基于宏基因组和宏转录组的发酵食品微生物研究进展文档格式.docx

1、随着分子生物学技术的快速发展，发酵食品微生物群落结构研究已不再完全依赖于传统的微生物分离培养技术。测序技术不断更新、测序费用大大降低、测序通量急速扩大，从而可以对群落中所有微生物的DNA 或RNA 进行直接测序来分析微生物种群组成、分布及其动态演替。近年来，主要基于细菌16S rRNA 基因及真菌rRNA 基因间隔区ITS （internal transcribed spacer） 区域高通量测序的微生物多样性分析，不仅省去了传统分离培养法的繁琐，而且为大量不可培养微生物的研究提供了契机，使得在传统发酵食品微生物多样性研究中有了许多新的发现，成为发酵食品微生物研究的主要方法之一。但是，由于方法

2、本身的局限，基于rRNA 基因片段或ITS 区域高通量测序的微生物多样性分析一方面只能依赖于基因库中已知基因序列做出推断，另一方面由于核糖体RNA 基因片段的保守性较高，许多未知微生物往往只能鉴定到所在属，因而只能在门、纲、目、科、属这些级别进行微生物群落进化和种属亲缘关系分析；同时由于缺乏功能基因的具体信息，使进一步深入研究面临瓶颈。相比之下，基因组、宏基因组测序以及转录组、宏转录组测序技术在一定程度上弥补了这些缺陷，使得人们可以更系统深入地研究微生物群落结构及其功能基因，全面分析其组成、变化规律、亲缘进化并挖掘出潜力丰富的功能基因，从而得以进一步揭开发酵食品微生物群落的神秘面纱。1宏基因组

3、与宏转录组1.1 宏基因组宏基因组（Metagenome）一词由Jo Handelsman 等于1998 年研究土壤微生物群落时首次提出。宏基因组技术通过收集环境样品，提取样品微生物（包括全部的可培养与不可培养微生物）的总DNA，构建宏基因组文库，从基因组文库中筛选功能基因或直接进行高通量测序分析，来研究群落中物种多样性及挖掘功能基因。早期的宏基因组研究以从基因组文库中筛选获得功能基因为主要策略，随着高通量测序技术、生物信息学工具以及大数据分析平台的日渐发展，主要基于测序的宏基因组广泛应用在微生物群落研究中，成为空气、土壤、水、植物以及人体（例如皮肤、消化道）等微生物群落研究的强有力工具。例如

4、研究动物性膳食与植物性膳食对人肠道微生物群落快速和可重复性的影响，揭示了动物性膳食引发肠道炎症疾病的机制。借由宏基因组，大量不可培养微生物得以被发现、新的功能基因或新基因簇得以被认知，极大地促进了对微生物群落组成、演替及其互作的认识，同时对于开发具有应用潜力的新基因也具有重要意义。近年来宏基因组开始应用于食品微生物的研究，但是，目前大量文献报道是基于扩增rRNA 基因测序进行的生物多样性分析，而本文则主要侧重于rRNA 基因测序之外的宏基因组和宏转录组分析报道。第二代测序技术依托的高通量测序平台，包括Illumina 公司的Solexa Genoma Analyzer 测序平台、罗氏公司的45

5、4GS FlX 测序平台和ABI 公司的SOLiD 测序平台。这些测序平台可以实现对DNA的高通量快速测序，极大地方便了对某一物种基因组的深度测序，也方便了对微生物群落中所有DNA的分析。基于这些测序平台，宏基因组既可以分析环境中特定基因，基于序列筛选或基于功能筛选分析某种功能基因，并进一步对筛选到的基因进行深度测序；又可以针对环境群落中全部的DNA 进行深度测序，分析该群落中微生物的组成、演替及特定功能基因。但是，宏基因组的局限在于不能揭示特定的时空条件下微生物群落基因的动态表达与调控等问题，这部分的研究有赖于宏转录组。1.2 宏转录组基于RNA 数据分析的转录组学，主要用来揭示特定生理阶段

6、或胁迫下，基因的动态表达与调控以及胁迫响应，分析差异表达基因。宏转录组（metatranscriptome）是指在某个特定条件或特定时空，群落中所有微生物基因转录本的总和，可用于原位衡量微生物群落宏基因组的表达水平，筛选出高表达活性功能基因和微生物。它以微生物群落的总RNA 为研究对象，提取样品总RNA，将mRNA 反转录为cDNA，进而对cDNA 分析来反映特定时空下基因的表达情况。早期转录组研究主要运用微阵列芯片技术，但是设计和构建微阵列芯片费用高而且费时，还不能检测到设计模板之外的基因的表达水平。而测序技术较好地解决了这一困境，它针对转录产物mRNA 进行高通量测序，可全面快速地获取特定

7、样品在某一特定状态下的完整表达信息，普遍应用于差异表达基因分析、功能基因挖掘、低丰度转录本的发现、转录图谱绘制、可变剪接预测等各个方面。近年来基于测序的宏转录组学在各种环境和人体微生物群落研究中得到广泛应用，不仅可以鉴定群落中微生物基因表达水平，比较不同微生物转录表达谱，进而了解群落的演替变化；还可以分析群落中微生物的胁迫响应、研究优势菌群的代谢途径和筛选特定功能的基因。例如，关联人体消化道微生物群落的宏基因组与宏转录组数据，发现虽然有部分口腔优势微生物存在消化道末端，但它们的转录活性很低；不同的个体间，41%的消化道微生物转录本不受其基因组丰度影响，而转录受影响包括表达下调的孢子形成和氨基酸

8、合成通路、以及表达上调的核糖体合成和甲烷生成通路。又如Jiang 等应用宏转录组分析了来自小鼠大肠、奶牛瘤胃、泡菜、深海热井和冻土的微生物群落，确定了参与氨基酸、能量、核苷酸代谢的592 种核心酶的表达，同时也鉴定了微生物的特定代谢途径，如磷酸代谢途径和多聚糖降解途径等。近年来，宏转录组开始应用于发酵食品，用于探索各种微生物在发酵过程中的代谢途径、揭示它们特定的功能和对风味的贡献。2宏基因组与宏转录组在发酵食品微生物群落研究中的应用2.1 奶酪奶酪是一种重要的发酵乳制品，世界各地有多种风味独特的奶酪成品。奶酪的微生物群落是由各种细菌、酵母菌和霉菌等组成，它们相互作用，经一系列生化反应从而形成奶

9、酪独特的感官性能和风味。Wolfe 等人应用宏基因组揭示了三类（natural, bloomy, washed rind）共137 种不同奶酪表皮的微生物群落结构及其在发酵中的功能。他们从中分离培养出24 株优势菌株，包括细菌和真菌，并研究了它们之间的相互作用。首次如此多种类的奶酪微生物被同时研究并揭示出微生物的特殊功能，例如产甲硫氨酸-裂解酶（一种参与奶酪表皮硫化物形成的酶）的菌株。作者通过原位和体外重构重现了奶酪发酵的过程，提供了一种简单的模型来研究奶酪发酵过程中真菌和细菌间的作用机制。Almeida 等则是对从奶酪制品中分离出的142 株细菌，分属于137 个不同的种和67 个属，进行了

10、大规模的基因组和宏基因组测序。通过大规模测序，他们获得了117 个基因组草图，使奶酪中已知细菌的基因组序列增加了一倍，并建立了一个奶酪细菌功能基因组数据库。他们还依据新测序建立的基因组数据库，分析了不同传统奶酪表面上存在的微生物群落结构，观察到一些微生物物种的大量存在，表明一些微生物如静止嗜冷杆菌（Psychrobacter immobilis） 和假单胞菌（ Pseudoalteromonas haloplanktis）虽然最初并没有接种，实际上却是发酵过程中的优势菌种。Escobar-Zepeda 等利用宏基因组学揭示了cotija 奶酪中独特的微生物群落组成。Cotija 奶酪在墨西哥当

11、地独特的地理环境中自然发酵成熟，其独特的感官特性及其安全性由微生物及其代谢产物共同形成。通过高通量测序揭示了微生物的多样性、优势菌群以及代谢潜力，结果表明乳杆菌、明串珠菌和魏斯菌属是3 个主要的优势菌群，另外还有属于31 个门的500 多种细菌和古细菌；致病菌如沙门氏菌、单增李斯特菌、布鲁氏杆菌、分支杆菌均未发现。结果提示Cotija 奶酪与多种风味形成有关的微生物代谢主要涉及支链氨基酸和游离脂肪酸的代谢，同时与细菌素的产生和免疫相关的基因也被发现。这些宏基因组的发现可以解释微生物群落在发酵奶酪感官特性及安全性中的作用，同时也提供了寻找新的酶应用于生物技术的可能。目前奶酪表皮微生物群落的参考基

12、因组序列较为丰富，为宏转录组分析奶酪成熟过程中表皮微生物群落提供了更大的可能性，也持续成为研究的热点。Monnet 等应用宏转录组分析探究奶酪表皮的微生物活动。这款Reblochon 奶酪是由两种乳酸菌（Streptococcus thermophiles 和Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus）、一种陈化细菌（Brevibacterium aurantiacum）和两种酵母（Debaryomyces hansenii 和Geotrichum candidum）参与发酵而成熟。从第5、14、19 和35 天的奶酪表皮提取RNA 测序显示除B. au

13、rantiacum 转录本读数极低外，其他菌种均有检测到。宏转录组数据显示，从第5 天到第35 天G. candidum 是最活跃的，而乳酸菌的转录水平只发生了轻微的变化。作者比较了两株酵母参与乳糖、半乳糖、乳酸、氨基酸以及游离脂肪酸分解代谢相关基因的表达水平，结果显示在成熟过程中氨同化相关基因和半乳糖代谢相关基因下调；在G. Candidum 的转录组数据中，参与氨基酸代谢的基因在14 到35 天上调，而在D. Hansenii 中上调主要发生在第35 天，这表明D. Hansenii 比G.Candidum 晚参与氨基酸的代谢。此外，在第35 天涉及电子传递链的基因表达普遍下调，提示成熟后

14、期较低的细胞活性。De Filippis 等应用宏转录组学分析了不同温度和湿度条件下意大利奶酪成熟过程中微生物群落的演替和相关基因的表达。结果显示，提高奶酪成熟温度会促进蛋白质水解、氨基酸和脂类分解代谢相关基因的表达，并显著加速奶酪的成熟速率。此外温度提升导致的微生物代谢途径变化与奶酪中蛋白质和挥发性有机物的代谢谱变化一致；在奶酪成熟过程中表皮中糖代谢（磷酸戊糖途径和糖酵解）和细胞分裂相关的转录本丰度较高，而在奶酪中心氨基酸和脂类代谢显著上调。这些宏转录组结果对工业生产中通过合理调控温度来调节微生物的代谢从而优化生产效率提高产品质量具有重要指导意义。随着组学技术的成熟和成本的降低，研究者们正试

15、图多种组学数据结合分析来更好地揭示发酵过程中微生物的功能及其相互作用机制，以期获得突破性的研究成果。如Dugat-Bony 等人应用宏基因组、宏转录组和生化分析，研究9 种微生物组成的奶酪表皮在为期四周的成熟过程中的变化。在发酵早期Lactococcus lactis 和Kluyveromyces lactis 快速消耗乳糖产生大量乳酸，随后乳酸被D.hansenii和G.candidum 利用，因为检测到高水平的乳酸脱氢酶转录本。对于蛋白质和脂肪的代谢，大多数的RNA 测序片段匹配到G.candidum 的基因，这表明G.candidum 与酪氨酸和脂肪降解密切相关。在成熟末期，测序数据表明

16、与氨基酸降解相关的转录本源于G. Candidum 和对酸敏感的C. casei 和H. Alvei，这与它们在后期奶酪表皮的生长相对应。结合不同的数据分析，他们获得了奶酪的成熟过程中各种微生物的代谢产物及其可能的相互作用机制；此外，用差异表达分析选择出的一组生物标志物基因，为监控奶酪制作过程提供了有价值的工具。2.2 发酵蔬菜作为一种传统的发酵蔬菜产品，泡菜发酵过程中微生物种类复杂，近年来宏基因组、宏转录组已应用于泡菜发酵过程中微生物群落的研究。Jung 等研究泡菜29 天发酵过程的宏基因组，其中源自宏基因组的16S rRNA 基因数据构建的系统发育树分析表明泡菜中优势菌属为明串珠菌属（Le

17、uconostoc）、乳杆菌属（Lactobacillus）和魏斯氏菌属（Weissella）。在基因功能注释方面，采用宏基因组快速注释技术，揭示了一系列碳水化合物异养乳酸发酵的相关基因，这与检测到发酵产物甘露醇、乳酸、乙酸乙酯、乙醇等相吻合。将宏基因组序列与不同菌属微生物基因组序列比较发现，大部分的宏基因组序列数据与Leuconostoc mesenteroides 和Lactobacillus sakei 的基因序列具有高度相似性，表明泡菜发酵过程中这两种菌很可能发挥了重要作用。宏基因组数据中，令人惊奇的是还发现了大量噬菌体DNA 序列，这表明泡菜发酵过程中许多细菌受到了噬菌体感染。这些结

18、果不仅深入揭示泡菜发酵微生物的功能，也揭示了复杂的微生物群落对发酵过程的影响。宏转录组学在泡菜发酵微生物研究中亦有应用，如Jung 等进而采用测序研究泡菜中六种主要微生物在发酵过程中的宏转录组基因表达图谱。在为期29 天的发酵过程中从五个时间点的取样中提取的总RNA 有97.7% 的基因序列与GenBank 中已知的6 属主要微生物一致。研究结果表明，在前期发酵过程中Leuconostoc （Lc.） Mesenteroides 是最活跃菌株，而在以后的过程中Lactobacillus （Lb.）sakei 和Weissella （W.） Koreensis 基因呈高表达；在第25 天时Lb.

19、 Sakei 的表达急剧下降，可能与乳酸杆菌噬菌体感染有关。大量与碳水化合物运输、水解及乳酸发酵相关的基因表达活跃，呈现出典型的异养乳酸发酵。所有的明串珠菌属都含有甘露醇脱氢酶编码基因（mannitol dehydrogenase，mdh），尤其是Lc. Mesenteroides，它具有3 个mdh 拷贝，2 个在染色体，1 个在质粒，它们具有不同的表达模式。这些结果有助于人们更好地认识各种微生物在泡菜发酵过程中发挥的重要作用。中国各地有丰富多样的传统发酵蔬菜，近年来的研究报道有不少基于rRNA 基因片段或ITS 区测序的微生物多样性分析。如佟婷婷等发现四川老坛泡菜发酵中魏斯氏菌属是启动菌，

20、关键菌是乳杆菌属，同时还有乳球菌属、片球菌属和明串珠菌属等；Chen 等报道甘肃浆水菜除了乳酸菌外，还有子囊菌和担子菌等真菌；Wu 等在东北酸菜特殊风味形成中发现有乳杆菌属、明串菌属、芽孢杆菌、假单胞菌、酵母、念珠菌、展青霉菌等。未来借助宏基因组和宏转录组的深入研究将有利于我们对中国传统发酵蔬菜更多的了解和进一步的开发利用。2.3 发酵普洱普洱熟茶属典型的发酵茶，它区别于普洱生茶是在于经“渥堆”工艺制作而成。“渥堆”是多种微生物参与的以茶叶为基质的固态发酵过程，参与发酵的微生物种群结构对普洱熟茶的品质发挥着至关重要的作用。除了有不少基于分离培养或基于rRNA 基因测序的“渥堆”过程微生物多样性

21、的报道发现黑曲霉等优势菌株，Lyu 等首次应用宏基因组测序研究了普洱茶渥堆发酵过程中微生物的群落结构，结果显示为三个优势的细菌门（变形菌门、放线菌门和厚壁菌门）和一个处于主导地位的真菌门即子囊菌门；功能基因注释表明与萜类及酮类化合物的代谢以及其他次生代谢产物的合成相关的69种酶基因分布于16 个代谢途径中。这些宏基因组数据表明普洱茶发酵的主要微生物包含细菌和酵母，功能基因的挖掘和代谢途径的分析有利于在分子水平上对普洱茶发酵机理的进一步研究。姜姝等对普洱茶发酵前期和中期的样本提取微生物菌群总mRNA，进行了宏转录组对比分析。测序结果注释表明黑曲霉（Aspergillus niger）在发酵前期和

22、中期两个阶段都占有绝对优势；对两个样本差异表达部分GO 功能和KEGG 通路的对比分析表明，适应渥堆发酵环境变化的微生物（如黑曲霉等）对普洱茶发酵过程起到了决定性的作用。2.4 发酵可可豆可可豆是生产巧克力的重要原材料，采收后的可可豆经发酵、干燥和焙烤形成巧克力特有的风味和口感，其中发酵阶段主要是酵母菌、乳酸菌、醋酸菌参与的将糖转化为酸的一系列生化过程。近年来已有采用宏基因组学对可可豆发酵过程中微生物群落结构及功能的研究，Illeghems 等于2012 年首次报导了基于宏基因组学数据的可可豆发酵过程中微生物群落分析，相对于仅依赖于个别基因序列的分析，宏基因组数据揭示了更丰富的微生物多样性。此

23、次发现的细菌和真菌的种类比之前要多，优势菌株包括Hanseniaspora uvarum, Hanseniaspora opuntiae, Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus fermentum, 和Acetobacter pasteurianus；病毒主要是Myoviridae 和Siphoviridae，且乳杆菌是它们的主要宿主。随后Illeghems 等基于宏基因组数据构建的多通路分析拓展了人们对可可豆发酵过程中主要微生物功能特性的认知，揭示了群落微生物间的代谢通路的分布。其中与乳酸菌代谢关系最密切的是乳酸发酵和柠檬酸同化途径；而肠杆菌（Ent

24、erobacteriaceae）通过混合酸发酵和丙酮醛解毒途径参与底物转化，此外，肠杆菌还有降解果胶和同化柠檬酸的潜在功能。基于宏基因组数据重构了醋酸菌的部分代谢途径，尤其是胁迫应激响应，在酸胁迫下醋酸菌细胞内乙醇同化和乙酸过氧化通路活跃使得醋酸菌得以继续生存。还发现了与细菌素生产相关的基因。Illeghems 所在Stefan Weckx 带领的团队还陆续对可可豆发酵过程中分离到的特定菌株，如Acetobacter pasteurianus 386B，Lactobacillus fermentum 222、Lactobacillus plantarum 80，Acetobacter ghan

25、ensis、Acetobacter senegalensis等进行基因组和功能比较基因组的分析。这些研究深入剖析了可可豆发酵过程中微生物群落结构以及多种优势微生物的基因组和代谢途径特性，为今后可可豆发酵选取更优的发酵菌剂提供了有效的依据。2.5 其他宏基因组和宏转录组还应用在其它多种发酵食品研究中，如酱油和酒类等。酱油是亚洲食品中的一种重要的酿造调味品，其质量取决于发酵过程中微生物的种群结构及相互代谢调控。传统酱油的浓厚风味依赖于天然微生物发酵，而非大规模工业生产中使用的特定发酵菌剂，因而明确传统酱油生产过程中微生物的种类及其群落演替和代谢机理对于中国传统酿造酱油工业的发展具有重要意义。在对酱

26、油卤水发酵过程中微生物的演替及其功能的研究中，Sulaiman 等运用宏基因组学对为期6 个月的发酵卤水中微生物种群结构变化和功能做了研究。结果显示，发酵卤水是以魏斯菌属Weissella 为主，后期的优势真菌为念珠菌属Candida；通过宏基因组序列的代谢重建，揭示了蛋白质和碳水化合物异养发酵的特征，与检测到乙醇和pH 下降相符。这是第一个通过宏基因组对传统酱油发酵过程的微生物演替和功能做的研究。在印度米酒酒曲（Xaj-pitha）的研究中，Bora 等首次应用宏基因组学揭示了更为全面的微生物群落特征，包括产淀粉酶菌株如根霉、毛霉和曲霉；产乙醇菌株如Meyerozyma guilliermo

27、ndii, Wickerhamomyces ciferrii, Saccharomyces cerevisiae,等；细菌主要是各种乳酸菌。但对于所获宏基因组数据，作者仅报道了分类学研究部分的结果，功能基因组分析和代谢途径的重构仍未见报道。目前，对传统酿造酱油、酒类和醋的深入研究主要包括有应用代谢组学研究其发酵过程中风味物质形成与变化以及对优势菌株的基因组和比较基因组研究，而发酵过程中微生物种群研究中大多采用rRNA 基因片段测序的生物多样性分析，采用宏基因组或宏转录组系统研究发酵过程中微生物群落结构演替和功能基因的报道还很少。如整合代谢组与微生物多样性分析对镇江香醋、山西陈醋等食醋的研究；对

28、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 和酒球菌Oenococcus oeni 不同株系的基因组和比较基因组研究分析。今后宏基因组学和宏转录组学技术的应用将进一步获知这些食品发酵过程中微生物的具体种系和功能基因，与代谢组数据整合，加速人们对传统酿造酱油、醋和酒类中微生物的群落演替和风味物质形成机制的认识，也将有利于人们从中挖掘出更多的有益菌株和潜在的功能基因应用于未来的工业生产。3结 语如上所述，近些年来主要基于高通量测序技术的宏基因组和宏转录组在发酵食品微生物研究中取得了一些进展。但是依旧存在着许多局限性，包括：1）基于二代测序技术手段对宏基因组、宏转录组数据进行组装分析，

29、是目前广泛使用的方法；但是由于二代测序读长较短，组装仅能达到Scaffold水平；尤其是对复杂的基因组，高含量的重复序列使得基因组大小出现“缩水”现象。2）测序数据的拼接很大程度上依赖于现有数据库中已知的微生物序列，这阻碍及时发现微生物新品种，并浪费部分测序数据。3）宏基因组和宏转录组测序数据量较大，分析有一定的难度，且生物信息分析对数据处理系统要求较高，不同的算法可能结果差异甚大。4）虽然宏转录组学克服了基因芯片技术的一些弊端（如可探测目标局限性、芯片交叉反应造成假阳性），但低丰度基因的检测依旧较困难。5）由于测序分析费用较高，目前重复样本一般较少，使得结果的可靠性和再现性受到限制。幸运的是

30、，测序技术不断进步，三代测序技术如PacBio RS 具有超长读取长度（10kb）和极低的GC 偏好性，有利于基因组的组装；结合使用二代测序和光学图谱技术在高等动植物基因组和转录组研究中已有应用，这为发酵食品微生物群落研究提供了借鉴。日益增长完善的微生物、特别是发酵食品微生物物种的基因组数据库，为宏基因组和宏转录组数据拼接和注释提供越来越多坚实的支撑。宏基因组学、宏转录组学与代谢组学、蛋白质组学等交织运用、整合分析将有助于我们更清晰地了解发酵食品中微生物的群落结构演替、相互作用、各菌株对风味的贡献，并挖掘出新的功能基因。未来微生物学、食品化学、生物信息学、分子生物学等多学科理论知识以及新的测序技术、更加完善的基因数据库、先进的数据分析工具以及多种组学方法的结合分析必将给发酵食品微生物的研究带来新的曙光。