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1、反义核酸技术及其在寄生虫学中的应用进展反义核酸技术及其在寄生虫学中的应用进展反义核酸是指能与特定RNA精确互补、特异阻断其翻译的RNA或DNA分子。利用反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达，这种技术即为反义核酸技术1-3。它包括反义RNA、反义DNA和核酶(ribzyes)三大技术。反义核酶作为一种基因下向调节作用因子，在抑制一些有害基因的表达和失控基因的过度表达上发挥着重要作用。随着反义核酶技术的发展和成熟，已逐渐应用于抗某些人体寄生虫病的研究。本文拟就反义核酸技术的作用原理和特点作一简要概述，着重阐述其在寄生虫领域中的应用进展。1反义核酸的作用原理反义核酸目前有三种来源：一是

2、利用固相亚磷酰胺法人工合成的短小反义寡聚核苷酸(antisenseligdexynletides，AN)，这是反义核酸最普遍的应用方式，包括未修饰AN和硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(P)和甲基化等修饰AN二类，其中以PSAN应用最广泛。AN设计合成简单，只要其顺序与靶RNA部分顺序互补即可，而对基因的读码框无要求；二是更具有实用价值的工人表达载体，包括单个基因和多个基因的联合反义表达载体3，它是利用基因重组技术将靶基因序列反向持插入到载体的启动子和终止子之间，通过转录可源源不断产生反义RNA分子；三是天然存在的反义核酸分子，但目前分离纯化尚存在困难。1.1反义RNA和反义DNA反义RNA是

3、指能和RNA完全互补的一段小分子RNA或寡聚核苷酸片段，反义DNA是指能与基因DNA双链中的有义链互补结合的短小DNA分子。反义RNA和反义DNA主要是通过RNA的翻译和基因DNA的转录而发挥作用10：1)抑制翻译。反义核酸一方面通过与靶RNA结合形成空间位阻效应，阻止核糖体与RNA结合，另一方面其与RNA结合后激活内源性RNase或ribzye，降解RNA3；2)抑制转录。反义DNA与基因DNA双螺旋的调控区特异结合形成DNA三聚体(triplex),或与DNA编码区结合，终止正在转录的RNA链延长3。此外，反义核酸还可抑制转录后RNA的加工修饰，如5端加帽、3端加尾(plya)、中间剪接和

4、内部碱基甲基化等，并阻止成熟RNA由细胞核向细胞浆内运输。1.2核酶eh等发现四膜虫核糖体RNA前体在成熟过程中，可精确地自我切除某些片段并重新连接，这种具有酶催化活性的RNA称之为核酶11,12。核酶广泛存在于生物细胞中，有锤头状和发夹二种结构。酶活性中心由两个臂和中间的功能区组成13。两个臂序列高度保守，与靶RNA特异互补结合，相当于一种反义RNA，而功能区则可通过降解RNA的磷酸二酯键而分解消化靶RNA，而核酶本身在作用过程中并不消耗。核酶裂解分子依赖严格的空间结构形成，裂解部位总是位于靶RNA分子中GUX三联体(X：、U、A)下游方向即3端12。核酶除天然存在外，也可人工合成。根据核酶

5、的作用位点、靶RNA周围的序列和核酶本身高度保守序列，可方便地人工设计合成核酶的特异性序列。此外，利用基因工程将核酶的编码基因克隆在SP6或T7等启动子下游，通过转录合所需核酶。核酶能特异切割RNAA分子，使阻断基因表达，特别是阻断有害基因的表达成为可能。如果已知靶RNA中GUX三联体的位置，可将核酶的编码基因插入反义表达载体的适当位置，这样转录所产生的含有核酶的反义RNA具有双重功能：一方面具有反义抑制作用，另一方面具有切割靶RNA的催化作用。核酶在抗肿瘤、抗病毒方面具有十分诱人的前景，第一个应用核酶进行艾滋病基因治疗的临床计划已获准，核酶作为一种遗传信息药物，在肿瘤基因治疗中必将日益受到重

6、视。2反义核酸的作用特点反义核酸作为基因治疗药物之一，与传统药物相比具有诸多优点。1)高度特异性：反义核酸药物通过特异的碱基互补配对作用于靶RNA或DNA，犹如“生物导弹”。2)高生物活性、丰富的信息量；反义核酸是一种携带特定遗传信息的信息体，碱基排列顺序可千变万化，不可穷荆3)高效性：直接阻止疾病基因的转录和翻译。4)最优化的药物设计：反义核酸技术从本质上是应用基因的天然顺序信息，实际上是最合理的药物设计。5)低毒、安全：反义核酸尚未发现其有显著毒性，尽管其在生物体内的存留时间有长有短，但最终都将被降解消除，这避免了如转基因疗法中外源基因整合到宿主染色体上的危险性。3反义核酸技术在寄生虫学中

7、的应用反义核酸技术的飞速发展和成熟，使其逐渐渗透并应用到寄生虫学领域，丰富和发展了寄生虫病的基因治疗策略。反义核酸技术在抗寄生虫病研究的应用主要集中于原虫类，如疟原虫、锥虫和利什曼原虫等，而且反义核酸中又以AN方面的报道最多。下面着重就AN在寄生虫方面的研究应用作用一简要阐述。3.1疟原虫疟原虫嘌呤核苷酸合成具有特殊性，即无从头合成途径，依靠补救合成途径利用体内游离的嘌呤或嘌呤核苷。疟原虫的二氢叶酸还原酶(dihydrflateredutase，DHFR)和胸苷酸合酶(thyidylatesynthase，TS)结合形成双功能蛋白(DHFR-TS)，这对于维持疟原虫四氢叶酸水平和DNA合成极为

8、重要14，此酶也是疟原虫脱氧胸苷酸生物合成唯一通路中必不可少的酶。抗疟药中的抗叶酸代谢药如乙胺嘧啶，就是通过竞争性抑制DHFR-TS来阻断虫体脱氧胸苷酸生物合成15。然而，随着恶性疟原虫(Plasdiufaliparu)多药抗性株的出现和广为传播，疟疾的化疗面临重大挑战，促使人们寻求新的抗疟疗法。目前，DHFR-TS是AN抗疟作用首选靶基因。生物大分子进入感染红细胞中的疟原虫，必需穿透三层膜，即红细胞膜、纳虫泡膜和虫体的胞质膜。研究表明，不能穿透红细胞膜和纳虫泡膜的大分子和葡聚糖、IgG2a抗体和蛋白A等，可经过纳虫微管(parasitphrusdut)进入虫体，虫体通过胞吞作用直接从细胞外摄

9、入大分子物质16。因此，对于小分子的AN而言，作用于感染红细胞中的虫体完全成为可能，下述众多研究已充分证明了这一点。Rapaprt等(1992)研究发现17，以DHFR-TS为靶21ntPSAN能选择性地进入恶性疟原虫感染红细胞，对体外培养的氯喹敏感株和耐药株虫体具有同等的抑制效果，而未感染疟原虫的红细胞则完全为不摄入AN，因此这对应用反义核酸于抗疟治疗非常有利。诸多研究表明，AN越长，对转译的抑制作用就越强；AN浓度越高，非特异性抑制作用越明显，在低浓度时则呈特异性抑制。Sartrius和Franklin(1991)以DHFR-TS的RNA为靶合成系列AN，利用兔网织红细胞翻译系统，探讨AN

10、对体外转译的抑制作用18。在DHFR翻译起始位点处合成了6条2149nt不等长的AN，在TS编码区全成的30nt、39nt和49nt三条AN。当AN长度为30nt或更长时，呈明显转译抑制作用，抑制率可高达50以上。其中，TS编码区的49ntaN(TS49)抑制效果最高，当浓度在45l/L时的抑制率几乎达90，主要是因为TS49与DHFR-TS靶RNA结合抑制TS合成，这从翻译产物的分子量(55kDa)要比天然DHFR-TS(71kDa)小且无TS活性可看出。Raasay等和lark等研究表明，在较高浓度下，无论DHFR-TS正义还是反义的寡聚核苷酸(1K，2K)，均能抑制裂殖子入侵红细胞19,

11、20。究其原因，可能与高浓度的AN带有较多的负电荷有关。Kanagaratna等(1998)分析了疟原虫裂殖子表面蛋白基因的反义和正义寡聚核苷酸对疟原虫体外生长的影响21，无论AN单独使用抑或与脂质体混合使用，均未观察到特异抑制效应。但在相同浓度范围内，反义和正义寡核苷酸以及具有多聚阴离子的硫酸葡聚糖，均可抑制裂殖子入侵红细胞。当寡聚核苷与阳离子脂质体结合后负电荷被中和时，则对裂殖子入侵红细胞的抑制作用被取消。由此推测，寡聚核苷酸有可能借助其多聚阴离子特性干扰裂殖子与细胞上受体结合，多聚阴离子可能对疟疾病治疗有帮助。3.1.2AN不同修饰物对抗疟作用影响最近，Barker等以DHFR-TS基因

12、为靶，比较了硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(P)和甲基化修饰AN，以及不同空间结构AN对体外培养虫体生长抑制作用22。结果显示，5和3端至少含有3个PS基因的P-PS杂合体AN、全部为PS修饰的AN，与部分PS修饰的AN抑制作用相同。在低浓度下(1l/L)，P-PSaN和PSAN比PS-甲基化AN抑制率高25。此外，通过延长AN序列增加干-环结构形成，提高AN的自我稳定性，结果获得2个有干-环结构的AN(RB39、RB41)，其抑虫生长率比序列未延长的AN约要高20。3.1.3AN不同靶基因对抗疟作用影响AN对不同基因的抑制作用不一致，这和该基因在虫体代谢过程中是否起举足轻重作用密切相关14

13、。AN的抗疟研究主要集中在DHFR-TS基因，这固然与其在疟原虫核苷酸代谢中的特殊地位有关(见前述)。Barker等(1996)对恶性疟原虫耐药株多个靶基因的AN作用进行了比较研究23，方法是将PSaN加入到疟原虫体外培养液中，培养48小时后，通过镜检和3氚-次黄嘌呤掺入试验观察AN对虫体的生长抑制作用。结果表明，抑制作用与AN浓度密切相关。当AN浓度为1l/L时，AN呈非特异性抑制；当浓度在0.50.005l/L范围时，以DHFR-TS、二氢喋呤合成酶、核苷酸还原酶、裂殖体多基因家族和红细胞结合抗原-175为靶的PSaN与对照组相比，均能特异地显著抑制虫体生长(P0.0001)，而DNA聚合

14、酶的PSaN抑制作用更弱，磷酸丙糖异构酶的PSAN抑制作用则与对照组相同。疟原虫感染红细胞中，近75血红蛋白被滋养体降解而形成大量对虫体有害的血红素，必须在消化泡中聚集成对虫体无毒的疟色素24,25。研究表明，恶性疟原虫组氨酸富集蛋白(HRP)家族中，HRP和HRP有明显的促进疟色素形成功能26。因此，如能特异阻断这些基因表达，抑制疟色素的形成，有可能使之成为一种抗疟新途径。HRP与HRP从同一祖先基因分化而来，二者高度同源，翻译起始位点附核苷酸序列则完全相同27,28。3.2锥虫属于动基体目的布氏锥虫(TrypansaburEi)通过抗原不断变异逃避宿主的免疫力，抗原变异是由于不同的变异体专

15、一表面糖蛋白(variant-speifisurfaeglyprtein，VSG)基因呈间断表达所致，VSG基因表达产物在锥虫表面形成外膜，覆盖虫体29,30。研究表明，VSGRNA可分为二部分31,32：一部分是各种变异体特有的主外显子序列，占主要部分；另一部分是共同的5端小外显子序列，通常为35个核苷酸长，几乎所有的VSGRNA均含有此序列。实际上，除VSG外，锥虫的钙调蛋白、微管蛋白和磷酸丙糖异构酶RNA中也存在共同的5端小外显子序列，这似乎是动基体目寄生原虫编码基因的共同结构特征32。由于宿主RNA无这种小外显子序列，以小外显子序列为靶的AN就很容易实现抑制众多基因表达的效果，使反义核

16、酸抗锥虫感染成为可能。rnelissen等应用麦胚提取物转译系统、35S-甲硫氨酸掺入试验和蛋白质SDS-PAGE方法33，对与锥虫小外显子序列不同位点互补和不同长度的AN体外转译抑制作用进行了比较分析。结果所有AN均能抑制转录，且抑制程度与AN长度和浓度有关，AN越长，浓度越高则抑制作用越强。如3个12nt和AN抑制率达3560，而22nt和34ntaN在浓度为1530l/L时对锥虫总RNA转录抑制率高达95100。在同一转译系统中，BV病毒(BresaiVirus)和无小外显子序列的锥虫磷酸甘油酸激酶RNA却完全不受34ntAN的抑制，与锥虫小外显子序列不互补的18ntAN对锥虫转译则无任何影响。上述发现充分证明