薄层层析操作要点Word文档下载推荐.docx

1、实验证明：定量毛细管更适合较小体积的点样；微量注射器更适合较大体积的点样。这主要是因为微量注射器受小气泡、溶液回爬现象的影响较大。为避免不同定量毛细管间的点样误差、建议一块薄层板上最好用同一只定量毛细管。但应注意更换样品时，应将毛细管用超声波或不同极性溶剂清洗干净。在制备样品时，溶样溶剂黏度不能过高，以便于点样；溶剂沸点过低则进样体积易变，过高则会改变展开剂组成；对样品溶解度过高会使样点发生空心现象；常用的溶剂为甲醇、乙醇、丙酮。经典TLC样点原点一般为直径3mm点间距1-2cm 底边距1.5cm；HPLC样点原点一般为直径1mm点间距5mm 底边距1cm。展开剂配制选择合适的量器把各组成溶剂

2、移入分液漏斗，强烈振摇使混合液充分混匀，放置，如果分层，取用体积大的一层作为展开剂。绝对不应该把各组成溶液倒入展开缸，振摇展开缸来配制展开剂。混合不均匀和没有分液的展开剂，会造成层析的完全失败。各组成溶剂的比例准确度对不同的分析任务有不同的要求，尽量达到实验室仪器的最高精确度，比如：取1ml的溶剂，应使用1ml的单标移液管，移液管应符合计量认证要求，尽管多数时候这不是必须的。展开系统的饱和一般使用的是双槽的展开缸，一槽用来放展开剂，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展开的板放入两槽间的平台，斜架着，盖上展开缸的盖子。让展开剂的蒸气充满展开缸，并使薄层板吸附蒸气达到饱和，防止边沿效应，饱和时间在半个小

3、时左右。展开时难免要打开盖子把薄层板放入展开剂中，不过对薄层板与蒸气的吸附平衡影响不大，当然动作应该尽量轻、快。 温湿度的控制温湿度对薄层影响都很大。不冻结的前提下，通常温度越低分离越好，较难的分离需在低温下分离，例如人参皂苷。湿度的影响，估计主要是影响薄层板的吸附能力，导致选择性（容量因子）的变化，湿度应根据实际情况确定。温度控制使用空调器或冰柜，湿度控制是通过在另一展开槽放置相应浓度的硫酸。展开剂的选择TLC与HPLC相比，一个突出的优点就是流动相的选择具有更大的灵活性。流动相的选择的目的是使绝大部分样品的RF值位于0.1-0.7之间并达到较好的分离，与此对应的是流动相要有适当的强度和组成

4、。流动相强度越大，溶质RF值越大，但很可能降低分离能力；另外单一溶剂很难分离较复杂的混合物，根据相似相溶原理，要使用多元溶剂体系。一般展开剂体系选择如下：根据分离样品性质、薄层色谱板性质选择一个二元溶剂体系，通过调节溶剂比例以寻求适合RF值，适合的RF值找到后，再寻求极性参数相同的二元溶剂体系两个，以这三个组成为三点组成一个三角形，则可看到：三角形顶点是二元体系，边是三元体系，三角形内是四元体系，并且极性一致，可根据几何原理得出任一点组成。这种方法较为直观，也较简单。显色喷显色剂显色最重要是有好的雾化器。TLC的通用显色方法理想的显色希望灵敏度高、斑点颜色稳定、斑点与背景间的对比度好、斑点的大

5、小及颜色的深度与物质的量成正比。在样品组成并不完全已知的情况下，通用显色方法显得成尤为重要。通用显色法主要有：（1）紫外照射法：方便，不破坏样品；（2）碘蒸气法：通用性强，与紫外法结合灵敏度高于该两法单独使用；（3）荧光试剂：制造荧光背景，使原来紫外下无荧光物质被鉴别，有荧光物质更明显；（4）硫酸溶液：对绝大多数有机物有效，但有破坏性。薄层层析（thin layer chromatography），也叫薄层色谱、薄板色谱或薄板层析，属层析技术中的一类，常用TLC代表。如同柱层析一样，按其作用机理可分为吸附薄层层析，分配薄层层析等。其中应用最广泛的是吸附薄层层析。其原理见第97100页和第102

6、104页。薄层层析具有微量、快速、操作简便等优点，但不适合于较大量的样品的分离，通常可分离的量在0.5g以下，最低可达10 g。以下介绍吸附薄层层析的相关问题，其他类型薄层层析可参照处理。1.薄层层析的用途在实验室中，薄层层析主要用于以下几种目的。（1）作为柱层析的先导。一般说来，使用某种固定相和流动相可以在柱中分离开的混合物，使用同种固定相和流动相也可以在薄层板上分离开。所以常利用薄层层析为柱层析选择吸附剂和淋洗剂。（2）监控反应进程。在反应过程中定时取样，将原料和反应混合物分别点在同一块薄层板上，展开后观察样点的相对浓度变化。若只有原料点，则说明反应没有进行；若原料点很快变淡，产物点很快变

7、浓，则说明反应在迅速进行；若原料点基本消失，产物点变得很浓，则说明反应基本完成。（3）检测其他分离纯化过程。在柱层析、结晶、萃取等分离纯化过程中，将分离出来的组分或纯化所得的产物溶样点板，展开后如果只有一个点，则说明已经完全分离开了或已经纯化好了；若展开后仍有两个或多个斑点，则说明分离纯化尚未达到预期的效果。（4）确定混合物中的组分数目。一般说来，混合物溶液点样展开后出现几个斑点，就说明混合物中有几个组分。（5）确定两个或多个样品是否为同一物质。将各样品点在同一块薄层板上，展开后若各样点爬升的高度相同，则大体上可以认定为同一物质，若上升高度不同，则肯定不是同一物质。（6）根据薄层板上各组分斑点

8、的相对浓度可粗略地判断各组分的相对含量。（7）迅速分离出少量纯净样品。为了尽快从反应混合物中分离出少量纯净样品作分析测试，可扩大薄层板的面积，加大薄层的厚度，并将混合物样液点成一条线，一次可分离出数十毫克到五百毫克的样品。2.薄层层析的仪器和药品（1）薄板薄层层析所用的基板通常为玻璃板，也有用塑料板的，根据用途的不同而有不同的规格。作分析鉴定用的多为7.5cm2.5cm的载玻片。若为分离少量纯样品，可将普通玻璃板裁成20cm15cm的大小，将棱角用砂纸稍加打磨，以免割破手指，然后洗净干燥即可使用。近年来，有些厂商将吸附剂涂在大张金属箔片上出售。购回后只需用剪刀剪成合适大小即可点样展开。用完后可

9、以适当溶剂将箔片上样点浸萃掉，经干燥后即可重复使用，但吸附剂涂层很薄，一般只可作分析鉴定用。（2）展开槽展开槽也叫层析缸，规格形式不一。图3-39绘出了其中的几种，图中的a为立式，b为卧式，c和d为斜靠式，e为下行式，f为制备纯样品所用的大型展开槽，亦为斜靠式。a,b,c,d,f统称上行式。下载 （5.57 KB）2009-6-7 21:08图3-39薄层板在不同的层析缸中展开（3）吸附剂薄层层析中所用吸附剂最常见的有硅胶和氧化铝两类。其中不加任何添加剂的以H表示，如硅胶H，氧化铝H；加有煅石膏（CaSO1/2 HO）为粘合剂的用G表示（gypsum ），如硅胶G，氧化铝G；加有荧光素的用F表

10、示（fluorescein），如硅胶HF ，意思是其中所加荧光素可在波长254 nm的紫外光下激发荧光；同时加有煅石膏和荧光素的用GF表示，如硅胶GF ，氧化铝GF 。如在制板时以羧甲基纤维素钠的溶液调和，则用CMC表示（carboxymethyl cellulose），如硅胶CMC。添加粘合剂是为了加强薄层板的机械强度，其中以添加CMC者机械强度最高；添加荧光素是为了显色的方便。习惯上把加有粘合剂的薄层板称为硬板，不加粘合剂的薄层板称为软板。供薄层层析用的吸附剂粒度较小，通常为200目，标签上有专门说明，如Silica gel H for thin layer chromatography,

11、使用时应予注意，不可用柱层析吸附剂代替，也不可混用。薄层层析用的氧化铝也有酸性、中性、碱性之分，也分五个活性等级。选择原则与柱层析类同。（4）展开剂在薄层层析中用作流动相的溶剂称为展开剂，它相当于柱层析中的淋洗剂，其选择原则也与淋洗剂类同，也是由被分离物质的极性决定的，被分离物极性小，选用极性较小的展开剂；被分离物极性大，选用极性较大的展开剂。环己烷和石油醚是最常使用的非极性展开剂，适合于非极性或弱极性试样；乙酸乙酯、丙酮或甲醇适合于分离极性较强的试样，氯仿和苯是中等极性的展开剂，可用作多官能团化合物的分离和鉴定。若单一展开剂不能很好分离，也可采用不同比例的混合溶剂展开。选择展开剂的一条快捷的

12、途径是在同一块薄层板上点上被分离样品的几个样点，各样点间至少相距1cm，再用滴管分别汲取不同的溶剂，各自点在一个样点上，溶剂将从样点向外扩展，形成一些同心的圆环。若样点基本上不随溶剂移动（见图3-40a），或一直随溶剂移动到前沿（见图3-40d），则这样的溶剂不适用。若样点随溶剂移动适当距离，形成较宽的环带（见图3-40b），或形成几个不同的环带（见图3-40c），则该溶剂一般可作为展开剂使用。下载 （2.85 KB）10下载 （3.1 KB）图3-40选择展开剂 图3-41载玻片浸渍涂层3.薄层层析的操作（1）制板制板也称铺板或铺层，有“干法”和“湿法”两种，由于干燥的吸附剂在玻璃板上附着力

13、差，容易脱落，不便操作，所以很少采用，此处只介绍湿法铺板。a.供分析、鉴定、监控用的载玻片的铺制。首先将吸附剂用溶剂调成糊状，所用溶剂可以是低沸点有机溶剂，也可以是蒸馏水。有机溶剂中应用较广的是氯仿，一般按照每克硅胶3mL氯仿的比例在广口瓶中调成糊状，立即以带螺旋的盖子盖紧备用。在铺板时用力摇匀，旋开盖子，将两块载玻片叠在一起，以食指和拇指捏住它们的侧面靠近一端处，缓慢平稳地浸入瓶中的糊状吸附剂里，使糊状物浸没至离载玻片顶端约1cm处，然后缓缓提起（见图3-41），在空气中握持片刻，使氯仿大部分挥发掉。将两块载玻片拆开，浸涂面向上，平放在桌上，干燥后即可使用。每次浸涂后应立即将广口瓶盖紧密封，

14、以免溶剂挥发。这样制得的薄层板机械性能稍差。为了提高薄层强度，可用甲醇代替氯仿，或将甲醇与氯仿按不同的比例混合使用。以蒸馏水作溶剂时，首先将待铺的载玻片平放在水平台面上，将吸附剂置于干净研钵内，按照每克硅胶G23mL蒸馏水（或34mL羧甲基纤维素钠溶液），或每克氧化铝12mL蒸馏水的比例加入溶剂，立即研磨成糊状。用牛角匙舀取糊状物倒在载玻片上迅速摊布均匀，也可轻敲载玻片边缘，或将载玻片托在手中前后左右稍稍倾斜，靠糊状物的流动性使之分布均匀。然后再平放在台面上，使其固化定型并晾干。固化的过程是吸附剂内的煅石膏吸收水形成新固体的过程，反应式为：CaSO41/2H2O + 3/2H2O CaSO42

15、H2O所以研磨糊状物和涂铺薄层板都需尽可能的迅速。若动作稍慢，糊状物即会结成团块状无法涂铺或不能涂铺均匀，即使再加水也不能再调成均匀的糊状。通常研磨糊状物需在1min左右完成，铺完全部载玻片也只需数分钟，最多在十数分钟内完成。每次铺板都需临时研磨糊状物。以蒸馏水作溶剂制得的薄层板具有较好的机械性能，如欲获得机械性能更好的薄层板，可用1%的羧甲基纤维素钠水溶液来调制糊状物。将1g羧甲基纤维素钠加在100mL蒸馏水中，煮沸使充分溶解，然后用砂芯漏斗过滤。用所得滤液如前述方法调糊铺板，这样的薄层板具有足够的机械性能，可以用铅笔在上面写字或作其他记号，但需注意在活化时严格控制烘焙温度，以免温度过高引起

16、纤维素碳化而使薄层变黑。图3-42薄层涂布器1铺好的薄层板；2涂布器；3，5厚玻板；4玻璃板b.涂布器制板法。图3-42为薄层涂布器。将几块玻璃板放在涂布器中间摆好，两边是两块比前者约厚0.5mm的玻璃板，向涂布器槽中倒入预先调好的糊状吸附剂，将涂布器自左向右推去即能将糊状物均匀地涂在玻璃板上。待晾干定型之后，将几块玻璃板分开，刮去边上多余的吸附剂即得到一定厚度的薄层层析板。c.较大薄层板的铺制。供分离纯化用的薄层板具有较大的尺寸，通常都是用蒸馏水来调制糊状物的，方法同前。铺板的方法如下：倾注法将玻璃板平放在台面上，把研好的糊状物迅速倾倒在玻璃板上，用干净玻璃棒摊平，或手托玻璃板微微倾斜，并轻

17、轻敲击玻璃板背面，使之流动，即可获得平整均匀的薄层。刮平法将待铺玻璃板平放台面上，在其长条方向的两边各放一条比玻璃板厚1mm的玻璃板条。将调好的糊状物倒在中间的玻板上，用一根有机玻璃尺将糊状物沿一个方向刮平，即形成厚1mm的均匀薄层。待固化定型后抽去两边的玻璃板条即可。大薄层板的活化及存放方法与载玻片相同。不管以何种方法铺板，都要求铺得的薄层厚薄均一，没有纹路，没有团块凸起。纹路或团块的产生原因是糊状物调得不均匀，或铺制太慢，或在局部固化的板子上又加入新的糊状物，所以为获得均匀的薄层，应动作迅速，一次研匀，一次倾倒，一次铺成。（2）活化将晾干后的薄板移入烘箱内“活化”。活化的温度因吸附剂不同而

18、不同。硅胶薄板在105110烘焙0.51h即可；氧化铝薄板在200220烘焙4h，其活性约为级，若在150160烘焙4h，活性相当于级。活化后的薄层板就在烘箱内自然冷却至接近室温，取出后立即放入干燥器内备用。（3）点样固体样品通常溶解在合适的溶剂中配成1%5%的溶液，用内径小于1mm的平口毛细管吸取样品溶液点样。点样前可用铅笔在距薄层板一端约1cm处轻轻地画一条水平横线作为“起始线”。然后将样品溶液小心地点在“起始线”上。样品斑点的直径一般不应超过2mm。如果样品溶液太稀需要重复点样时，须待前一次点样的溶剂挥发之后再点样。点样时毛细管的下端应轻轻接触吸附剂层。如果用力过猛，会将吸附剂层戳成一个

19、孔，影响吸附剂层的毛细作用，从而影响样品的值。若在同一块板上点两个以上样点时，样点之间的距离不应小于1cm。点样后待样点上溶剂挥发干净才能放入展开槽中展开。（4）展开展开剂带动样点在薄层板上移动的过程叫展开。展开过程是在充满展开剂蒸气的密闭的展开槽中进行的。展开的方式有直立式、卧式、斜靠式、下行式、双向式等。直立式展开是在立式展开槽中进行的，如图3-39a。先在展开槽中装入深约0.5cm的展开剂，盖上盖子放置片刻，使蒸气充满展开槽，然后将点好样的薄层板小心地放入其中，使点样端向下（注意展开剂不可浸及样点），盖好盖子。由于吸附剂的毛细作用，展开剂缓缓向上爬升。如果展开剂选得合适，样点也随之展开。

20、当展开剂前沿升至距薄层板上端约1cm处时取出薄层板并立即标记出前沿位置。分别测量各样点中心及前沿到起始线的距离，计算各组分的比移值。如果样品中各组分的比移值都较小，则应该换用极性大一些的展开剂；反之，如果各组分的比移值都较大，则应换用极性小一些的展开剂。每次更换溶剂，必须等展开槽中前一次的溶剂挥发干净后，再加入新的溶剂。更换溶剂后，必须更换薄层板并重新点样、展开，重复整个操作过程。直立式展开只适合于硬板。卧式展开如图3-39b所示，薄层板倾斜15放置，点样端向下，涂层向上，操作方法同直立式，只是展开槽中所放的展开剂应更浅一些。卧式展开既适用于硬板，也适用于软板。斜靠式展开如图3-39c，d，f

21、所示，薄层板的倾斜角度在3090 之间，一般也只适合于硬板。下行式展开如图3-39e所示。 薄层板竖直悬挂在展开槽中，一根滤纸条或纱布条搭在展开剂和层析板上沿，靠毛细作用引导展开剂自板的上端向下展开。 此法适合于比移值较小的化合物。双向式展开是采用方形玻璃板铺制薄层，样品点在角上，先向一个方向展开，然后转动90再换一种展开剂向另一方向展开。此法适合于成分复杂或较难分离的混合物样品。用于分离的大块薄层板，是在起点线上将样液点成一条线，使用足够大的展开槽展开，如图3-39f所示，展开后成为带状，用不锈钢铲将各色带刮下分别萃取，各自蒸去溶剂，即可得到各组分的纯品。若无展开槽，可用带有螺旋盖的广口瓶代

22、替，如图3-39c所示。若展开槽较大，则应预先在其中放入滤纸衬里，如图3-39 c,d,f所示。衬里的作用是使展开剂沿衬里上升并挥发，使展开剂蒸气迅速充满展开槽。（5）显色分离和鉴定无色物质，必须先经过显色，才能观察到斑点的位置，判断分离情况。常用的显色方法有如下几种： 碘蒸气显色法。由于碘能与很多有机化合物（烷烃和氯代烃除外）可逆地结合形成有颜色的络合物，所以先将几粒碘的晶体置于广口的密闭容器中，碘蒸气很快地充满容器，再将展开后的薄板（溶剂已挥发干净）放入其中并密闭起来，有机化合物即与碘作用而呈现出棕色的斑点。取出薄层板后应立即标记出斑点的位置和形状（因为碘易挥发，斑点的棕色在空气中很快就会

23、消失），计算Rf值。 紫外光显色法。如果被分离（或分析）的样品本身是荧光物质，可在暗处在紫外灯下观察到它的光亮的斑点。如果样品并无荧光性，可以选用加有荧光剂的吸附剂来制备薄板，或在制板时加入适量荧光剂，或在制好的薄板上用喷雾法喷洒荧光剂以制取荧光薄板。荧光薄板经点样、展开后取出，标记好前沿，待溶剂挥发干后放在紫外灯下观察。有机化合物在光亮的背景上呈现暗红色斑点。标记出斑点的位置和形状，计算Rf值。 试剂显色法。除了上述显色法之外，还可以根据被分离（分析）化合物的性质，采用不同的试剂进行显色，一些常用显色剂及被检出物质列在表3-2中。操作时，先将薄层板展开，风干，然后用喷雾器将显色剂直接喷到薄层板上，被分开的有机物组分便呈现出不同颜色的斑点。及时标记出斑点的形状和位置，计算比移值。（6）计算比移值*以CMC为粘合剂的硬板不宜用硫酸显色，因为硫酸也会使CMC碳化变黑，整板黑色而显不出斑点位置。