1、杂交瘤细胞的筛选:有限稀释法等单克隆抗体的制备和冻存;单克隆抗体的纯化亲本细胞的选择骨髓瘤细胞:一般不分泌抗体,能在体外无限繁殖和连续继代培养,且为HGPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)或TK(胸腺嘧啶核苷激酶)缺陷。多用BALB/C 小鼠的骨髓瘤细胞。淋巴细胞:经过免疫处理的淋巴细胞,多用大鼠或小鼠。免疫方法:对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠体内,可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后,注入到动物体内。细胞融合:将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以2:1或10:1的比例混匀于50ml锥形离心管内,1200rpm离心;10分钟,尽量吸净上清液,用手指轻击管壁,使管底沉淀的细胞铺展成薄层,
2、在室温条件下边轻轻振摇离心管边在60秒钟内逐滴加入50%的PEG 0.5ml,随后静置90秒,再于5分钟内边振摇边逐滴加入510ml不含血清的培液或盐水缓冲液,以终止PEG的作用,再静置10分钟。HAT培养基筛选杂交瘤细胞细胞团块分散后,加HAT溶液,即可加入有饲养细胞的96孔塑料培养板内每孔0.1ml,用HAT选择性培养时隔45天换液,8-10天后可以选择检测。HAT选择系统:HAT是含一定浓度次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)及胸腺嘧啶核苷(T)的一种选择性培养基,其中三种成分与细胞DNA合成有关。5. 受体的主要类型。根据受体蛋白结构、信息转导过程、效应性质、受体位置等特点,对目前已确定的受
3、体可分为四类:(1)离子通道受体这一家族是直接连接有离子通道的膜受体,存在快反应细胞膜上,均由数个亚基组成,每个亚基的一部分共同组成离子通道,起着快速的神经传导作用。当受体激活后,离子通道开放,促进细胞内、外离子跨膜流动,引起细胞膜去极化或超极化,产生兴奋或抑制效应。N胆碱受体、兴奋性氨基酸受体、-氨基丁酸受体等属于这类受体。(2)G蛋白偶联受体这一家族的受体是通过G蛋白连接细胞内效应系统的膜受体。肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、M胆碱、前列腺素及一些多肽类等的受体都属于这类受体。它们通过与不同膜上G蛋白偶联,使配体的信号通过第二信使cAMP、磷酸肌醇、二酰基甘油及Ca2+传至效应器,从而产生效
4、应。这类G蛋白偶联受体的结构具有共同的跨膜结构,在受体与激动剂结合后,只有经过G蛋白的转导,才能将信号传递至效应器。(3)具有酪氨酸激酶活性的受体这一家族是结合细胞内蛋白激酶,一般为酪氨酸激酶的膜受体。当激动剂与细胞膜外的识别部位结合后;细胞内的激酶被激活,在特定部位发生自身磷酸化,再将磷酸根转移到其效应器上,使效应器蛋白的酪氨酸残基磷酸化,激活胞内蛋白激酶,引起胞内信息传递。属于具有酪氨酸激酶活性的受体有胰岛素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、血小板源性生长因子及某些淋巴因子的受体。(4)调节基因表达的受体肾上腺皮质激素、雌激素、孕激素、甲状腺素都是非极性分子,可以自由透过细
5、胞膜的脂质双分子层,与胞内的受体发生结合,传递信息。所有甾体激素受体都属于一个有共同结构和功能特点的大家族。它们都有一个约70个氨基酸残基组成的DNA结合部位。甾体激素受体触发的细胞效应很慢,需若干小时。各种受体都有特定的分布部位和特殊功能,有些受体具有亚型。6. 简述胞饮作用和吞噬作用的主要区别。细胞类型不同:胞饮作用见于几乎所用真核细胞;吞噬作用对于原生动物是一种获取营养的方式,对于多细胞动物这种方式仅见于特殊的细胞(如巨噬细胞、嗜中性和树突细胞)。摄入物:胞饮作用摄入溶液,吞噬作用摄入大的颗粒性物质。胞吞泡的大小不同,胞饮泡直径一般小于150 nm,而吞噬泡直径往往大于250 nm。摄入
6、的过程:胞饮作用是一个连续发生的组成型过程,无需信号刺激;吞噬作用是一个信号触发过程。胞吞泡形成机制:胞饮作用需要网格蛋白形成包被、接合素蛋白连接;吞噬作用需要微丝及其结合蛋白的参与,如果用降解微丝的药物(细胞松弛素B)处理细胞,则可阻断吞噬泡的形成,但胞饮作用仍继续进行。7. 细胞通过分泌化学信号进行通讯主要有哪几种方式?内分泌,由内分泌细胞分泌的信号分子(激素),通过血液循环运送到体内各个部位,作用于靶细胞。旁分泌。局部信号分子通过扩散,作用于邻近靶细胞。自分泌。信号发放细胞和靶细胞为同类或同一细胞。自分泌信号常见于病理条件下,如肿瘤细胞合成和释放生长因子刺激自身,导致肿瘤细胞的增殖失控。
7、通过化学突触传递神经信号:神经递质经突触作用于特定的靶细胞。8. 简要说明G蛋白偶联受体介导的信号通路的主要特点。G蛋白偶联的受体是细胞质膜上最多,也是最重要的倍转导系统,具有两个重要特点:信号转导系统由三部分构成:G蛋白偶联的受体,是细胞表面由单条多肽链经7次跨膜形成的受体;G蛋白能与GTP结合被活化,可进一步激活其效应底物;效应物:通常是腺苷酸环化酶,被激活后可提高细胞内环腺苷酸(cAMP)的浓度,可激活cAMP依赖的蛋白激酶,引发一系列生物学效应。产生第二信使。配体受体复合物结合后,通过与G蛋白的偶联,在细胞内产生第二信使,从而将胞外信号跨膜传递到胞内,影响细胞的行为。根据产生的第二信使
8、的不同,又可分为cAMP信号通路和磷酯酰肌醇信号通路。cAMP信号通路的主要效应是激活靶酶和开启基因表达,这是通过蛋白激酶完成的。该信号途径涉及的反应链可表示为:激素G蛋白偶联受体G蛋白腺苷酸环化化酶cAMP cAMP依赖的蛋白激酶A基因调控蛋白基因转录。磷酯酰肌醇信号通路的最大特点是胞外信号被膜受体接受后,同时产生两个胞内信使,分别启动两个信号传递途径即IP3Ca2+和DGPKC途径,实现细胞对外界信号的应答,因此,把这一信号系统又称为“双信使系统”。9. 信号肽假说的主要内容。分泌蛋白在N端含有一信号序列,称信号肽,由它指导在细胞质基质开始合成的多肽和核糖体转移到ER膜;多肽边合成边通过E
9、R膜上的水通道进入ER腔,在蛋白合成结束前信号肽被切除。指导分泌性蛋白到糙面内质网上合成的决定因素是N端的信号肽,信号识别颗粒(SRP)和内质网膜上的信号识别颗粒受体(又称停泊蛋白DP)等因子协助完成这一过程。10. 简述蛋白质糖基化修饰中N连接与O连接之间的主要区别。P188N-连接与O-连接的寡糖比较特 征N-连接O-连接合成部位合成方式与之结合的氨基酸残基最终长度第一个糖残基糙面内质网来自同一个寡糖前体天冬酰胺至少5个糖残基N-乙酰葡萄糖胺糙面内质网或高尔基体一个个单糖加上去丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸、羟脯氨酸一般1-4个糖残基,但ABO血型抗原较长N-乙酰半乳糖胺等11. 溶酶体膜有何特
10、点与其自身相适应?1)嵌有质子泵,形成和维持溶酶体中酸性的内环境;2)具有多种载体蛋白用于水解的产物向外转运;3)膜蛋白高度糖基化,可能有利于防止自身膜蛋白的降解。12. 简述ATP合成酶的作用机制。ATP合酶包含两部分:F1头部和F0基部。F1头部含有催化位点,F0基部形成一个通道,质子由此通道从膜间隙转运到基质中。ATP酶利用质子动力势,产生构象的改变,改变与底物的亲和力,催化ADP与Pi形成。F1具有三个催化位点,但在特定的时间,三个催化位点的构象不同、因而与核苷酸的亲和力不同。在L构象,ADP、 Pi与酶疏松结合在一起;在T构象底物(ADP、 Pi)与酶紧密结合在一起,在这种情况下可将
11、两者加合在一起;在O构象ATP与酶的亲和力很低,被释放出去。质子通过F0时,引起c亚基构成的环旋转,从而带动亚基旋转,由于亚基的端部是高度不对称的,它的旋转引起亚基3个催化位点构象的周期性变化(L、T、O),不断将ADP和Pi加合在一起,形成ATP。13. 线粒体与叶绿体基本结构上的异同点。相同点:都含有遗传物质DNA和RNA,都能产生ATP,都具有封闭的两层单位膜,外膜含有孔蛋白,通透性高;内膜通透性低通常向内折叠形成线粒体的嵴和叶绿体的类囊体,构成多酶系统行使功能的结构框架。不同点:(1)线粒体是由外膜、内膜、外室、内室构成的。叶绿体由叶绿体膜,类囊体和基质构成。(2)线粒体内膜向内室褶叠
12、形成嵴,内膜和嵴的基质面上有许多带柄的球状小体,即基粒。叶绿体内膜并不向内折叠成嵴,不含电子传递链,内外膜之间形成膜间隙。(3)线粒体内膜以内的空隙为基质腔,充满着基质。叶绿体内膜与类囊体之间是流动性的基质,其中悬浮着片层系统。(4)叶绿体内膜中除基质外,还有由单位膜封闭形成的扁平类囊体,类囊体膜中镶嵌有大小、数量不同的颗粒,捕光系统、电子传递链和ATP合成酶都位于类囊体膜上,集中了光合作用能量转换功能的全部组分。14. 细胞周期中核被膜的崩解和装配过程。在分裂前期末, 核纤层蛋白被磷酸化,核纤层解体,核被膜解体;在分裂末期,核纤层蛋白去磷酸化,重新组装成核纤层,核被膜重建。15. 细胞内以多
13、聚核糖体的形式合成蛋白质,其生物学意义是什么?细胞内各种多肽的合成,不论其分子量的大小或是mRNA的长短如何,单位时间内所合成的多肽分子数目都大体相等。以多聚核糖体的形式进行多肽合成,对mRNA的利用及对其浓度的调控更为经济和有效。16. 简述CDK1(MPF)激酶的活化过程。CDK1激酶的激活首先是CDK要和周期蛋白结合形成复合体,wee1、mik1激酶和CDK激酶催化CDK的第14位的苏氨酸(Thr14)、第十五位的酪氨酸(Tyr15)和第161位的苏氨酸(Thr161)磷酸化。但此时的CDK仍不表现激酶活性(成为前体MPF)。然后,CDK在磷酸酶Cdc25c的催化下,其Thr14和Tyr
14、15去磷酸化,才能表现出激酶活性。17. 简述核被膜的主要功能一方面,核被膜构成了核质天然屏障,它将细胞的核和质两大结构和功能区域:DNA复制RNA转录与加工在核内进行,蛋白质翻译则在局限在细胞质中。这就避免了相互干扰,使生命活动更加秩序井然,同时核被膜还能保护核内DNA避免受到损伤破坏。另一方面,核被膜又不是完全封闭的,核质之间有频繁的物质交换和信息交流,这主要是通过核被膜上的核孔复合体进行的。18. 简述核小体的结构模型核小体的结构要点每个核小体单位包括约200bp的DNA、一个组蛋白核心和一个H1。由H2A、H2B、H3、H4各两分子形成八聚体,构成盘状核心颗粒; H3、H4形成4聚体,
15、位于颗粒中央; H2A、H2B二聚体分别位于两侧。DNA分子以左手螺旋缠绕在核心颗粒表面,每圈80bp,共1.75圈,约146bp,两端被H1锁合,H1 结合20bp DNA.相邻核心颗粒之间为一段60bp的连接线DNA(linker DNA),典型长度60bp。组蛋白与DNA是非特异性结合,核小体具有自主装性质。19. 内共生起源学说内共生起源学说:认为线粒体和叶绿体分别起源于原始真核cell内共生的细菌和蓝藻。线粒体来源于细菌,即细菌被真核生物吞噬后,在长期共生过程中,通过演变,形成了线粒体。叶绿体来源于蓝藻,被原始真核cell摄入胞内,在共生关系中,形成了叶绿体。主要论据:线粒体和叶绿体
16、的基因组在大小、形态和结构方面与细菌的相似。线粒体核叶绿体有自己完整的蛋白质合成系统,能独立合成蛋白质。线粒体和叶绿体的两层被膜有不同的进化来源,外膜与内膜的结构和成分差异很大。线粒体和叶绿体能以分裂的方式进行繁殖,这与细菌的繁殖方式类似。线粒体和叶绿体能在异源细胞内长期生存。线粒体的祖先很可能来自反硝化副球菌或紫色非硫光合细菌。发现介于包内共生蓝藻与叶绿体之间的结构-蓝小体,其特征在很多方面可作为原始蓝藻向叶绿体演化的佐证。不足之处:a.从进化角度:如此解释在代谢上明显占优势的共生体反而将大量的遗传信息,转移到宿主cell中,不能解释细胞核是如何进化来的,即原核cell如何演化为真核cell
17、。b.线粒体和叶绿体的基因组中存在内含子,而真细菌原核生物基因组中不含有内含子,不能解释其内含子从何而来。20. 核孔复合体的功能和其运输特性功能:通过核孔复合体的主动运输 亲核蛋白与核定位信号 亲核蛋白入核转运的步骤 转录产物RNA的核输出运输特性:核孔复合体是一种特殊的跨膜运输蛋白复合体,并且是一个双功能、双向性的亲水性核质交换通道,双功能表现在它有两种运输方式:被动扩散与主动运输;双向性表现在既介导蛋白质的入核转运,又介导RNA、核糖核蛋白颗粒(RNP)的出核转运。被动扩散:孔有效直径10nm左右,扩散速度与分子量成反比。小于5103的可自由进入,大于60103的球蛋白不能进入。核孔复合
18、体对主动运输的选择性A.对颗粒大小的限制,一般可达10-20nm,表明核孔复合体的有效直径是可以调节的。B.主动运输是信号识别和载体介导的过程,需要ATP。C.具有双向性。21. 怎样证明核孔复合体运输是需能过程。22. 简述DNA构型的生物学意义沟(特别是大沟)的特征在遗传信息表达过程中起关键作用。沟的宽窄及深浅影响调控蛋白对DNA信息的识别。三种构型的DNA处于动态转变之中。DNA二级结构的变化与高级结构的变化是相互关联的,这种变化在DNA复制与转录中具有重要的生物学意义。23. 组蛋白进化上的特点及其意义特点:真核生物染色体的基本结构蛋白,富含带正电荷的Arg和Lys等碱性氨基酸,属碱性
19、蛋白质,可以和酸性的DNA紧密结合(非特异性结合);没有种属及组织特异性,在进化上十分保守。可分为两类:一类是高度保守的核心小体组蛋白包括H2A、H2B、H3、H4四种;另一类是可变的连接组蛋白即H1组蛋白。意义?:核小体组蛋白的结构是非常保守,特别是H4。核心组蛋白高度保守的原因可能有两个:其一是核小体组蛋白中绝大多数氨基酸都与DNA或其它组蛋白相互作用,可置换而不引起致命变异的氨基酸残基很少;其二是在所有的生物中与组蛋白相互作用的DNA磷酸二脂骨架都是一样的。四种核小体组蛋白通过C端疏水的氨基酸相互结合,N端带正电荷的氨基酸向外伸出,与DNA分子结合,使DNA分子缠绕在组蛋白核心周围,形成
20、核小体。尾部含有大量赖氨酸和精氨酸残基,为组蛋白翻译后进行修饰的部位,如乙酰化、甲基化、磷酸化等。H1不仅具有属特异性,而且还有组织特异性,所以H1是多样性的。24. 简述三种基本核仁组分及其功能纤维中心(FC):是被致密纤维包围的一个或几个低电子密度的圆形结构,主要成分为RNA聚合酶和rDNA,这些rDNA是裸露的分子,可能是NORs在间期核的副本。致密纤维组分(DFC):呈环形或半月形包围FC,由致密的纤维构成,是新合成的RNP(指结合蛋白质的rRNA),转录主要发生在FC与DFC的交界处。颗粒组分(GC):由直径15-20 nm的颗粒构成,是正在加工、成熟的核糖体亚单位的前体颗粒。25.
21、 核孔复合体的机构模型核孔复合体主要有下列结构组分:胞质环:位于核孔边缘的胞质面一侧,又称外环,环上有8条短纤维对称分布伸向胞质。核质环:位于核孔边缘的核质面(又称内环),环上8条纤维伸向核内,并且在纤维末端形成一个小环,使核质环形成类似“捕鱼笼”的核篮结构。辐:由核孔边缘伸向核孔中央,呈辐射状八重对称,该结构连接内、外环并在发挥支撑及形成核质间物质交换通道等方面起作用。可进一步分为三个结构域:柱状亚单位、腔内亚单位、环带亚单位。中央栓:位于核孔的中心,呈颗粒状或棒状,又称为中央颗粒。26. 简述非组蛋白与DNA相互作用的主要结构模型a螺旋-转角-a螺旋模式蛋白质形成对称的同型二聚体,每个单位
22、由20个氨基酸的小肽组成,两个a螺旋相互连接成转角。羧基端的a螺旋负责识别DNA大沟的特异碱基信息,另一个螺旋与磷酸戊糖链骨架接触。锌指模式 每个锌指单位是一个DNA结合结构域,由30个左右氨基酸残基组成,其中一对半光氨酸和一对组氨酸与Zn2+形成配位键,锌指的C端形成a螺旋负责与DNA结合。亮氨酸拉链式模式 蛋白的肽链羧基端约35个氨基酸残基有形成a螺旋的特点,每两圈(7个氨基酸残基)有一个亮氨酸残基。A螺旋一侧的亮氨酸排成一列,两个蛋白质分子的a螺旋间靠亮氨酸残基间疏水作用力形成一条拉链状结构。螺旋环螺旋结构模式 40-50个氨基酸组成两个两性a螺旋,中间被一个或几个转角组成的环分开,每个
23、a螺旋由15-16个氨基酸残基组成,有几个保守的氨基酸。HMG框架结构模式是由a螺旋组成的结构模式,有弯曲DNA 的能力,通过弯曲DNA,促进与邻近位点相结合的其它转录因子的相互作用而激活转录。27. 简述核糖体r蛋白的进化上的特性 同一生物中不同种类的r蛋白的一级结构均不相同,在免疫学上几乎没有同源性。不同生物同一种类r蛋白之间具有很高的同源性,并在进化上非常保守。 蛋白质结合到rRNA上具有先后层次性。核糖体的重组装是自我装配过程。16SrRNA的一级结构是非常保守的。16SrRNA的二级结构具有更高的保守性:臂环结构。rRNA臂环结构的三级结构模型。蛋白质合成过程中很多重要步骤与50S核
24、糖体大亚单位相关。28. r蛋白质的主要功能对rRNA 折叠成有功能的三维结构是十分重要的;在蛋白质合成中, 某些r蛋白可能对核糖体的构象起“微调”作用;在核糖体的结合位点上甚至可能在催化作用中, 核糖体蛋白与rRNA共同行使功能。29. 核骨架结合序列的基本特征和功能:核骨架结合序列的基本特征:富含AT;富含DNA 解旋元件;富含反向重复序列含有转录因子结合位点。为DNA的复制提供支架。是基因转录加工的场所有RNA聚合酶的结合位点,RNA的合成在核骨架上进行。与染色体构建有关。30. 核纤层与中间纤维之间的共同点 两者均形成10nm纤维;两者均能抵抗高盐和非离子去垢剂的抽提; 某些抗中间纤维
25、蛋白的抗体能与核纤层发生交叉反应;LaminA和LaminC的cDNA克隆推导出核纤层蛋白的氨基酸顺序与中间纤维蛋白高度保守的-螺旋区有很强的同源性, 说明核纤层蛋白是中间纤维蛋白。31. 细胞凋亡与坏死的主要区别?细胞凋亡细胞坏死单细胞丢失细胞成群丢失细胞膜完整性保持到晚期细胞膜完整性早期即丧失细胞膜内陷将细胞分割成凋亡小体细胞肿胀,溶解不发生炎症反应发生炎症反应被邻近正常细胞或吞噬细胞所吞噬被巨噬细胞所吞噬溶酶体完整溶酶体裂解染色质凝聚呈半月状稀疏呈网状细胞凋亡过程中,整个细胞固缩,细胞膜反折,包裹断裂的染色质片段或者细胞器,然后逐渐分裂,形成众多的凋亡小体,凋亡小体则为邻近的细胞所吞噬,
26、整个过程中,细胞膜的整合性保持良好,死亡细胞的内容物不会逸散到细胞外环境中,不引发炎症。在细胞坏死时,细胞体积膨胀,细胞膜产生渗漏,细胞的内容物释到胞外,导致炎症。细胞坏死时病理性变化,丹凋亡通常是生理性变化。32.为什么说线粒体和叶绿体是半自主性细胞器?线粒体和叶绿体中有DNA和RNA、核糖体、氨基酸活化酶等。这两种细胞器均有自我繁殖所必需的基本组分,具有独立进行转录和转译的功能。线粒体和叶绿体的绝大多数蛋白质是由核基因编码,在细胞质核糖体上合成的。细胞核与发育成熟的线粒体和叶绿体之间存在着密切的、精确的、严格调控的生物学机制。在二者协同作用的关系中,细胞核的功能更重要,一方面它提供了绝大部
27、分遗传信息;另一方面它具有关键的控制功能。也就是说,线粒体和叶绿体的自主程度是有限的,而对核遗传系统有很大的依赖性。因此,线粒体和叶绿体的生长和增殖是受核基因组及其自身的基因组两套遗传系统的控制,所以称为半自主性细胞器。33.非共生起源学说 根据1974年Uzzell等人的观点,在进化的最初阶段,原核细胞的基因组附近的质膜内陷形成双层膜,分别将基因组包围在这些双层膜的结构中,从而形成了原始的线粒体、叶绿体和细胞核等细胞器。在进化过程中进一步发生了分化,如线粒体和叶绿体的基因组丢失一些基因;细胞核的基因组则有了高度发展;质体发展了光合作用功能;线粒体则演变为专具呼吸功能的细胞器,于是逐渐形成了现
28、在的真核细胞。成功之处:解释了真核细胞核被膜的形成与演化的渐进过程。实验证验不多;无法解释为何线粒体,叶绿体与细菌在DNA分子结构和蛋白质合成性能上有那么多相似之处;对线粒体和叶绿体的DNA酶,RND酶和核糖体的来源也很难解释。真核细胞的细胞核能否起源于细菌的核区。34.染色体的骨架-放射换结构模型非组蛋白构成的染色体骨架和由骨架伸出的无数的DNA侧环。30nm的染色线折叠成环,沿染色体纵轴,由中央向四周伸出,构成放射环。由螺线管形成DNA复制环,每18个复制环呈放射状平面排列,结合在核基质上形成微带。微带是染色体高级结构的单位,大约106个微带沿纵轴构建成子染色体。35.简述核糖体亚单位的组
29、装过程新合成的45SrRNA很快与蛋白质形成RNP复合体(80S的RNP),45SrRNA甲基化以后经RNA酶裂解为2个分子,18SrRNA和32SrRNA,后者再裂解为28SrRNA的5.8SrRNA。成熟的rRNA仅为45SrRNA的一半,丢失的大部分是非甲基化和GC含量较高的区域。5S rRNA合成后被转运至核仁区参与大亚基的装配。36.IF装配与MF、MT装配相比的特点IF装配的单体是纤维状蛋白(MF,MT的单体呈球形)。反向平行的四聚体导致IF不具有极性。IF在体外装配时不需要核苷酸或结合蛋白的辅助,在体内装配后,细胞中几乎不存在IF单体(但IF的存在形式也可以受到细胞调节,如核纤层的装配与解聚)。37.简述细胞凋亡的形态学特征?(1)凋亡起始:该时期特征主要为:骨架杂乱,细胞间接触消失,细胞间粘附力下降;细胞质和核浓缩,显微镜下观察可发现
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