, CEF）是从9-11天鸡胚中分离的疏松结缔组织

23、的主要细胞，属生长与裂殖迅速的细胞族群，在适当的体外培养条件下，能迅速增长繁殖，并在生长过程中分泌多种生长因子，所以常用来制作饲养层。这些细胞为成纤维状，故称为成纤维细胞。细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。原代培养时，游离期一般为3-4h，5-6h 后绝大部分细胞贴壁，12h 之后即可进入增殖期，细胞增殖较快，当达到一定的密度（60-70 %汇合） 时，生长更为迅速。眼

24、观形成致密的单层细胞，倒置显微镜下观察,细胞透明，贴壁细胞生长良好，呈梭状，有多个突起伸出，含1-2个细胞核，细胞界限清晰。长满时细胞之间无间隙，也没有细胞重叠现象，重新贴壁的成纤维细胞颜色较深，细胞质中有许多黑色小颗粒，死亡的CEF漂浮在培养液中，整个细胞呈黑色、边缘粗糙。1、器材解剖剪、解剖镊、眼科剪（尖头、弯头）、眼科镊（尖头、弯头）、培养皿、试管、吸管、橡皮头、离心管、培养瓶、枪头、不锈钢过滤器等。上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，灭菌、烤干备用、枪头盒。超净台内放置废液盘或烧杯，提前30分钟开紫外灯。此外，还有倒置显微镜、超净工作台、培养箱、CO2供气钢瓶、血细胞计数板、酒精灯、酒

25、精棉球、酒精喷壶、打火机、试管架、记号笔、移液器等。2、试剂无钙、镁磷酸盐缓冲液（PBS）、细胞消化液：胰蛋白酶-EDTA、DMEM液、完全培养基（含血清）、双抗。3、材料9-10日龄的鸡胚。实验进行前，准备好相关器材，无菌室及超净工作台以紫外灯照射灭菌30-60分钟（溶液同时37预热），然后开启通风10分钟后，才开始实验操作。实验用品以75%酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在中央无菌区域酒精灯火焰旁进行。1、取9-10日龄的鸡胚，用酒精消毒，在超净工作台内，小心取出鸡胚，放在无菌培养皿中，除去头尾、四肢及内脏；2、胚体用含双抗PBS冲洗2-3次，切成1-2mm3的小块（尽量剪碎即可）

26、，然后转入容积适量大小的三角瓶内（或培养皿、离心管、烧杯）；3、按每个鸡胚加入大约5mL的胰酶消化液，在室温（或37）下消化10 min，吸管（或枪头）不停吹打；4、加入含小牛血清培养液终止消化，收集细胞悬液，没有消化完全的组织块可再消化一次；5、收集到的细胞悬液经100目过滤筛（或纱布）过滤，1200转离心5 min；离心管用酒精擦拭后拿进超净台，拧开盖子后，管口过火焰两次，倒出上清，保存管口向下蘸一下干的酒精棉球，再保存管口向下过火焰两次；6、细胞沉淀用含10%小牛血清的DMEM培养液重新悬浮；7、以5105个/mL的密度接种到培养瓶中（大约20-30mL细胞液/鸡胚），观察细胞形态（绘图

27、），将瓶盖微松，于37、5% CO2浓度、饱和湿度条件下培养。（指导教师故意打开瓶盖，设一污染对照供观察，学生制备的剩余细胞供下次染色实验用。）8、3-4小时后观察，有部分细胞已经贴壁，由圆形变为梭形（略）。9、细胞培养24小时后，旋紧瓶口，取出观察，观察的重点如下：（1）培养物是否被污染，主要观察培养液颜色的变化及混浊度。如培养液变为黄色且混浊，表示已经被污染。（2）细胞生长状况与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高。（3）培养液若变为桔红色，一般显示细胞生长良好。10、 经过1天的培养后，即可形成单层（图2-3），应及时换液（实验三）。继

28、续培养，直到细胞贴满瓶底后（约共2天）进行传代培养（实验四）。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以75%酒精擦拭无菌操作抬面。图2-1 原代培养的鸡胚胎成纤维细胞，大约70%汇合1、严格无菌操作。 洗手、着装与外科临床要求相同；手指不能触及器材的使用端；一切操作要在酒精灯火焰前方进行，瓶口、吸管使用前要经过火焰消毒；吸管火焰消毒后冷却再使用，细胞悬液混匀、接种时离火焰要远一些，防止烫伤细胞；酒精灯火焰要用打火机点火，不要用火柴，一旦发生着火事故，立即关闭超净台风机，用饭盒、湿布扑灭火焰；吸管吸过培养基、血清等后不要经过火焰消毒，因为吸管中残留的液体会被烧结碳化，损伤细胞；吸管要专管专用，并要勤换；瓶口滴液不能倒流回到瓶内，可用干酒精棉球擦拭，瓶口再经过火焰消毒；2、所有溶液最好37预热，外壁经酒精棉球擦拭后送入超净台内。1、如何进行鸡胚胎成纤维细胞的原代培养。2、原代培养时如何从组织分离细胞?3、绘图展示自己的实验结果、谈谈你的实验感想。实验三：培养细胞的形态观察及活率检测学习观察不同类型的细胞体外培养的形态特征及生长状况，掌握细胞活率