磁珠提取新.ppt

1、磁珠式核酸提取体系磁珠式核酸提取体系核酸提取的总体要求核酸提取的总体要求 n n高质量：纯度高并且尽可能不破坏核酸n n高产量：样本量一定时尽可能提取多的核酸n n高通量：同时提取多个标本n n自动化：降低劳动量；生物科技的飞速发展，需要处理的核酸样本迅速增多，自动化提取核酸成为一种迫切需要的选择。磁粒法核酸提取的特点磁粒法核酸提取的特点n n步骤：步骤：n n裂解裂解核酸结合核酸结合洗涤洗涤洗脱洗脱n n特点：特点：n n提取时间短提取时间短n n不使用酚、氯仿不使用酚、氯仿n n用磁分离替代离心分离易于自动化，可以实现用磁分离替代离心分离易于自动化，可以实现高通量提取高通量提取n n目前处

2、于市场发育阶段，是未来发展的方向目前处于市场发育阶段，是未来发展的方向n n主要产品为国外产品：主要产品为国外产品：PromegaPromega、RocheRoche、KingFisherKingFisher、DynalDynal等，大多需要与专用仪器配等，大多需要与专用仪器配套套提取方式提取方式 时间时间自动化自动化 酚、氯仿酚、氯仿经典方法经典方法长长难难有有玻璃粉法玻璃粉法短短难难没有没有离心柱法离心柱法短短难难没有没有磁粒法磁粒法短短容易容易没有没有各种提取方式操作比较各种提取方式操作比较磁粒法核酸提取基本步骤磁粒法核酸提取基本步骤n n裂解细胞或病毒颗粒n n核酸与磁粒结合n n磁分

3、离弃上清n n洗涤缓冲液洗涤磁粒n n磁分离弃上清n n洗脱液将核酸从磁粒洗脱n n磁分离弃磁粒，收集上清结 合洗涤洗脱磁粒法提取核酸示意图磁粒提取试剂操作方式磁粒提取试剂操作方式n n磁架n n磁笔n n自动提取仪裂解结合磁分离吸去废液洗涤洗脱磁架提取核酸示意图裂解结合转移磁粒洗涤洗脱转移磁粒磁笔提取核酸示意图自动仪器提取自动仪器提取 自动提取的原理与磁笔提取相同，只是用机器的运转代替手工操作，实现高通量提取和减少工作量。磁珠提取方法的优化磁珠提取方法的优化n n裂解：裂解液配方，作用时间和温度等n n结合：结合液的选择和用量等n n洗涤：洗涤液配方等n n洗脱：洗脱时间和温度等主要实验结果

4、主要实验结果n n与其他方法或类似商业化试剂盒的比较n n核酸提取的灵敏度：HCV RNA，HIV RNA，HBV DNA与与Qiagen Qiagen 磁珠式核酸提取试剂盒的比较磁珠式核酸提取试剂盒的比较 n nHCV RNAHCV RNA提取比较提取比较 Ct值方法HCV样本1HCV样本2HCV样本3Promega体系平行127.6030.2127.39Promega体系平行227.7230.8427.20Qiagen kit平行127.8639.0028.82Qiagen kit平行227.3333.5828.55HBV DNAHBV DNA提取比较提取比较方法HBV样本1HBV样本2P

5、romega体系平行126.6532.78Promega体系平行226.8432.52Qiagen kit平行126.7032.96Qiagen kit平行226.7132.28提取灵敏度实验提取灵敏度实验n n阳性样本梯度稀释n n国家灵敏度参考品HCV RNAHCV RNA提取提取HCV阳性样本10倍稀释梯度：100,10-1,10-2,10-3,10-4磁珠提取与柱提取法比较（数据见下页）稀释组柱提取磁珠提取10-024.1324.3425.2810-127.1529.2028.5710-231.2333.3432.6410-335.3435.8735.3910-438.1638.073

6、8.69磁珠提取方法与柱提取法及水溶液梯度稀释样本比较磁珠提取与柱提法的提取效果相当。在低浓度样本提取方面，荧光增量与稀释组无显著差异，此方法在去除样本中抑制物方面效果良好。HCV RNAHCV RNA国家标准品检测国家标准品检测10份阳性参考品:P1P10HCV阳性参考品CtHCV阳性参考品CtP134.58P6NDP2ND P736.18P336.96P8NDP434.81P932.16P535.44P1036.73HIV RNAHIV RNA提取提取 HIV阳性样本梯度稀释成1/5，1/25，1/50，1/100和1/200五个浓度，提取RNA，原样本提取后用TE按相同比例稀释，上机比较

7、。稀释组磁珠提取1-28.881/532.0931.291/535.7833.931/5037.1735.591/10038.8336.121/200-37.33 HIV 样本稀释梯度：1/5，1/25，1/50，1/100和1/200HIV核酸国家参考品检测HIV RNA灵敏度和定量参考品：B2B5（至少检出B2-B3）HIV RNA线性参考品：A2A5。HIVHIV RNARNA荧光定量标准曲线荧光定量标准曲线,线形相关系数:0.9907HIV 阳性参考品:P1,P2,P3,P5,P7,P8 HIV阳性参考品CtHIV阳性参考品CtP132.94P526.42P235.98P728.93P337.61P832.55HIV阳性参考品检测中检所中检所HBVHBV核酸定量标准品检测核酸定量标准品检测灵敏度参考品L0L1L2L3L4L5L6理论浓度对数值8.3427.6196.6495.6724.7153.6362.043Ct15.0416.9720.4022.0426.3429.0335.17HBVHBV核酸定量标准品：核酸定量标准品：L0L0L6L6（L0L0L5L5必须检出，必须检出，L6L6仅供参考）仅供参考）HBVHBV核酸定量标准品荧光定量标准曲线核酸定量标准品荧光定量标准曲线