结核病快速诊断进展.ppt

1、结核病快速诊断进展结核病快速诊断进展国家结核病参比实验室国家结核病参比实验室赵雁林赵雁林Zhaoyanlintb123.org内容内容1.结核病实验室工作在结核病控制中的作用结核病实验室工作在结核病控制中的作用2.为什么要进行为什么要进行EQA3.EQA 培训的重要意义培训的重要意义4.结核病实验室相关的流行病学理论结核病实验室相关的流行病学理论5.痰涂片镜检的操作原理痰涂片镜检的操作原理6.全球结核病快速诊断进展全球结核病快速诊断进展结核病实验室工作在结核病控制结核病实验室工作在结核病控制中的作用中的作用诊断诊断（发现传染源）（发现传染源）治疗治疗（确定治疗方案）（确定治疗方案）疗效评价疗效

2、评价结核病控制策略和措施的评估结核病控制策略和措施的评估Diagnosis of Pulmonary TB Relatedto Numbers of Tubercle Bacilli10102103104105106Poor microscopy(25%)Good microscopy(55%)Culture/PCR(25%)X-ray/clinical only(20%)AFB per ml of sputumSlide Courtesy:Van Deun A,Nov 2003细菌细菌 让人们联想到什么让人们联想到什么?疾病疾病传染性传染性流行性流行性食物腐败食物腐败在目前已知的细菌中有在目

3、前已知的细菌中有1%的细菌可以导致人患的细菌可以导致人患病病在目前已知的细菌中有在目前已知的细菌中有4%的细菌可以导致植物的细菌可以导致植物得病得病 95%已知细菌不具有致病性已知细菌不具有致病性为什么要进行为什么要进行EQA增加人员的责任心增加人员的责任心推行标准化、规范化操作推行标准化、规范化操作确保实验室服务质量的提高确保实验室服务质量的提高生物安全的需要生物安全的需要加强实验室网络、采集信息加强实验室网络、采集信息痰涂片镜检EQA 培训的意义强化EQA的理解，有利于积极推广提高实验室服务质量提高对结核病实验室工作的重视逐步提高结核病防治人员特别是结核病实验室工作人员的地位结核病实验室相

4、关的流行病学理论结核病的发病学和流行冰山理论水库理论病因分析和疗效评价核分枝杆菌在人体中的生活周核分枝杆菌在人体中的生活周期期感染感染感染感染 95%后期表现后期表现-5%病变早期进展病变早期进展-5%例如：例如：HIV,婴幼儿婴幼儿例如：移民例如：移民结核分枝杆菌的生活周期结核分枝杆菌的生活周期感染感染人体内生存人体内生存由肺中排入空气中由肺中排入空气中进入细胞内进入细胞内侵犯人体免疫防御系统侵犯人体免疫防御系统免疫激活和营养限制免疫激活和营养限制免疫病理免疫病理释放调控因子释放调控因子,例如例如 sigma factors释放抗原性蛋白释放抗原性蛋白改变营养需要改变营养需要改变细胞壁改变细

5、胞壁微生物和人类VeryfewmicrobesarealwayspathogenicManymicrobesarepotentiallypathogenicMostmicrobesareneverpathogenicpotentialpathogenisolatedfromordetectedinclinicalsamplesRecognisedsyndromespatientsclinicalconditione.g.septicaemia,endocarditis,osteomyelitismeningitis,UTI,pneumoniapharyngitis我们如何知道特定的病原微生物致

6、病?诊断和有效的治疗不仅依靠分离病原微生物，而且在于建立实验室和病人临床症状的联系如何推测特定病原体可以致病?Kochs推测病原体必须在每一例病例中都出现病原体可以从宿主中分离并且可以在纯培养基中生长当特定的病原体接种到健康机体时特定的疾病会发生病原微生物可以在实验动物中恢复Spectrum of virulencepoliomyelitis in a child0.1-1%ofinfectionsareclinicallyapparentrubella50%ofinfectionsareclinicallyapparentrabies100%ofinfectionsareclinically

7、apparent传染性疾病的冰山理论传染性疾病的冰山理论asymptomatic infectionclassical clinical diseaseless severe disease水库理论水库理论发病发病人数人数死亡死亡人数人数治愈治愈人数人数现有病人数现有病人数痰涂片镜检的操作原理分枝杆菌的发现历史分枝杆菌的发现历史1590 年荷兰杨森父子发明了显微镜年荷兰杨森父子发明了显微镜19世纪末世纪末,显微镜技术、染色技术已应用于显微镜技术、染色技术已应用于微生物检测微生物检测,分枝杆菌的发现条件已成熟分枝杆菌的发现条件已成熟在发现结核菌前在发现结核菌前,科霍已是一位在微生物学科霍已是一位

8、在微生物学方面取得丰硕成果的学者方面取得丰硕成果的学者.Robert Koch 第一个证明细菌可以致病第一个证明细菌可以致病1876传染病的微生物病因学传染病的微生物病因学病因学病因学-疾病的病因疾病的病因建立建立“科学规则科学规则”来确定微生物和疾病的病来确定微生物和疾病的病因和效应关系因和效应关系Kochs 原理原理Koch确定了确定了3个重要疾病的病因个重要疾病的病因1.霍乱霍乱(fecal-oral disease)Vibrio cholerae2.结核病结核病(pulmonary infection)Mycobacterium tuberculosis3.炭疽炭疽(sheep and

9、 cattle)Bacillus anthracis结核病结核病Figure 24.9结核分枝杆菌：棒状抗结核分枝杆菌：棒状抗酸菌酸菌.可以在人与人之可以在人与人之间传播间传播牛型结核杆菌牛型结核杆菌:美国的美国的病例数病例数,不在人不在人与人之间传播与人之间传播鸟胞内分枝杆菌，可以鸟胞内分枝杆菌，可以感染感染 AIDS晚期患者晚期患者光学显微镜的基本原理光学显微镜的基本原理为区分物体不同的两点为区分物体不同的两点,这两点的光学成像必须落这两点的光学成像必须落在视网膜上不同的感光细胞上在视网膜上不同的感光细胞上;显微镜下显微镜下,光线经过显微镜物镜折射成倒立放大的光线经过显微镜物镜折射成倒立放

10、大的实像实像,然后经目镜折射成正立放大的虚像然后经目镜折射成正立放大的虚像;经显微镜放大后经显微镜放大后,人眼就可以区分物体不同的两点人眼就可以区分物体不同的两点,以达到观察微小物体的目的以达到观察微小物体的目的;由于光线衍射的原因由于光线衍射的原因,普通光学显微镜不能区别小普通光学显微镜不能区别小于于0.2微米的物体；微米的物体；分辨率和对比度分辨率和对比度人的肉眼不能看清小于人的肉眼不能看清小于0.1毫米的物体毫米的物体普通光学显微镜不能区别小于普通光学显微镜不能区别小于0.2微米的物体微米的物体电子显微镜不能看清小于电子显微镜不能看清小于0.1纳米的物体纳米的物体电子显微镜下的结核分枝杆

11、菌电子显微镜下的结核分枝杆菌Gram-positiveS.aureusGram-negativeE.coliAcid fast M.tuberculosis 生理条件下细菌的表面往往带有大量负电荷生理条件下细菌的表面往往带有大量负电荷原因：细菌表面带有正负电荷的基团，等电点多在原因：细菌表面带有正负电荷的基团，等电点多在PH以下，因此在中性或碱性条件下细菌的表面往往以下，因此在中性或碱性条件下细菌的表面往往带有大量负电荷带有大量负电荷染色反应染色反应Stains-salts composed of a positive and negative ion,one of which is colo

12、red(chromophore)碱性染料碱性染料 着色基团带正电荷着色基团带正电荷dye+Cl-酸性染料酸性染料 着色基团带正电荷着色基团带正电荷Na+dye-分枝杆菌涂片镜检基本原理分枝杆菌涂片镜检基本原理、待检标本中存在分枝杆菌，即受检者排菌、待检标本中存在分枝杆菌，即受检者排菌、分枝杆菌的特殊结构决定了染色方法：、分枝杆菌的特殊结构决定了染色方法：染色剂染色剂 细菌表面带负电荷细菌表面带负电荷,与碱性复红易于结合与碱性复红易于结合,加热加热 加深分枝杆菌着色程度加深分枝杆菌着色程度脱色脱色 为了易于镜检，应该使抗酸菌以外的所有物质近乎完全脱色为了易于镜检，应该使抗酸菌以外的所有物质近乎完

13、全脱色复染复染 提供一个良好的对比，隐去背景中残留的红色，但不掩盖抗酸菌。而且，复染既提供一个良好的对比，隐去背景中残留的红色，但不掩盖抗酸菌。而且，复染既要使涂片的背景易于镜检时调焦，同时又不能太深以至分散太多注意力要使涂片的背景易于镜检时调焦，同时又不能太深以至分散太多注意力结核菌感染及排出示意图结核菌感染及排出示意图结核病结核病结核病结核病细胞壁细胞壁革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌分枝杆菌分枝杆菌脂质双分子肽聚糖MYCOLATElipid+LPSporinsacyllipidsarabinogalactaLAM细胞膜细胞膜两种主要结构成分两种主要结构成分双层磷脂双层磷脂

14、double layer of phospholipids蛋白质蛋白质proteins1.痰涂片操作程序原理痰涂片操作程序原理2.二甲苯问题二甲苯问题 假阴性假阴性 假阳性假阳性技术错误技术错误 涂片涂片:太薄太薄/太厚、暴露在紫外线下太厚、暴露在紫外线下 标本中的混杂物质标本中的混杂物质 /加热时间过长加热时间过长 /使用污染的木签使用污染的木签 染色染色:染色质量不佳、未热染、染色时染色质量不佳、未热染、染色时 结晶结晶/环境抗酸菌、环境抗酸菌、间太短、脱落、涂片未固定间太短、脱落、涂片未固定 交叉污染交叉污染 脱色脱色:脱色不佳脱色不佳 脱色不佳脱色不佳 复染复染:过染过染 染色不佳染色

15、不佳镜检员镜检员 视力缺陷、仅观察少数视野、视力缺陷、仅观察少数视野、经镜油交叉污染经镜油交叉污染读片错误：读片错误：未经培训未经培训 未经培训未经培训记录记录/报告：报告：记录错误记录错误 记录错误记录错误产生错误结果的常见原因产生错误结果的常见原因细菌感染的诊断病人临床诊断临床诊断血液生化Non-microbiological investigations 影像学标本标本分泌物标本实验室检查是临床诊断的必要环节OUTLINE细菌学诊断显微镜检查术培养免疫学诊断分子生物学诊断GenProbe噬菌体检测方法HPLC其他结核分枝杆菌的细菌学诊断培养培养onplatesorinbrothident

16、ificationbybiochemicalorserologicaltestsonpuregrowthfromsinglecolony显微镜检查脱色复染染色unstainedorstainedwithe.g.Gramstain药敏药敏血清学血清学DNA 方法方法bydiscdiffusionmethods,breakpointsorMICs显微镜检查Gram-染色抗酸染色Ziehl-Neelsen荧光染色Direct,e.g.auramineImmunofluorescence培养SolidmediaAgarplatesForIdentificationForEnumerationSlopesForsafelong-termculture,e.g.Lowenstein-JensenmediaforTBLiquidmedia(broth)Forenrichmentormaximumsensitivity菌种鉴定形态学生长条件生化反应酶抗原分子生物学方法非培养的诊断方法血清学检测分子生物学方法其他（HPLC）什么是分子生物学诊断方法?为什么用分子生物学诊断方法?可得的分子生物学方法?20