改善植酸酶热稳定性的策略Word文档格式.docx

1、部分植酸酶热稳定性见表1。2蛋白质工程法随着基因工程技术及分子生物学技术的发展,蛋白质工程法逐渐成为人们研究蛋白质稳定性的主要手段。目前在蛋白质热稳定性工程中常用的方法为:1推理设计（rational design ;2同序概念（consensus concept ;3杂合酶（hybrid en-zyme ;4定向进化（directed evolution 。2.1推理设计推理设计主要是把热稳定蛋白浙江大学饲料科学研究所教育部动物分子营养学重点实验室付石军孙建义表1部分植酸酶的热稳定性摘要植酸酶作为一种生物型饲料添加剂对提高饲料中磷的利用率、动物的生产性能以及减轻因动物高磷粪便所导致的环境水污

2、染具有重要意义,但由于其热稳定性差,植酸酶的推广和应用受到限制。本文综述了自然选择法、蛋白质工程法、化学修饰法及生产工艺方面改善热稳定性的策略,并对其研究前景作了展望。关键词植酸酶;热稳定性;自然选择;蛋白质工程;生产工艺中图分类号S816.7文献标识码A文章编号1004-3314（200714-0026-04AbstractPhytase is a new-style enzyme used in monogastric animal feeds.It can increase phosphorus availability ,the performance of animal ,and d

3、ecrease environmental phosphorus pollution.The application of natural phytase is limited due to its thermostability.The strategies of improving phytase thermostability ,with a view to discuss the research prospects were reviewed.Key wordsphytase ;thermostability ;natural selection ;protein engineeri

4、ng ;manufacturing technology 动物营养与热不稳定蛋白的氨基酸序列进行比较,分析究竟是哪些氨基酸对蛋白质的热稳定性起关键作用。卢柏松等（1998对嗜热菌与常温菌的氨基酸组成做了比较,发现嗜热菌氨基酸中亮氨酸（Leu、脯氨酸（Pro、谷氨酸（Glu和精氨酸（Arg含量均高于常温菌,而胱氨酸（Cys、丝氨酸（Ser、苏氨酸（Thr、谷胺酰胺（Gln和天门冬氨酸（Asp含量显著低于常温菌。Pro结构熵小,易折叠,且一经折叠,需要很高的能量才能解开,从而提高蛋白质稳定性。Glu和Arg分别比带同样电荷的氨基酸有更大的侧链,侧链所提供的疏水作用及离子间互相作用能提高蛋白质的稳定

5、性。Leu具有较强的疏水性和较大的侧链。Jaenicki （1996对嗜热菌蛋白与常温菌蛋白进行研究,发现嗜热菌蛋白与常温菌蛋白的大小、亚基结构、螺旋程度、极性大小和活性中心都极相似,但由于构成蛋白质高级结构的非共价力、结构域的包装、亚基与辅基的聚集,以及糖基化作用、磷酸化作用等不尽相同而导致热稳定性不同。事实上,酶的热稳定性受到许多因素的影响,如氨基酸序列、三维结构、辅助因子及pH值等。目前普遍采用的手段是基因定向突变,通过改变某个或几个氨基酸来改变蛋白质结构,提高热稳定性。其中,脯氨酸残基在稳定蛋白质结构和提高酶热稳定性方面具有不可忽视的作用。脯氨酸具有较大的比咯烷环,偏爱-转折或无规卷曲

6、结构,所以只要在主链构象不发生聚变的情况下可在适当的-转折或无规卷曲结构中,通过其刚性的比咯烷环,降低脯氨酸去折叠时的骨架熵和肽链骨架的柔性,从而使周围构象更稳定、牢固。对于植酸酶,可把邻近活性中心处的柔性较大的甘氨酸、苏氨酸等替换为脯氨酸,但注意最好不要替换活性中心的氨基酸,因为脯氨酸有较大的侧链,有可能阻止底物的进入,使植酸酶不表达或表达量少（赵海霞等,2004。2.2同序概念同序概念是一种半推理的方法,是对一组同源蛋白质的氨基酸序列进行比较,以一定的标准程序计算各氨基酸序列,从中选择对每个氨基酸位点最保守的残基,拼成序列,然后将最后确定的氨基酸序列翻译成相应的DNA序列,最后选用合适的表

7、达系统对这个“人造的”目的基因进行表达。该方法具有以下优点:同序基因中的每个给定的氨基酸残基与同源野生蛋白质中相应位点的氨基酸残基至少有一个是适宜进化的,从而减少有害突变的冒险;此方法不需要了解蛋白质的三维结构;不需要进行高通量的筛选。Lehmann等（2000把同序概念应用在真菌植酸酶家族含有13种不同子囊菌类的序列,进行同序比较计算,设计合成了同序植酸酶基因fcp,构建表达载体pFP,在H.polymorpha中表达出同序植酸酶-1。同序植酸酶-1的最适温度增加了1626,而催化性质与亲本植酸酶相似。经定点突变发现在同序植酸酶-1中有5个氨基酸Tyr31、Pro225、Met342、Phe

8、346和Tyr372表现增加同序植酸酶的热稳定性。晶体结构表明,Met342和Phe346氨基酸残基增加疏水侧链的大小,导致更紧密的疏水核;Tyr31和Tyr372由于形成额外的氢键而增加稳定性;Pro225稳定同序植酸酶的环。2.3杂合酶把来自不同酶分子的结构单元（二级结构、三级结构及功能域或整个酶分子进行组合或交换以产生具有所需要性质的优化酶杂合体结构,组合出新酶,并可产生催化自然界不存在的反应的新酶分子为杂合酶。Jermutus等（2001根据黑曲霉（A.niger植酸酶晶体结构,将土曲霉（A. terreus植酸酶表面的一个二级结构-螺旋（66 82区域用A.niger植酸酶上相应长度

9、的一段序列替换,获得了酶活性未变而热稳定性提高的新植酸酶。其原因在于两个不同来源的植酸酶在分子表面-螺旋中氨基酸改变,导致疏水作用,增加热稳定性。同源蛋白稳定性的不同是由于许多在进化中分散在整个序列中单点突变引起的。通过用更稳定或较不稳定相互作用的同源片段改变具有很小稳定性或更多不稳定的相互作用的元素能引起稳定性的改善。2.4定向进化定向进化主要包括多轮随机突变和DNA shuffling技术。多轮随机突变是以目的基因进行第一轮随机突变,然后筛选出最佳突变子作为下一轮突变的亲本,如此循环下去获得性状优良的突变体（Lehmann和Wyss,2001。DNA shuffling技术是由Stemme

10、r（1994提出的,DNA 改组是指DNA分子的体外重组,通过改变单一个或多个基因原有的核苷酸序列,创造新基因,并赋予表达产物以新功能。实际上是一种分子水平上的定向进化,因此,也称为分子育种。该方法可在短时间内通过重组有效的变异体发掘所有可能的重组体与突变序列。该方法虽然在获得有益突变体方面有很大的优势,但有效的筛选方法对试验的成功与否至关重要。3化学修饰法酶的化学修饰作为一种提高酶热稳定性的重要手段,是酶工程研究的重要课题。根据X射线晶体衍射数据,蛋白质分子表面约一半是由疏水氨基酸占据着。从热力学角度看,水溶液中疏水氨基酸与水接触对酶热稳定性不利。因此,通过合适的化学修饰增加酶分子表面的亲水

11、性,将有利于提高酶的热稳定性（Mozhaev等,1988。不过,至今未找到普遍性的修饰规律,目前仅仅建立在分子模拟技术对修饰结果的合理推测上。4生产工艺的改善法4.1添加酶稳定剂通常酶在非常干燥的情况下,构象比较稳定,具有一定的耐热性,而当体系中含有一定水分或者在高温水蒸汽作用下,酶就极易变性失活。究其原因,酶的变性是由其空间三维结构的变化引起的,即构象发生了变化,从而导致酶活性中心的结构受到破坏,使其催化能力降低或丧失。在热作用下,酶蛋白的热作用时间越长,酶失活越严重。氢键在维持酶的空间构象中起着重要的作用,当体系中含有大量的自由水时,就会破坏酶分子内部的氢键,使酶分子构象容易发生变化,酶就

12、易于变性失活。在颗粒饲料制粒过程中酶制剂经历的正是高温、高湿和高压的环境,因此,在改善酶的热稳定性方面,不仅应考虑改善酶的热稳定性,还应考虑提高其耐湿性。多羟基化合物、食用胶、盐、氨基酸等盐类的添加剂能明显的改善酶的热机械稳定性和耐热性。盐类主要存在离子键作用,当酶的活性中心含有离子作为配位体时,盐离子就能稳定酶的构象。另外盐可作为水分子的替代物占据水的位置,排除自由水对酶造成的不稳定化影响。酶液中海藻糖、蔗糖的添加也能改善酶的热稳定性。海藻糖作为一种多元醇化合物,可通过氢键与酶蛋白表面分子相连接,使酶蛋白分子稳定。为了保持液体酶的活力,国内外大多采用在浓缩液中添加金属离子、多元醇、多糖类化合

13、物等方法。4.2制备包被型颗粒包被型饲用植酸酶颗粒酶活高,热稳定性好,在饲料工业中取得了广泛的应用。其制备过程大致如下:基因工程菌发酵获得的植酸酶溶液,经过滤和超滤以后获得植酸酶浓缩溶液,把浓缩溶液与淀粉、水溶性的无机盐和无机物按一定的配比混合,均匀糅合成面团状,经挤压、切割、圆整,制成小颗粒,再经低温气流干燥、筛分,获得直径适中的含酶颗粒。颗粒直径一般控制在0.21.6mm;然后选用一些合适的水不溶物,按一定的比例喷涂在颗粒表面,经低温干燥后制成包被型含酶颗粒。经调质温度85处理30 s,酶活性保留率达到70%左右（陆文清等, 2000。5研究展望植酸酶作为新型生物添加剂,应用范围广,需求量

14、大,而且它对减少环境污染和保护生态环境具有重要意义。今后应深入研究植酸酶基因的结构与热稳定性的关系,对热稳定性基因进行功能定位;综合运用蛋白质热稳定性工程中的各种方法,筛选出可快速、有效获得突变体的;选择合适的酶制剂加工工艺,确保植酸酶在加工过程中损失最小。参考文献1李明刚,郝亚桓,但野利秋.番茄植酸酶分离提纯及其特性研究J.烟台大学学报（自然科学与工程版,1998,11（4:258266.2卢柏松,王国力,黄培堂.嗜热与嗜常温微生物的蛋白质氨基酸组成比较J.微生物学报,1998,38（1:2025.3陆文清,李德发,武玉波.介绍两种提高饲用酶制剂热稳定性的方法J.粮食与饲料工业,2000,1

15、2:3435.4张玉帧,林学政,吴志宏,等.植酸酶高活性菌株的选育及酶性质的初步研究J.山东大学学报（自然科学版,1997,32（4:466471.5赵海霞,王红宁,陈惠.饲用植酸酶热稳定性的研究J.微生物学通报, 2004,31（1:105109.6Jaenicki R.Stability and folding of ultrastable proteins:eye lens crystallins and enzymes from thermophilesJ.The FASEB Journal,1996,10（1:8492. 7Jermutus L,Tessier M,Pasamonte

16、s L,et al.Structure-based chimeric en-zymes as an alternative to directed enzyme evolution:phytase as a test caseJ.J Biotechnol,2001,85（1:1524.8Kerovuo J,Lauraeus M,Nurminen P,et al.Isolation,Characterization, Molecular Gene Cloning,and Sequencing of a Novel Phytase from Bacillus subtilisJ.Applied a

17、nd Environmental Microbiology,1998,64（6:20792085.9Kim Y O,Kim H K,Bae K S,et al.Purification and properties of a ther-mostable phytase from Bacillus sp.DS11J.Enzyme and Microbial Technolo-gy,1998,22:27.10Lehmann M,Kostrewa D,Wyss M,et al.From DNA sequence to im-proved functionality:using protein seq

18、uence comparisons to rapidly design a thermostable consensus phytaseJ.Protein Engineering,2000,13（1:4957. 11Lehmann M,Pasamontes L,Lassen S F,et al.The consensus concept for!黄酮组的肉鸡饲料转化率高于未添加组（P 0.01。王国杰和韩正康（1994报道,给32日龄红布罗肉鸡日粮中添加3mg/kg 大豆黄酮,可提高日增重10.1%（P 0.01;给4556日龄红布罗肉用公仔鸡日粮中添加4.38mg/kg 红三叶总异黄酮,与对

19、照组相比日增重提高5.1%,料重比下降9.2%。同时,王国杰等（1995给大鼠皮下注射大豆黄酮16d ,雄性去势大鼠的RNA 含量比对照组提高15.0%（P 0.05,每克肌肉组织中DNA 含量比对照组下降14.0%（P 0.05,RNA/DNA 比值提高18.7%,表明大豆黄酮的促肌肉生长作用主要是肌纤维的营养性肥大和蛋白质合成代谢加强,而不是加速卫星细胞繁殖的结果。同时,血清尿素氮含量显著下降,说明蛋白质分解代谢下降,动物机体氮储留增加,所以大豆黄酮使雄性动物肌肉蛋白质累积增加与蛋白质合成过程的加强和分解代谢的下降有关。刘燕强和韩正康（1998发现,饲喂大豆黄酮母鸡产蛋率显著提高（P 0.

20、05,且蛋重有提高的趋势,饲料转化率也有所提高。尹靖东等（2002报道,在蛋鸡日粮中添加大豆黄酮或茶多酚可提高产蛋率。5生物类黄酮研究开发的前景近年来,虽然提取、分离生物类黄酮的研究比较多,但对其活性机理、在动物体内吸收代谢机制、稳定性等方面研究仍然较少,如蛋白质对生物类黄酮的减效作用、维生素E 对生物类黄酮的增效作用、类黄酮与肠道菌类的关系等都有待于今后解决。加强这方面的理论研究工作,可以加速生物类黄酮资源的开发与利用,生物类黄酮的开发与利用对于开发新的饲料资源和促进动物生产都有着积极的意义。1戴尧天,张昭,高子芬.刺梨降低鹌鹑血脂和阻断动脉粥样硬化形成的作用J.营养学报,1994,16（2

21、:201204.2胡春,丁霄霖.黄酮类化合物在不同氧化体系中的抗氧化作用研究J.食品与发酵工业,1996,3:4653.3林实秋,陈吉棣.山楂及山楂黄酮预防大鼠脂质代谢紊乱的分子机制研究J.营养学报,2000,22（2:131136.4刘燕强,韩正康.异黄酮植物雌激素-大豆异黄酮对产蛋鸡生产性能及其血液中几种激素水平的影响J.中国畜牧杂志,1998,34（3:910.5王国杰,韩正康,陈伟华.大豆黄酮对大鼠肌肉生长和几种内源激素水平的影响J.动物学研究,1995,16（1:2329.6王国杰,韩正康.红三叶草总异黄酮对小公鸡生长及血清睾酮水平的影响J.动物学研究,1994,15（3:6569.

22、7谢棒祥,张敏红,杜荣,等.类黄酮对肉仔鸡生产性能及脂质代谢的影响J.动物营养学报,2002,14（4:4953.8谢棒祥,张敏红.生物类黄酮的生理功能及其应用研究进展J.动物营养学报,2003,15（2:1115.9尹靖东,齐广海,霍启光.类黄酮对蛋鸡脂类代谢的影响J.畜牧兽医报,2002,33（3:215220.10余杰,陈美珍.亮叶杨桐中类黄酮提取及其抗氧化、抑菌作用的研究J.汕头大学学报,1997,12（2:5258.11张荣庆,韩正康,陈杰,等.大豆黄酮对母猪免疫功能和血清及初乳中GH 、PR L 、SS 水平的影响J.动物学报,1995,41（2:201206.12张荣庆,韩正康.

23、黄酮类化合物对小鼠免疫功能和血中-内啡肽水平的影响J.中国免疫学杂志,1994,10:9192.13Kirk E A ,Herland P S ,Wang S A ,et al.Dietary iso-flavones reduce plas-ma cholesteroland at herosclerosis in C57BL/6mice but not LDLre-ceptor-deficient mice J.J Nutr ,1998,128:954959.通讯地址:山东省滨州市邹平县六和饲料股份有限公司邹平分公司,邮编:256200thermostability engineering

24、 of proteins J.Biochim Biophys Acta ,2000,1543（2:408415.12Lehmann M ,Wyss M.Engineering proteins for thermostability :the use of sequence alignments versus rational design and directed evolution J.Protein technology and commercial enzymes ,2001,12:371375.13Mitchell D B ,Vogel K ,Weimann B J ,et al.T

25、he phytase subfamily of his-tidine acid phosphatases :isolation of genes for two novel phytases from the fungi Aspergillus terreus and Myceliophthora thermophila J.Microbilology ,1997,143:245252.14Mozhaev V V ,Siksnis V ,Melik-Nubarov N S ,et al.Protein stabilization via hydrophilization.Covalent mo

26、dification of trypsin and alpha-chymotrypsin J.Eur J Biochem ,1988,173:147154.15Oh B C ,Chang B S ,Park K H ,et al.Calcium-Dependent Catalytic Ac-tivity of a Novel Phytase from Bacillus amyloliquefaciens DS11J.Biochem-istry 2001,40:96699676.16Pasamontes L ,Haiker M ,Wyss M ,et al.Gene cloning ,purif

27、ication andcharacterization of a heat stable phytase from the fungus Aspergillus fumigatus J.Applied and Environmental Microbiology ,1997;63:16961700.17Stemmer W P C.DNA shuffling by random fragment and reassembly :in vitro recombination for molecular evolution J.Proc Natl Acad Sci USA ,1994,91（22:1

28、074710751.18Tye A J ,Siu F K Y ,Leung T Y C ,et al.Molecular cloning and the bio-chemical characterization of two novel phytases from B.subtilis 168and B.licheniformisJ.Appl Microbiol Biotechnol ,2002,59:190197.19Ullah A H J.Aspergillus ficuum phytase :partial primary structure ,sub-strate selectivity and kinetic characterization J.Prep Biochemistry ,1998,18（4:459471.20Zeikus J G ,Vieille C ,Savchenko.Thermozymes :biotechnology and struc-ture-function relations