菌种的传代保藏及菌液_精品文档.ppt

1、菌种的传代、保藏菌种的传代、保藏 及菌液制备及菌液制备 标准菌种的概念及其管理标准菌种的概念及其管理标准菌种是指由国家授权机构制备的具有稳定的生物学特性并用妥善方法保藏的菌种。我国的标准菌种统一由中国菌种保藏管理委员会（CCCCMCCCCM）管理，涉及药品微生物检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中心（CMCCCMCC）提供菌种的名称菌种的名称铜绿假单胞菌（）铜绿假单胞菌（）生孢梭菌（）生孢梭菌（）大肠埃希菌（）大肠埃希菌（）金黄色葡萄球菌（）金黄色葡萄球菌（）沙门菌（）沙门菌（）枯草芽孢杆菌（）枯草芽孢杆菌（）白色念珠菌（）白色念珠菌（）黑曲霉（）黑曲霉（）微生物菌种的使用、保存与管理、验证。

2、微生物菌种的使用、保存与管理、验证。一.制定菌种使用保藏管理程序（1）做好菌种的来源登记，确保溯源性清楚.（2）菌种的接收与复活标准菌种的保藏形式我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式包装于熔封的厚玻璃容器中。在这种容器中，微生物通常与赋形剂共存，由于缺乏生长必须的环境条件，一般呈休眠状态。培养基的选择培养基的选择细菌一般用营养琼脂培养基，特别指出的是生孢梭菌用硫乙醇酸盐流体培养基加琼脂制成的培养基进行传代。真菌一般用改良马丁培养基。菌种的传代菌种的传代菌种的复苏菌种的确认菌种的接种菌种的保藏菌种的复苏菌种的复苏中国药典2005版规定，所用标准菌种的传代次数不得超过5代。从菌种保藏中心获得的冷

3、冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代，直至到第3代为工作菌种。严格控制菌种的传代严格控制菌种的传代避免频繁购买菌种及复壮等费时、耗力的工作。避免频繁购买菌种及复壮等费时、耗力的工作。1.1.复溶菌种并转种复溶菌种并转种 按菌种说明书要求复溶所转按菌种说明书要求复溶所转菌种并转接于适当的增菌培养基内（为第一代）菌种并转接于适当的增菌培养基内（为第一代）2.2.鉴定菌种后制甘油冷冻管鉴定菌种后制甘油冷冻管 经菌种特性鉴定后，经菌种特性鉴定后，挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管，保存管（为第二代）同时挑取纯菌落接斜面，保存管（为第

4、二代）同时挑取纯菌落接斜面，工作用菌种（为第三代）工作用菌种（为第三代）3.3.将第二代保存，第三代以适当温度培养后用于将第二代保存，第三代以适当温度培养后用于试验试验4.取1支（第二代）冷冻保存管转种于平板和斜面培养基上，平板上的菌种制成冷冻保存管（第三代）斜面养基适当温度培养后作为工作用菌种（第三代）5.将（第三代）菌种冷冻或低温保存，将生长、转种后的第二代菌种灭菌处理。6.当工作用用菌种代数小于5时，可直接用上代工作用菌种转接下代工作用菌（第三代）可直接转接第四代，直至四代转为五代。菌种菌种保藏标签的规范与要求菌种保藏标签必须规范、清晰，所有保藏保藏标签必须规范、清晰，所有保藏的菌种容器

5、表面均应贴有相应的标签，标的菌种容器表面均应贴有相应的标签，标签必须字迹清晰可见，应注明：签必须字迹清晰可见，应注明：菌种的名称，系列号，传代次数，接种时间等。一旦新一代菌种制备成功，上一代菌种务必处理掉处理过程应记录。严格菌种的质量控制，确保菌种的质量严格菌种的质量控制，确保菌种的质量菌种的质量对检验至关重要，对实验式储备的菌种而言，除了在起始阶段要对菌种进行纯度和属性确认外，还应对每一次传代都进行确认的质量控制系统。因为微生物菌种从上一代传到下一代时，很可能发生污染或变异，因此每次传代中至少要对菌种进行形态学观察和革蓝染色检查，必要时应做菌种鉴定试验，所有被确认受到污染的菌种应及时销毁，不

6、得用于常规实验。菌种处理的注意事项与有关记录菌种处理的注意事项与有关记录菌种是特殊的标准品，在一定条件下，许多种类菌种是特殊的标准品，在一定条件下，许多种类都是病原菌，这就要求处理菌种时有一些有别于都是病原菌，这就要求处理菌种时有一些有别于其他标准品的特殊要求。其他标准品的特殊要求。1.1.根据菌株对人和动物的致病力、毒性流行传染根据菌株对人和动物的致病力、毒性流行传染的危害程度，要实行严密安全的保藏管理。的危害程度，要实行严密安全的保藏管理。2.2.所有的与菌种有关联的事情，例如菌种的接收、所有的与菌种有关联的事情，例如菌种的接收、检查和保藏等都应有专门的微生物分析员处理和检查和保藏等都应有

7、专门的微生物分析员处理和控制，建立进出账目，填写菌种纪录，纪录内容控制，建立进出账目，填写菌种纪录，纪录内容包括：菌种名称、编号、来源、形态特征、培养包括：菌种名称、编号、来源、形态特征、培养特性、特性、生化检定、传代次数、最适培养基和培养条件、保藏方法、储存条件及保存库址等。3.在操作过程中，必须严格遵守实验室安全防护措施规程，采取有效预防措施进行自我保护。4.为了防止菌种污染或将污染传播到别处，其他部门的人员未经允许不得进微生物实验室。所有的意外情况，都必须立即向主管部门报告以便得到及时解决。5相关记录在菌种的使用制备与保藏过程中，应建立菌种制备、保藏和使用的记录格式。菌种的确认菌种的确认

8、一.初步鉴定试验分离培养菌落形态革兰染色菌体染色特性及菌形生化试验检测细菌对各种基质的代谢作用及代谢产物，借以鉴别细菌的种类二二.全面鉴定全面鉴定血清分型血清分型毒素分析毒素分析内毒素和外毒素内毒素和外毒素基因分型基因分型蛋白组分析蛋白组分析自动化仪器分析（生化，酶学，基因序列等）自动化仪器分析（生化，酶学，基因序列等）铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌形态特征：形态特征：GG-杆菌、直或微弯、较细长、散在排列、无杆菌、直或微弯、较细长、散在排列、无芽胞、有荚膜、单端有芽胞、有荚膜、单端有1 13 3根鞭毛。根鞭毛。培养特性：专性需氧，最适温度为培养特性：专性需氧，最适温度为3535，但在，但在4242

9、生生长是铜绿假单胞菌的一个特点。营养无特殊要求，普通长是铜绿假单胞菌的一个特点。营养无特殊要求，普通培养基上均能生长，菌落大小不一，扁平湿润，边缘不培养基上均能生长，菌落大小不一，扁平湿润，边缘不齐，可产生各种水溶性色素，故使培养基变为蓝绿色。齐，可产生各种水溶性色素，故使培养基变为蓝绿色。在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长，常在其表面形成在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长，常在其表面形成菌膜。菌膜。分离培养：十六烷三甲基溴化铵培养基分离培养：十六烷三甲基溴化铵培养基生化反应：氧化酶试验（）（培养物呈粉红色渐变为生化反应：氧化酶试验（）（培养物呈粉红色渐变为紫红色）紫红色）绿脓菌素试验（）（盐酸溶

10、液呈粉红色）绿脓菌素试验（）（盐酸溶液呈粉红色）铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌琼脂平板的形态琼脂平板的形态铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌鞭毛染色形态鞭毛染色形态生孢梭菌生孢梭菌 形态特征：形态特征：GG粗大芽胞杆菌、但在陈旧培养物中菌体粗大芽胞杆菌、但在陈旧培养物中菌体革兰染色为阴性革兰染色为阴性，芽胞正圆形或卵圆形，直径大于菌体，芽胞正圆形或卵圆形，直径大于菌体，位于军体中央或近端，有周身位于军体中央或近端，有周身鞭毛，能运动。鞭毛，能运动。培养特性：专性厌氧，但要求不严格。一般培养时不易培养特性：专性厌氧，但要求不严格。一般培养时不易形成芽孢，在普通营养琼脂培养基形成不规则菌落。在形成芽孢，在普通营养

11、琼脂培养基形成不规则菌落。在硫乙醇酸盐流体培养基加琼脂制成的培养基上形成圆形、硫乙醇酸盐流体培养基加琼脂制成的培养基上形成圆形、光滑、湿润、不透明的菌落。在硫乙醇酸盐流体培养基光滑、湿润、不透明的菌落。在硫乙醇酸盐流体培养基中常在其表面形成菌膜。中常在其表面形成菌膜。大肠埃希菌大肠埃希菌 形态特征：形态特征：GG-直短杆状杆菌、无芽胞、有周身直短杆状杆菌、无芽胞、有周身鞭毛，能鞭毛，能运动。有菌毛。运动。有菌毛。培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养琼脂培养培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养琼脂培养基上生长良好，形成较大的圆形、光滑、湿润、灰白色的基上生长良好，形成较大的圆形、光滑

12、、湿润、灰白色的菌落。在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长。菌落。在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长。分离培养：伊红美兰培养基（分离培养：伊红美兰培养基（EMBEMB平板）平板）生化反应：生化反应：IMViCIMViC试验结果：试验结果：MUGMUG试验结果：荧光：试验结果：荧光：大肠埃希菌大肠埃希菌EMB平板菌落形态平板菌落形态大肠埃希菌大肠埃希菌显微镜下菌体形态显微镜下菌体形态大肠埃希菌大肠埃希菌电镜下菌体形态电镜下菌体形态金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌形态特征：形态特征：GG球菌、呈单个、成双、短链或排球菌、呈单个、成双、短链或排列呈葡萄串样，无列呈葡萄串样，无鞭毛、鞭毛、芽胞。芽胞。培养特性：

13、兼性厌氧，营养要求不高，在普通营培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，在普通营养琼脂培养基上形成较大的圆形、光滑、湿润、养琼脂培养基上形成较大的圆形、光滑、湿润、隆起、边缘整齐、不透明的菌落。菌落因种不同隆起、边缘整齐、不透明的菌落。菌落因种不同而出现不同的色素。在营养肉汤培养基中呈均匀而出现不同的色素。在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长。混浊生长。分离培养：高盐甘露醇培养基分离培养：高盐甘露醇培养基生化反应：生化反应：血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验结果：结果：金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌显微镜下菌体形态显微镜下菌体形态金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌电镜下菌体形电镜下菌体形态态沙门菌沙门菌形态特征：形态

14、特征：GG-直直 杆菌、无芽胞、无荚膜、多具有杆菌、无芽胞、无荚膜、多具有周身周身鞭毛，能运动。有菌毛。鞭毛，能运动。有菌毛。培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养琼脂培养基上可生长，形成圆形、光滑、湿润、琼脂培养基上可生长，形成圆形、光滑、湿润、半透明、边缘整齐的菌落。在营养肉汤培养基中半透明、边缘整齐的菌落。在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长。呈均匀混浊生长。分离培养：分离培养：沙门菌属志贺菌属琼脂(S.S)琼脂培养培养基基生化反应：生化反应：三糖铁琼脂反应：碱三糖铁琼脂反应：碱/酸，葡萄糖产酸，葡萄糖产 气，气，H H2 2S S阳性阳性多价血

15、清凝集试验：阳性多价血清凝集试验：阳性沙门菌沙门菌SS平板菌落形态平板菌落形态沙门菌沙门菌显微镜下菌体形态显微镜下菌体形态沙门菌沙门菌血清凝集试验结果血清凝集试验结果枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 形态特征：形态特征：GG直杆菌、多呈链状排列，有直杆菌、多呈链状排列，有鞭毛、有鞭毛、有芽胞，芽胞，位于菌体中心或次极端，不小于菌体。位于菌体中心或次极端，不小于菌体。培养特性：为需氧或兼性厌氧，营养要求不高，在普通营培养特性：为需氧或兼性厌氧，营养要求不高，在普通营养琼脂培养基上形成较大的圆形或不规则的、表面粗糙、养琼脂培养基上形成较大的圆形或不规则的、表面粗糙、可有皱褶、菌落下面可形成红色色素的灰白色

16、菌落。在营可有皱褶、菌落下面可形成红色色素的灰白色菌落。在营养肉汤培养基中形成菌膜养肉汤培养基中形成菌膜,很少混浊或不混浊。很少混浊或不混浊。分离培养：营养琼脂平板分离培养：营养琼脂平板血琼脂平板血琼脂平板枯草芽孢杆枯草芽孢杆琼脂平板的形态琼脂平板的形态枯草芽孢杆枯草芽孢杆显微镜下菌体形态显微镜下菌体形态真菌的初步鉴定试验真菌的初步鉴定试验标本直接检查标本直接检查显微镜检查显微镜检查真菌的分离培养真菌的分离培养.酵母型菌落：是单细胞真菌的菌落。形态与一般酵母型菌落：是单细胞真菌的菌落。形态与一般细菌菌落相似，但较大些，菌落表面光滑、湿润、细菌菌落相似，但较大些，菌落表面光滑、湿润、边缘整齐，有部分单细胞真菌可在培养基中形成边缘整齐，有部分单细胞真菌可在培养基中形成假菌丝，此菌落称为类酵母型菌落。假菌丝，此菌落称为类酵母型菌落。.霉菌型菌落：是多细胞真菌的菌落。菌落成棉絮霉菌型菌落：是多细胞真菌的菌落。菌落成棉絮状、绒毛状、粉末状，并产生不同的色素。状、绒毛状、粉末状，并产生不同的色素。快速显色鉴别培养法：经快速显色鉴别培养法：经37371 12d2d就能显示结就能显示结果。如白色念珠菌