薄层扫描法Word文档格式.docx

1、200-400nm，荧光光源为氙灯或汞灯。操作时可通过光源选择杆来变换光源选择 镜的位置；检测器一般为光电倍增管。国外几种主要专用薄层色谱扫描仪表 7-5-2、TLCS 基本原理与方法 薄层扫描法可分为薄层吸收扫描及薄层荧光扫描两类方法。1. 薄层吸收扫描法的基本原理薄层吸收扫描法是用可见光或紫外线的单色光照射展开后的薄层色谱 板，测定薄层色谱斑点 （简称斑点 ）的吸光度 （A）随展开压离 （L） 的变化，而获得 A L 成 A Rf 曲线，即薄层色谱扫描图 （简称扫描图 ）。曲线上的色谱峰峰面积可用于定量分析。由于薄层板存在着明显的散 射现象，而使斑点中物质的浓度与吸光度的关系不服从 Bee

2、r 定律，所以需田 KubelkaMunk（ 古柏尔卡曼克 ）理论来描述。该方程式是薄层扫描法的定量分 析基础。定量校正方法可分为曲线校直法及非线性回归法等。 设薄板固定相的厚度为 X, 入射光的强度为 I.,当透过厚度 x 的的固定相后，照射 在微分薄层厚度 dx 上的入射光强与反射光强分别为 i 和 j 时，如左图。其入射 光强的增量与反射光强的增量分别符合以下两个微分方程： 即光照射到厚度为 x 的薄层后，光被吸收及散射。在入射方向，光强度因为被 吸收与散射而减弱；在入射的反方向，则光强度因散射而增强。解上述方程得：在薄层扫描时，人们只是对进入薄层和由薄层出来的光有兴趣，也即上式的极端情

3、况， x=0 及 x=X 时对比两图很易发现，由于薄层固定相的散射作用使在透射法中所测得的斑点的吸光度产生正偏差，而在反射法测定时产生负偏差。这是因为照射光被散射， 降低了透射率，吸光度增加；散射光增加了反射光光强，增加了反射率，而降 低了吸光度的缘故。其次，还可发现后图比前图的横座标大 25 倍，这说明了反 射法的灵敏度 （响应值 ）比透过法小。1 1 Kubelka-Munk 曲线校直Kubelka Munk 曲线说明了薄层色谱斑点的吸光度与其浓度间呈非线性 关系，该曲线是薄层扫描法进行定量分析的理论依据。曲线处理采用两类方法： 曲线校直法及计算机回归法 （线性及非线性回归 ）。 CS 系

4、列仪器采用前者， CAMAG 仪器采用后者方法。曲线校直法是根据薄层板的散射参数 SX 值，将 Kubelka Munk 曲线校 正为直线，简化 A 与 KX 间的关系，以利于定量分析。用曲线校正法校直 Kubelka Munk 曲线，必须巳知薄层板的 SX 值，Mrck 预制 硅胶板的 SX3，Merck预制氧化铝板的 SX7，Wako预制硅胶 FM（硅胶 GF254） 板的 SX7。国产预制薄层板及自制薄层板，可参考上述数据试调，而后检查 校正是否适宜，修正 SX 值再校，直至 A KX 曲线成直线为止。检查方法如下 图所示。图中点样量显 （横坐标 ）常用单位为 ug/点。应用时应注意：

5、曲线校直法是一种简便的薄层扫描定量校准方法，但比较粗糙，且有 时难于准确知道薄层板的 SX 值。为了降低定量误差， 应使标准品的色谱峰峰面 积与待测品 （供试品 ）的色谱峰面积尽量接近为好。2. 薄层吸收扫描法的扫描方式及条件的选择 薄层吸收扫描法的扫描条件，包括扫描方式、波长及测光方式等。扫描 方式分为直线式及锯齿式扫描。扫描波长的选择至关重要，不仅关系检测灵敏 度，而且关系干扰的排除等。测光方式分为透射式及反射式2.1 扫描方式选择（1）直线扫描直线式扫描是用一光带先照射在薄层板的一端，而后作直线运动至另端。在作直线式扫描时，实际上是光带固定，薄层板相对于光带作直线运动在作直线扫描时，光带

6、的长度对扫描后所得的色诺峰峰面积影响很大，下图说 明了光带越长，所得的色谱蜂面积越小，反之则峰面积越大。光带太长，检测 灵敏度低，光带太短，光带只通过斑点的一部分，所得的蜂面积，不能真实反 砍斑点的吸收情况。因此，正常扫描时，应使光带长度略大于斑点直径。在多 斑点扫描的，光带长度略大于最大斑点直径。为了降低定量误差，应使标准品 斑点的直径与检品斑点的直径尽量接近。样品斑点为带状时，光带长度应约为 样带的 2/3。不规则斑点，用直线式扫描定量，即使光带长度适宜，定量误差仍然较大，因 为所得峰面积还与扫描方向有关。综上所述，直线式扫描较适用于规则圆形薄层色谱斑点及条状薄层色谱斑点的 定量分析。所能

7、测定斑点的大小，以仪器的光带长度为上限。例 CS930 薄层扫描仪，出射狭缝最大长度 （高度 ）为 6mm，只能测定小于 6mm 的斑点。 在作 直线式扫描叫，光带的步进距离 Y 也影响蜂面积。斑点小应选小步进距离， 选择适宜，能降低定量误差。有关 TLC 及 HPTLC 板的光带长度及步进距离的 具体选择见表。（2）锯齿式扫描 用截面积为正方形的光束照射薄层板，光束的运动轨迹为矩齿形。 CS 系列的摆动距阂最大为 30mm，因此锯齿式扫描适用于直径小于 30mm 的斑点。直线式扫在做锯齿形扫描时，由于光束来回通过斑点，吸光度积分值比描大， 重复性较好。锯齿扫描还适用于不规则斑点的定量。虽然扫

8、描方向不同时，所得的色谱峰形 状有差别，但积分值差别较小。机械锯齿式描仪器扫描速度慢是其缺点， 飞点扫描型仪器 （如 CS9000 型薄层 扫描仪 ）则克服了此缺点。（3）双校长法的优点a.可以排除分离度不佳的两个斑点间的相互干扰， 能用于分离度不佳以至 于完全重叠斑点的定量分析。b.可以排除背景污染的干扰，使基线平直。c.可以提高灵敏度。d.可以改变色谱峰的倒正。这些优点的实现，主要取决于波长对的选择。3定量分析方法TLCS 最常用的定量方法是外标法，包括外标一点法和外标二点法。1 外标一点法 标准曲线通过原点（截距为零）时可用外标一点法定量。即只需一种浓度的对 照品溶液，与供试液同板展开，

9、分别测定其峰面积 A,即C待=A标C标/A 待2 外标二点法该法是 TLCS 法中主要的定量分析方法。标准曲线不通过或一种浓度原点时只 能用该法定量，至少需点两种不同浓度两种点样量的对照品溶液，与供试液同板展开，分别测定其峰面积 A ，用对照品求直线方程： A=Km+B, 代入即得例 1 山楂化滞丸中熊果酸的含量测定测定法： 取重量差异项的本品 3g，剪碎，精密称定，加水 10ml，放置使溶散， 滤过，药渣再用水 10ml 洗涤，在室温干燥至松软的粉末状，在 100烘干，连 同滤纸一并至索氏提取器内，加乙醚适量，加热回流提取 4h，提取液回收乙醚至干，残渣用石油醚（ 3060）浸泡 2 次，每

10、次 5ml （浸泡 2min），倾去石油醚，残渣加适量无水乙醇 -三氯甲 烷（3：2）混合溶液，微热使溶解，定量转移至 5ml 容量瓶内，并稀释至刻度， 摇匀，作为供试液。另取熊果酸对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每 1ml 含 0.5mg的溶液。作为对照溶液，精密吸取供试液 6ul及对照品溶液 4ul 与 8ul， 分别交叉点于同一硅胶 G板上，以环己烷 -三氯甲烷 -乙酸乙酯 -甲酸（20:5:8:0.1） 展开，取出，晾干，喷以 10硫酸乙醇溶液，在 110加热 57min，至斑点显 色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，进行薄 层扫描，波长 s=535nm,

11、 R=650nm,分别测量供试品与对照品 A ，计算即得 .本 品每丸含山楂以熊果酸（ C30H48O3）计熊果酸高含量为有光泽的棱柱状 （无水乙醇 ）或细毛样针状结晶 （稀乙醇 ），低含量 为棕黄色或黄绿色粉末，具特殊的气味，是存在于天然植物中的一种五环三萜 类化合物。熔点 283288. 比旋光度 D25 +67.5（C=1，1mol/L 氢氧化钾 醇溶液中）。在 15时，乙醇（ 99%）1毫升可溶解 10毫克，沸腾 1 毫升可溶解 45 毫克。尚易溶于甲醇，丙酮，吡啶，不溶于水和石油醚例 2 香连丸中盐酸小檗碱的含量测定 测定法：取本品适量，研细，取约 0.2g，精密称定，置索氏提取器中

12、，加盐酸 - 甲醇（1：100）的混合液适量， 加热回流提取至提取液无色， 将提取液移至 100ml 量瓶中，用少量上述混合液洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加上述混合液至 刻度，摇匀，精密量取 10ml，置 50ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试 液。另取盐酸小檗碱对照品适量， 精密称定，加甲醇制成每 1ml 含 20ug 的溶液， 作为对照品溶液。 精密吸取供试液 4ul、对照液 2ul 与 6ul，分别交叉点于同一硅 胶 G 板上，以甲苯 -乙酸乙酯 -甲醇-异丙醇 -水（4：2：1：0.2）为展开剂，在 另一槽中加等体积的浓氨试液，预饱和 15min 后，展开，展距约 10cm，取出， 晾干，进行荧光扫描，激发波长： =366nm，测供试品荧光强度与对照品荧光 强度的积分值，计算即得。本品每 1 含黄连以盐酸小檗碱（ C20H18ClNO4）计。盐酸小檗碱是一种异喹啉生物碱。分子式 C20H18NO4+ 。又称黄连素 。存在 于小檗科等 4 科 10 属的许多植物中。小檗碱从乙醚 中可析出黄色针状晶体。 熔点 145。溶于水，难溶于苯、乙醚和氯仿。