籽瓜瓤黄酮类化合物的提取及抗氧化活性的研究Word文件下载.docx

1、1.2.4 籽瓜瓤黄酮提取物抗氧化性能的研究 41.2.4.1 还原力的测定 41.2.4.2 清除超氧阴离子自由基能力的测定 51.2.4.3 清除ABTS自由基能力测定 51.2.4.4 清除DPPH自由基能力测定 51.2.4.5 清除羟基自由基能力的测定 62 结果与分析 62.1标准曲线的绘制结果 62.2还原力的测定结果 72.3清除超氧阴离子自由基能力的测定结果 72.4清除ABTS自由基能力测定结果 82.5清除DPPH自由基能力测定结果 82.6 清除羟基自由基能力测定结果 93讨论 104 结论 105参考文献 11致谢 12籽瓜瓤中黄酮类化合物抗氧化活性的研究冯世红（甘肃

2、农业大学 食品科学与工程学院 甘肃省兰州市 730070）摘要：黄酮具有降血糖、降血脂、抗氧化、消除体内自由基、抗衰老、增强机体免疫力等作用1。现代医学研究表明黄酮类物质作为抗氧化剂还广泛应用于食品中。本实验以籽瓜瓤为原料，采用超声波乙醇浸提法从籽瓜瓤中提取黄酮类化合物，并对提取液的抗氧化活性能进行了研究。研究结果显示籽瓜瓤黄酮提取液对羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH、ABTS四种自由基均具有较好的清除效果，其最大清除率分别为： 65.89%、96.44%、92.18%、48%，并且具有较好的还原能力，在700nm处，当籽瓜瓤黄酮提取液浓度为0.1mg/ml时，对应吸光度为0.198。籽

3、瓜瓤黄酮类化合物具有一定的抗氧化性和还原能力，是一种天然抗氧化剂。 关键词：籽瓜；黄酮；抗氧化性 Study on the antioxidant activity of flavonoids in seed melonFeng Shi-hong （College of foodscience and Engineering Gansu Agricultural University Lanzhou Gansu 730070）Abstract: Flavonoids have an effect of hypoglycemic, hypolipidemic, anti arrhythmia,

4、such as reducing myocardial oxygen consumption, increasing the coronary artery and cerebral blood flow, blood sugar, antioxidant, elimination of free radicals, anti aging, strengthen the body immunity. In this experiment, the seed pulp was taken as raw material, the ultrasonic extraction of Flavonoi

5、ds from seed melon, extract antioxidant activity were studied. Results showed that the liquid has good scavenging effect on hydroxyl radical, superoxide anion free radical, DPPH, ABTS four kinds of radical extraction of seed melon flavonoids.The maximum clearance rates were: hydroxyl free radicals,

6、superoxide anion free radical is 65.89 to 96.44, ABTS is 48, DPPH is 92.18, and has reduced better, at 700nm, when the concentration of flavonoids extracted from seed melon is 0.1mg/ml, the corresponding absorbance is 0.198. And seed melon has antioxidant activityand reducingcapacity,is a natural an

7、tioxidant.Key word: Seed melon; Flavonoids; Extraction前言籽瓜，属低糖瓜类，形状大小与西瓜类似，略比西瓜小。籽瓜的种类较多，比较常见或种植比较广泛的有中国甘肃兰州籽瓜，俗称“打瓜”（本研究所用原料）。现代医学证明，籽瓜富含果酸、核黄酸、尼可酸等18种氨基酸、维生素、黄酮、多种天然维生素、活性功能因子、生物碱、瓜氨酸、多肽植物蛋白溶酶及多种微量元素，具有利尿、润肺、健脾的功效因子，具备低脂、低糖、低热的特性，对糖尿病、肥胖症也有辅助医疗作用。籽瓜性温，有暖胃祛寒、滋嫩肌肤、清肾排毒等功效。能够调理增强人体免疫功能，提高人体抗病力，溶蚀软化血管

8、，祛除胃寒，净化体内毒素2。因而，瓜瓤与液汁是一种良好的保健食品。黄酮，是黄酮类化合物的总称，泛指两个具有酚羟基的苯环（A-与B-环）通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮，目前关于黄酮类化合物抗氧化性的研究在国内外已经有好多报道，章荣华等经过对大小鼠多个体内动物实验证实，竹叶黄酮具有提升体内抗氧化水平的作用3。郑公铭等对荔枝皮进行食品抗氧化研究，结果表明，成熟荔枝皮和未成熟荔枝皮提取物均有很强的抗氧化活性，经层析、化学显色推断，抗氧化成分主要是黄酮类物质。唐津忠研究表明，金莲花的提取物中含丰富的黄酮类化合物，且其中的黄酮类化合物对猪油有明显的抗氧化作用，黄酮类

9、化合物的添加量在试验剂量范围内与其抗氧化性呈正相关，当添加量为0.5 时，金莲花中黄酮类化合物的抗氧化性能可与BHT相媲美，同时还研究了提取物与V c的协同抗氧化作用3。赵雪梅通过化学发光法对胡柚皮黄酮类化合物粗提物、黄酮类化合物单体及标准样品的对照实验表明胡柚皮中黄酮类化物是一种良好的自由基清除剂，黄酮类化合物作为自由基清除剂存在构效关系。许钢等研究了从4种大麦麦叶中提取的黄酮类化合物对超氧阴离子自由基、羟自由基的清除作用，研究显示随着黄酮浓度的增加，清除率呈上升趋势。目前关于籽瓜瓤中黄酮抗氧化性的研究尚未见报道。本研究对籽瓜瓤中黄酮类化合物的抗氧化性能力作了初步探讨，检测了籽瓜瓤中黄酮类化

10、合物对羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH、ABTS四种自由基的清除效果以及还原力的测定，以其寻找到一种天然抗氧化剂，扩大籽瓜在新领域中的应用范围，提高其经济效益。1 材料与方法1.1材料与设备1.1.1 原料籽瓜（购于桃海市场，产于甘肃兰州）1.1.2 试剂铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、高硫酸钾、ABTS、无水乙醇、芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、DPPH（1,1- 二苯基 -2- 苦基苯肼）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、吩嗪甲酯硫酸盐（PMS）、氯化硝基四氮唑（NBT）、双氧水、抗坏血酸（VC）、水杨酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸等均为分析纯。1.1.3 仪器设备电热

11、鼓风干燥箱：BPG-9140A（上海恒科技有限公司）；高速万能粉碎机：FW100（泰斯特仪器有限公司）；分析天平：Sartorius BS224S（德国赛多利斯）；超声波清洗器： KQ-100DB（昆山市禾创超声仪器有限公司）；高速冷冻离心机： ALLEGRATM64R（美国Beckman 公司）；循环水氏多用真空泵:SHB-III（郑州长城科贸有限公司）；旋转蒸发仪：N-1001（上海爱郎仪器有限有限公司）；紫外光分光光度计：TU-1810（北京普析通用仪器有限责任公司）1.2 实验方法1.2.1 实验工艺流程原料预处理切片（大约厚1cm）干燥（60，8h）粉碎过60目筛干燥（60至恒重）石

12、油醚脱脂超声波浸提（50,720Hz,30min）真空抽滤浓缩（85,2-3h）样品测定抗氧化活性（羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH、ABTS）及还原能力1.2.2 操作要点1.2.2.1 原料处理新鲜籽瓜经过清洗、去皮、除去瓜子、然后大约切1cm厚。1.2.2.2 干燥和粉碎在阳光下摊凉30min后,于60的温度下在干燥箱内干燥610h至恒重，用高速万能粉碎机进行粉碎并过60目筛 ，置于干燥器内备用。1.2.2.3 石油醚脱脂准确称取100g籽瓜瓤粉末置于1L的烧瓶中，加入400ml蒸馏水，再加入500ml石油醚经搅拌后在常温下静置10h,然后去掉上层石油醚，烘干至恒重备用【3】。1.

13、2.2.4 黄酮类化合物的提取取100g籽瓜瓤粉末置于1L的烧瓶中，加150ml95%乙醇，浸泡20min，在50条件下，720Hz超声波提取30min，用循环水氏多用真空泵真空抽滤，取滤液于烧杯中，将滤渣再加150ml 95%乙醇，浸泡20min，再次超声波提取30min，抽滤，合并两次滤液在圆底烧瓶中，不得超过烧瓶容积2/3以上，将烧瓶接在旋转蒸发仪上，调至水温80进行减压回收（水浴加热），当烧瓶中乙醇至滤液仅剩10-15ml为止，取将浸提液过滤23次，收集滤液并进行减压浓缩，最后得到高纯度的黄酮,密封保存 4。1.2.3 芦丁标准液配制及标准曲线的绘制1.2.3.1 芦丁标准液配制将芦丁

14、标准品置于干燥洁净的称量瓶中，置于干燥箱中。在120下恒重1.5h，取出置于干燥器中冷却，冷却后准确称取0.0133g芦丁置于烧杯中，用60%的乙醇溶解后移入50mL容量瓶中，定容，摇匀备用5。1.2.3.2 标准曲线绘制分别准确移取芦丁液0.00 mL ，1.00mL，2.00 mL，3.00 mL，4.00 mL, 5.00mL于10ml容量瓶中，加入0.80mL 5%亚硝酸钠溶液，放置6min后，加入0.80mL 10%硝酸铝溶液，放置6min后，加入5mL 4%氢氧化钠溶液，用70%乙醇定容至10mL，再放置10min，以试剂为参比，在最大吸收波长下分别测其吸光度6。1.2.4 籽瓜瓤

15、黄酮提取物抗氧化性能的研究1.2.4.1 还原力的测定参照赵雪梅等人的方法，在离心管中加入籽瓜瓤总黄酮提取液2.5mL，磷酸盐缓冲液2.5ml。1的铁氰化钾溶液25mL，混匀，在50恒温条件下保温20min，再加入10的三氯乙酸溶液25mL，然后3000rmin离心10min。取上清液5mL加入蒸馏水5mL以及01的氯化铁溶液1mL，在700nm处测定溶液吸光度，其吸光度越高，则还原力越高7。1.2.4.2 清除超氧阴离子自由基能力的测定用pH8.0，浓度50mol/L的Tris-HCl缓冲液将籽瓜瓤黄酮粗提物稀释成不同的浓度梯度，各取1.5ml不同梯度黄酮溶液，然后依次加入0.5ml NBT

16、（300mol/L，以pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制），0.5mlNADH（468mol/L，以pH8.0的 Tris-HCl缓冲液配制），0.5ml PMS（60mol/L，以pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制），混匀后在25中水浴5min，取出在波长520nm处测定吸光度，空白对照组以缓冲液代替黄酮溶液8。清除率E（%）（超氧阴离子）=（A0A1）/A0100式中：E为黄酮对超氧阴离子的清除率（%）；A1为籽瓜瓤提取物吸光度；A0为空白对照吸光度。1.2.4.3 清除ABTS自由基能力测定参考Re和Gao等人的方法，将7mmolLABTS和2.45mmolL的高硫酸钾混合，在室

17、温、避光的条件下静置过夜，将生成ABTS自由基溶液,用磷酸盐缓冲液（pH7.4）稀释，使其在30，710nm波长下的吸光度为O7002，即得到ABTS+自由基工作液。将籽瓜瓤黄酮提取液用乙醇醇配制成一系列不同的浓度，取0.1mL籽瓜瓤提取液加入1.5mLABTS自由基工作液，混合，放置6min后，在520nm处测定吸光度。每份样品平行操作3次，取平均值。计算清除率9、11。1.2.4.4 清除DPPH自由基能力测定参照杨方美等人的方法，将籽瓜瓤黄酮提物稀释成不同的浓度梯度，各取2ml上述浓度的黄酮溶液于试管中，再加入2ml浓度为0.04mg/ml的DPPH溶液，混合均匀，反应20min，350

18、0r/min离心分离 10min，取上清液在波长517nm处测其吸光度为Ai；另各取2ml上述浓度的黄酮溶液于试管中，分别加入无水乙醇2ml，反应20min，3500r/min 离心分离10min，取上清液在波长520nm 处测其吸光度为Aj；以2ml 0.04mg/mlDPPH和2ml无水乙醇反应做为参比，其吸光度记为A012。清除率E（%）（DPPH）=（AiAj）/A0E（DPPH）为黄酮对DPPH自由基的清除率（%）；A0为2mlDPPH溶液+2ml无水乙醇的吸光度；Ai为2mlDPPH溶液+2ml黄酮溶液的吸光度；Aj为2ml无水乙醇+2ml黄酮的吸光度13。1.2.4.5 清除羟基

19、自由基能力的测定将籽瓜瓤黄酮提取物配制成不同浓度梯度，各取2ml上述浓度的黄酮溶液，依次加入2ml 6mmol/L的FeSO4、2ml 6mmol/L的H2O2，混匀后静置10min，再加入2ml 6mmol/L水杨酸，混匀，静置30min，在波长520nm处测其吸光度记为Ai，当用双蒸水代替水杨酸时的吸光度记为Aj。空白对照组以蒸馏水代替黄酮溶液吸光度记为A014。清除率E（%）（OH）=（AiAj）/A0E（OH）为羟自由基的清除率（%）；Ai为籽瓜瓤黄酮溶液的吸光度；A0为空白吸光度；Aj为无水杨酸参加反应时籽瓜瓤黄酮的吸光度。2 结果与分析2.1标准曲线的绘制结果参考杨方美等人的方法，

20、在520nm波长下测定不同浓度的芦丁标准液的吸光度，以芦丁溶液浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度纵坐标，绘制标准曲线，结果见图1。图1 吸光度与芦丁标准溶液浓度的关系图实验结果表明芦丁含量在00.133mg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。2.2还原力的测定结果 一个物质清除自由基能力的大小跟其还原力的大小是分不开的，黄酮类化合物可络合氧化的过度金属离子，如Fe3+、Cu2+等。本实验测定了籽瓜瓤黄酮提取液的还原力，实验结果见图2图2 籽瓜瓤总黄酮还原力测定结果结果显示随着黄酮提取液浓度的增高，吸光度越来越大，说明其还原力越强。当黄酮浓度达到0.1mg/ml时，吸光度达到最高0.183。2

21、.3清除超氧阴离子自由基能力的测定结果本实验在520nm处测定了籽瓜瓤黄酮化合物对超氧阴离子自由基的清除效果，实验结果见图2图3 籽瓜瓤总黄酮对清除超氧阴离子自由基能力的测定结果关系图结果显示提取液对超氧阴离子自由基的清除作用随着其黄酮浓度的增大而显著提高，但从0.02mg/ml以后其清除效果随浓度的增加没有明显提高，说明黄酮浓度在一定范围内对超氧阴离子自由基有良好的清除作用。2.4清除ABTS自由基能力测定结果本实验在520nm处测定籽瓜瓤黄酮提取液的不同浓度对应下测其对ABTS自由基的清除作用，结果如图4 图4 籽瓜瓤总黄酮对清除ABTS自由基能力的测定结果关系图 实验结果显示，在一定的籽

22、瓜瓤黄酮提取物浓度范围内，提取液对ABTS自由基的清除作用较为明显，并且随着浓度的增加，清除效果越来越好，但当籽瓜瓤黄酮提取物浓度在0.5mg/ml时，其变化不太明显。总结说明籽瓜瓤黄酮提取物在一定的浓度范围内对ABTS自由基的清楚作用较强。2.5清除DPPH自由基能力测定结果 本实验在520nm处测定了籽瓜瓤黄酮提取物对DPPH自由基的清除作用，在不同的籽瓜瓤黄酮浓度梯度下测定其对DPPH自由基的清除效果，结果如图5图5 籽瓜瓤总黄酮对清除DPPH自由基能力的测定结果关系图 实验结果显示，随着籽瓜瓤黄酮浓度的增高，对DPPH自由基的清除效果在不断增高，但在黄酮浓度为0.00-0.1mg/ml

23、时，其增长幅度加大，在黄酮浓度为0.1mg/ml以后，曲线逐渐平缓，增幅不是很明显。变化转折点浓度为0.1mg/ml，清除率为89.65%。2.6 清除羟基自由基能力测定结果本实验在520nm处测定了籽瓜瓤黄酮提取物在不同浓度时的吸光度，经过计算得籽瓜瓤黄酮提取物对羟基自由基的清除作用效果见图6图6 籽瓜瓤总黄酮对清除羟基自由基能力的测定结果关系图 实验结果显示，在520nm分光光度下，籽瓜瓤中黄酮类化合物对羟基自由基的清除作用效果显著随黄酮浓度的增高而持续增大，说明其对羟基自由基的清除作用较强，在一定的范围内，清除率与黄酮浓度有一定的线性关系，当黄酮浓度在0.56时，其清除率可高达65.89

24、%。3 讨论黄酮类物质具有降血糖、降血脂、降血糖、抗氧化、消除体内由基、抗衰老、增强机体免疫力等作用。本实验采用超声波乙醇浸提法对籽瓜瓤中的黄酮化合物进行了提取，并对提取液对羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH、ABTS四种自由基的清除效果以及还原能力大小进行了测定，实验结果证明籽瓜瓤黄酮提取物对羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH、ABTS四种自由基均有清除作用，但是在一定的浓度范围内，籽瓜瓤黄酮提取物对DPPH自由基的清除效果没有对其他自由基清除效果好，毕先琴13等对从金汤匙中提取的黄酮的抗氧化活性进行了研究，研究显示金汤匙黄酮提取物对DPPH自由基的清除作用比较强。而吴琼英14等用超

25、声波辅助方法对柚皮黄酮进行了提取，并对其抗氧化性进行了研究，其研究与我们的实验结果基本相同。4结论 本实验结果说明籽瓜瓤黄酮提取物具有一定的抗氧化性，是一种天然抗氧化剂。其对Fe3+的还原能力也随着黄酮浓度的不断增高而增强，也说明籽瓜瓤黄酮提取物也具有一定的还原能力。研究结果可以扩大籽瓜的应用范围，预测其会有较好的经济效益。5 参考文献1 章荣华,傅剑云,徐彩菊等.竹叶黄酮提取物抗氧化作用研究J. 中药药理与临床.2004.20 （2）:22-23.2 冯磊,沈健,植物药理药学的作用研究J. 现代康复,1999,3（3）:334-336.3 马世玉,李莉,吴基良等. 竹叶提取液对小鼠的抗氧化作

26、用J. 中国临床药理学与治疗学, 2004, 9（5:585-587 .4 郑公铭,义志忠,吴培荣等. 荔枝皮抗氧化性研究J. 精细化工, 2001,19 （8）:471-473.5 姚明兰,周建新,孙明等.发酵豆粕中异黄酮的抗氧化性研究J. 中国油膊,2003.28（5）:67-68.6 唐津忠,鲁晓翔,陈瑞芳. 金莲花中黄酮类化合物的提取及其抗氧化性研究J. 食品科学,2003.24（6）. 88.7 赵雪梅,叶兴乾.胡柚皮中黄酮化舍物提取及抗氧化性研究J. 果树学报, 2003,20（4）:261-265.8 张英,吴晓琴,俞卓裕等. 竹叶和银杏叶总黄酮含量及其抗自由基活性的比较研究J.

27、 中国中药杂志, 2002,27（4）: 254-257.9 LIUF.OOIVEC.CHANGST. Free radicals scavenging activity of mushroom polysaccharide extractsJ. Life Sci, 1997, 60: 763-771.10 丰永红,于淑娟,李国基等. DPPH法测甘蔗提取物抗氧化活性研究J. 甘蔗糖业, 2003（1）: 31-33,50.11 杨方美,王林,胡秋辉等.鼠尾藻多糖的制备及其抗氧化活性J. 食品科学,2005,26（2）:224-227.12 张兰杰,候冬岩,辛广等. D- 氨基葡萄糖盐酸盐的制

28、备及抗氧化特性的研究J. 食品科学,2007,28（4）: 103-105.13 毕先琴,李璐,杨申明等. 彝药野坝子花总黄酮的提取及对活性氧自由基的清除作用J. 时珍国医国药,2010,21（6）.14 吴琼英,曹文尧.新疆欧洲鳞毛蕨黄酮的提取及抗氧化活性J. 江苏农业科学, 2012，40（6）:278-280.致谢本文能经历数月实验后顺利完成，特别感谢315实验室的各位师兄师姐在仪器操作上的指导帮助；感谢指导老师魏娟的亲切关怀与细心指导。此外，还要感谢食品科学与工程学院为我提供了良好的实验条件和实验设备；感谢在实验过程中给予我帮助的同组同学；最后，感谢我亲爱的母校甘肃农业大学这四年来对我的栽培，感谢食品科学与工程学院的各位老师们对我人生这四年的教导。