毕业设计植物内生菌及其次级代谢产物用于生物农药的研究进展论文 精品Word文档格式.docx

1、（2）对病虫的杀伤特异性强，不伤害天敌和有益生物，能保持生态自然平衡；（3）生产原料和有效成分属天然产物，它可回归自然，保证可持续发展；（4）可用生物技术和基因工程的方法对微生物进行改造，不断提高其性能和质量；（5）多种因素和成分发挥作用，害虫和病原菌难以产生抗药性4。1 促进植物生长发育的内生菌促进植物生长的生理生化机制主要包括： 影响感染植物体内的物质代谢 ， 提高植物的资源利用效率； 产生生长素等激素类物质， 促进植物的生长。 内生真菌对农作物的营养生长具有一定的促进作用， 主要包括增加分孽数和生物量两方面。感染内生真菌的高羊茅（ F e s t u c a a r u n d i n

2、a c e a ） 植株经过1 O周生长后，分孽数和生物量明显高于未感染植株。 内生真菌对感染植株的氮代谢和氮积累有显著的影响 ， 感染植株 叶片和叶鞘 中的可溶性氨基酸总量 、 氨浓度增加， 谷氨酞胺合成酶（ G S ） 活性显著提高， 植物对土壤氮的利用效率大大增加。 另外， 内生真菌能够改变植物体中碳水化合物源库的关系， 内 生真菌作为碳水化合物的一个储库， 能迅速地将蔗糖转变成植物不能代谢的糖醇， 从而减少或阻止对光合作用的反馈抑制， 促进植物的光合作用。如生长在含有色氨酸的培养基上的一种瘤座菌（ B a l a n s i a e p i c h l o e ） 的内生真菌可能通过改

3、变植物体内的激素代谢， 促进植物生长5。 感染内生菌的植物具有比未感染植株生长快速的特点 内生菌促进植物生长的机制是多方面的，内生菌可通过生物固氮作用 合成铁载体协助宿主植物从土壤中吸收铁离子 合成或促进植物合成多种植物生长激素 促进宿主根系生长和对多种无机离子的吸收以及合成某些小分子物质或者酶（ 氨基环丙烷羧酸酶） 提高寄主植物对霜冻等有害环境条件及有害病原生物的敏感性等方面来促进植物生长6。田宏先等从 马 铃 薯 块 茎 内分 离 到 两 个 菌 株 Al O 和 H，一6 。经 鉴 定 ， 分 别 为 芽 孢 杆 菌 （ B a c i l l u s ） 和 荧光 假单 胞 菌 （ P

4、 f l u o r e s c e n s b i o v a r ） 。连续 3年大 田和 温室 试验 表 明 ， 这 两 个 菌 株在 马铃薯植 株 的高 度 、 茎粗 、 地下 块茎 及大 薯率 的提 高等 各 项指 标 上均 明 显 优于 对 照 ， 说 明其 促 生作 用 明 显 而稳定 。进一 步研 究发 现 ， H ，一6作 用强 弱与其 定殖 力呈 正相 关 7。梁亚萍等从采自秦岭的14种野生植物中分离得到29株内生放线菌，对其进行了皿内拮抗试验、发酵液抑菌试验和温室防病促生试验。结果发现菌株SF20对番茄和黄瓜具有明显的促生作用8。朱国胜等从将筛选获得的8个菌株按等比例混合

5、的菌剂，可显著促进组培苗生长，这表明美花石斛内生真菌所起的促生作用是多个菌的协同作用，一些菌提高其抗病性，另一部分菌促进其生长。本研究为进一步研制多菌复合菌剂，应用于栽培，对促进美花石斛产业化具有重要的指导意义。表明促生真菌提高了美花石斛组培苗根的成活率和幼芽的形成率，这对促进组培苗的成活和生长起着至关重要的作用9。2抗虫与杀虫2.1植物内生菌防治害虫的主要机制2.1.1产生毒素内生菌控制昆虫主要表现在其产生包括生物碱在内的一些毒素使得寄主能防御植食者， 导致昆虫拒食、 体重减轻、 生长发育受抑制甚至死亡率增加等。研究表明， 禾本科植物 （如黑麦草）对象甲、 黏虫、 多毛长蝽和蚜虫的抗性与其体

6、内的内生微生物合成对昆虫有毒的多种生物碱和神经毒素直接相关 10-11 。目前已从 感染的黑麦草中分离出波胺 和黑麦草碱等生物碱。从 A.coenphialun感染的高羊茅中分离出麦角肽， 主要是麦 角 缬 氨 酸和 吡 咯 双 烷 类等生物碱。这些生物碱都与感染植株的抗虫性和牲畜中毒症状密切相关。另外，感染内生菌的植物还会产生一些其它生物活性成分， 包括固醇类物质 （如麦角固醇、 麦角固醇过氧化物等） 和植物生长素等。Bacon等 首 次 建 立 了 真 菌 、寄主植物的毒素和植食者三者间的关，1988年又建立了黑麦草lolium perenne 中 真 菌 A.loii的 存 在 与幼虫l

7、istronotus bonariensis的生长、 存活和取食行为间的关系。受害率较低的植物主依靠于高毒性的黑麦草碱 （对哺乳动物也有毒性） 。黑麦草碱加进昆虫饲料中， 能抑制昆虫的生长发育和降低其存活率。patterson 等发现在黑麦草属lolium和羊矛属festuca 植物中， acremonlium产生的生物碱减少了日本丽金龟的为害 12 。 对蚜虫、 蟋蟀等昆虫的研究也都表明， 采食感染内生菌的植株对它们的生长发育有不利的影响。在木本植物中， 也存在类似情况。加拿大冷杉能够防御云杉蚜虫是由于内生真菌产生了有毒的次生代谢物。clark等报道在胶枞abies balsamea和红杉p

8、icea rubens中分离出 900个样品， 其中 5 个能产生有毒物质， 而且其中3 种能产生强毒性物质， 一旦提取并用于控制云杉卷叶蛾， 能导致死亡和发育率下降。siegel 等证实蚜虫取食过程中， 植物体内存在生物 N-甲酰和 N-乙酰黑 麦草 碱、波胺、黑 麦 草碱和麦 角 缬 氨酸 13 。calhoun 等从木本植物中分离出由内生真菌产生的毒素能够改变云杉卷叶蛾幼虫的生长和死亡率 。2.1.2 与昆虫竞争宿主植物的能源供应由于植物体内固醇类物质代谢的改变， 以及真菌与昆虫的竞争， 从而引起了被真菌感染的植物上的幼虫生长缓慢， 甚至死亡。真菌是碳源异养微生物， 它可以影响植物体内的

9、碳氮平衡， 影响植物的营养水平以及以碳氮为基础的防御代谢物的产生。植物感染内生真菌后， 体内总氮含量显著降低， 碳氮比升高 14 。固醇类物质对昆虫细胞膜和蜕皮激素的合成至关重要， 但昆虫本身不能合成， 因此， 固醇类物质代谢的变化将肯定影响摄食昆虫的行为变化。另一方面， 真菌的生长也需要固醇类物质， 因而存在与昆虫同竞争宿主植物的能源供应。因此， 受内生菌感染的植物体内某种固醇类物质的变化就改变了植物对昆虫的营养水平， 引起昆虫生长缓慢和食物转化率低2.1.3 产生水解酶 植物内生真菌和 内生细菌另一个重要的生防机制是产生水解酶类 ， 如几 丁质酶和葡聚 糖酶。这些水解酶与植物抗真菌能力有密

10、切关系， 因为真菌细胞壁的主要组成成份是几丁质和葡聚糖。这些 水解酶可以降解真菌的细胞壁或其它致病因子如毒素等， 达到防病效果。一种用于防治水稻稻瘟病的内生细菌 P s e u d o m o n a s f lu o r e s c e , 产生的几丁质酶和葡聚糖酶的水平与它的防病效果有密切的关系15 。某些生防菌的几丁质酶基因己经被克隆， 可以将这些基因转化到内生菌中， 发挥内生菌的优势， 提高防病效果。一种用于防治棉花黄萎病的内生菌， 可产生某些蛋白酶降解毒素达到防病的效果16 。2.1.4 产生植物生长调节剂 内生菌也可产生植物生长激素类物质 ， 如 AA、 吲哚乙腈等 17 。L u

11、等18 现 大多数黄花蒿内生真菌在体外培养时能产生对小麦和黄瓜幼苗生长不同程度的抑制或促进作用的代谢产物， 对其中一种炭疽菌（ C o l l e t o t r i c h u m s p ） 发酵产物的深入分析表 明， 该菌能产生植物生 长激素 I A A。假单胞菌 属、 肠杆菌属、 葡萄球菌属（ S t a p h y l o c o c c u s ） 、 固氮菌属（ A z o t o b a c t e r ） 以及固氮螺菌属（ A z o s p i r i l l u m） 内生细菌的一 些菌株也可产生植物生长调节物质如乙烯、 生长素、 细胞激动素， 对宿主植物的生长起促进作用

12、19 。草生欧 文氏菌（ E r w i n i a h e r b i c o l a ） 不仅能产生吲哚乙酸， 而且还能产生细胞分裂素。这些物质都能有效地促进植物的 生长。从墨西哥分离的 l 8 株重氮营养醋杆菌（ A c e t o b a c t e r d i z o t r o p h i c u s ） 都有产生生长素的能力20 。表明重氮 营养醋杆菌在与植物相互作用过程中不仅能固氮， 而且还可以通过生长素的调节作用影响植物的代谢， 促进 植物生长21 。最近的一项研究表明， 产酸克雷伯 氏菌（ K l e b s i e l l a o ： y t o c a ） 产生的生长素

13、对水稻植株的生长和发育起着重要的调节作222.1.5 诱导植物产生抗性 对这个生物防治机制， V a n L o o n 23 和 V a n We e s24 等 叙述的较为清楚。他们认为根际微生物包括在根内定殖的微生物能诱导植物产生一种抗性， 这种抗性不同于传统的系统获得性抗性 （ s y s t e m i c a c q u i r e d r e s i s t a n c e ， S A R ） ， 命名为诱导系统抗性（ i n d u c e d s y s t e m i c r e s i s t a nc e ， I S R ） 。I S R表型与病菌诱导的 S A R相似

14、， 都能诱导植物产生对病菌的广谱抗性。但 I S R中所包含的抗性机制没有病程相关蛋白（ P R） 的产生。目前对 I S R的抗性机制知道得不如 S A R的抗性机制清楚， 一般认为 I S R的抗性与植保素水平的提高和酚类物质积累有关。I S R和S A R信号传导途径是两种不同的路径 。同时内生菌能诱导植物产生一些结构方面的抗性， B e n h a m o u等 25用内生菌 B a c i l l u s p u m i l u s s t r a i n S E 3 4预接种基因转化豌豆， 然后接种病菌， 如果病菌的生长限制在木栓层和外皮层内， 在病菌企图侵入部位， 通过木质和酚类

15、物质的大量沉积， 这些细胞的胞壁得到加厚 ， 有效阻止了病菌的侵入 。2.2杀虫剂种类2.2.1细菌杀虫剂目前，细菌杀虫剂品种可达150多个。并已逐渐应用于蔬菜、林业、园艺、卫生害虫等领域的害虫防治中。这种微生物杀虫剂具有良好的防治效果，且不伤害天敌，对人畜安全不影响农产品品质，特别适用于无公害蔬菜及水果种植区，园林绿化区，自然保护林及优质粮棉生产基地使用。但是其缺点有1）杀虫效果受环境影响大，各种BT菌株仅对其敏感的昆虫有效；2）杀虫谱窄，一株菌种生产的杀虫剂一般不能防治多种虫害；3）昆虫对BT杀虫剂逐渐产生可遗传性的抗性；4）必须经过吞食过程进入昆虫体内才能杀死昆虫，很难杀死转入植物体内和

16、根部的害虫，而且只能在昆虫发育的某一阶段才有好的使用效果；5）主要靶标害虫是咀嚼式I=I器害虫（如鳞翅目的幼虫、鞘翅目等），对蚜虫、飞虱、粉虱等刺吸式口器害虫却无能为力。使得其大量开发受到限制。目前被开发投入实际使用的杀虫细菌主要有日本金龟子芽孢杆菌、球形芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌，其中苏云金芽孢杆菌杀虫剂是研究最深入、应用最广泛的细菌杀虫剂28。（1） 苏云金杆菌杀虫剂苏云金轩菌（简称Bt）是1911年Berliner从德国的苏云金省感病的地中海粉螟中分离的杆菌。至今已证明该菌对10个目522种昆虫具有不同程度的致病力，尤其对鳞翅目的幼虫特别有效29。其作用机理是依靠其所含有的伴孢晶体、外毒察

17、及卵磷脂酶等致病物质引起昆虫肠道等病症从而使昆虫致死。当昆虫食入该制剂后，在碱性胃液的作用下释放出毒性并作用于昆虫的中肠细胞，使中肠麻痹，随着病情的发展，昆虫肠道壁细胞的胶粘物质被破坏，上皮细胞剥离，散落在肠内，使中肠的透性失去控制，肠壁穿孔，肠道内含物芽孢和细菌大量侵入血腔，随着细菌的大量繁殖，昆虫l一3天内发生败血症而死亡口30。目前，Bt是商业开发最成功的微生物杀虫剂，全世界有几十个国家正在开展这一领域的研究和应用，有60多种Bt制剂已形成工业化商品，不仅应用于防治农林、卫生害虫，也应用于仓贮、食用菌、畜禽寄生虫等害虫的防治上。据资料记载，前苏联Bt制荆的产量超过8000吨。保加利亚用B

18、t防治舞毒蛾、松毛虫的面积占防治面积的53；加拿大用其防治云杉芽蛾的面积，1985年就达到应防治面积的52；此外，菲律宾和泰国应用苏云金杆菌制剂的面积也在迅速扩大31。1990年，我国Bt产量超过1500吨，目前年产量已近万吨，已成为我国无公害生产中的首推杀虫剂产品，除满足国内市场需要外，还出口远销到新加坡、泰国等东南亚国家32。我国Bt产业化应用基础的研究也在不断地深化，且对一些农作物害虫，如玉米螟水稻螟虫、棉铃虫的防治上也取得了突破性的进展，针对我国的主要品种是HDI和青虫菌的具体情况，制备了两个我国自已的标准品：CS3ab一1999和CS5ab一1987，并完成了以棉铃虫、小菜蛾为可供试

19、虫的标准化生物测定方法的研究等33，t994年，全国大田使用Bt杀虫剂达一万多吨，为1984年的100倍，仅防治棉铃虫面积就达3000万平方公顷。相信随着我国无公害、无农药残留食物的发展，Bt将获得更大规模的应用34。但是目前已报道有多种害虫对Bt制剂产生抗性，近年在我国的深圳、广州等地报道小菜蛾对Bt制剂产生抗性，害虫对微生物农药的抗性无疑会对其应用效果和发展带来影响，且Bt制剂对家蚕的毒性较高，因此在使用时务必注意35。（2） 日本金龟子芽胞杆菌杀虫剂（Bacillus popilliae insecticide）日本金龟子芽孢杆菌是一类专性病原菌，只对某些金龟子科并有密切亲缘关系的金龟子

20、起感染作用，在大田应用中表现出很强的致病潜力，其应用面积仅次于苏云金杆菌类。金龟子幼虫蛴螬吞食金龟子芽孢杆菌后，在中肠中萌发，生成营养体，穿过肠臂进入体腔，迅速繁殖，破坏各组织，并可感染其它蛴螬，使幼虫大量死亡36。该杀虫剂能使50余种金龟子幼虫致病，且药效长，是一种成功用于防治金龟子虫害的长效微生物农药。但这种杀虫剂只能在蛴螬体内形成大量孢子，在一般人工培养基上很少形成孢子，目前仍靠感染活蛴螬大量产生芽孢来进行。目前，美国、澳大利亚、新西兰等国已大面积应用。我国在该方面的研究起步较晚，近年来，在晋、冀、鲁、豫等省陆续分离到一些金龟子芽孢杆菌，并在其寄主范围、菌剂制作、应用技术和离体培养等方面

21、进行了研究，这些研究将为我国防治地下害虫提供有效的手段。（3）球形芽孢杆菌杀虫剂（Sphaericus insecticide）系由昆虫病原细菌的发酵产物加工而成的细菌杀虫剂。它对人畜安全，是有机磷杀虫剂的有效替代物。（4）其它细菌杀虫剂我国研究和生产的细菌杀虫剂品种主要还有青虫菌、杀螟杆菌、松毛虫杆菌、7216、140等。此外，中国农科院生物防治研究所研制成功的中生菌素也为我国植物细菌性病害防治增添了新的药剂。另外，还有几种细菌，如缓病芽孢杆菌、乳状芽胞杆菌、蜡状芽孢杆菌和幼虫芽孢杆菌、玉米螟杆菌、枯草杆菌、放射形土壤杆菌、洋葱球茎病假单胞菌、荧光假单胞菌、丁香假单胞菌、灰绿链霉菌，对防治土

22、传性秧苗病和水果及蔬菜病原菌很有效。2.2.2真菌杀虫剂目前，在昆虫病毒微生物中，真菌种类最多，约占昆虫病原微生物种类的60以上。目前在真菌杀虫剂中，世界上已记载的杀虫真菌大约有100个属，800多个种，其中约50集中于半知菌亚门。利用真菌防治害虫的研究工作已有百年的历史。1890年，美国堪萨斯洲第一次用白僵菌防治麦长蝽，此后许多国家如日本、美国、前苏联、巴西、英国等也开始应用白僵菌、绿僵菌、黄僵菌、蚜霉菌等防治农转害虫，逐渐把虫生真菌发展为一类微生物杀虫荆，真菌杀虫剂与细菌杀虫剂和病毒杀虫剂相比。有两个优点：一是许多分离物有较宽的寄主范围，可以使多种昆虫染病，具有广谱杀虫作用；二是真菌通过侵

23、染角质层（表皮）来感染寄主，除了毛虫、甲虫和其它咀嚼口器昆虫外，尚可感染蚜虫和叶蝉等刺吸式昆虫，因此近几年研究进展较快。但由于真菌在液体培养基中通过发酵生产会产芽生孢子，其壁较薄，比分生孢子存活率低，贮存期短，生产成本相对较高等缺点，尚需进行深入研究o 19世纪50年代以来，开发利用的共有20多种，各国研究应用最多的是自僵菌。其次是绿僵菌。（1）白僵茵杀虫剂（Beauveria bassiana insecticide）白僵菌杀虫剂是发展历史较早、普及面较大、应用最广的一种真菌杀虫荆。主要用于防治玉米螟和松毛虫。其分布遍及全世界，寄生虫种类达15个目149科521个属707个种，还有13种螨类

24、也受到寄生。白僵菌感染昆虫的方式主要是其分生孢子与昆虫皮肤接触，通过皮肤上的小孔侵入，使昆虫感染致病能通过昆虫的消化道及体壁进行侵染，分生孢子接触虫体后遇适宜的温、湿度萌发产生芽管，形成菌丝，同时白僵菌还会分泌能溶解昆虫体壁的几丁质酶和蛋白质毒素，使其能顺利侵入到虫体内。侵入虫体后。菌丝直接吸收昆虫的体液养分来维持自身的生长并不断繁殖，直至充满整个昆虫体内，这样，不但妨碍了昆虫的血液循环，而且菌丝的代谢产物在血液中大量积累，引起血液理化性状的改变，导致昆虫新陈代谢紊乱而死亡。据资料报道。前苏联已大规模生产白僵菌杀虫剂，每年生产约2 000吨以上，主要用于防治马铃薯甲虫。美国也生产白僵菌杀虫齐j

25、用于防治森林害虫，已经产业化的有两种白僵菌制剂，即：Bbassiano S打ainTBI，Bbl47和CHA。以及Bh吣匦8r。菌株Bb一147是从被感染的玉米螟幼虫体上分离得到，其生产工艺由INRA研制而成。菌株TBI由美国的一家研究中心从墨西哥棉铃象体内获得。我国开展真菌制剂的研究开发已有30多年的历史，其中主要以研究球孢白僵菌为主。目前虽然还未开发成功白僵菌制剂产品，应用白僵菌防治害虫的种类达40种以上，在1954年，应用该菌制剂成功地防治了大豆食心虫，南方地区大面积防治林区松毛虫和东北地区防治玉米螟等，防治害虫面积1974年为1500万平方公顷，1977年为2000万平方公顷，近lO年

26、发展更为迅速，其防治效果在80以上37。（2）绿僵菌杀虫剂（Metarhizium anisopliae insecticide）绿僵菌也是一种能使昆虫致病的真菌，被用于防治蠢草等地下害虫（金龟子类）、天牛等蛀干害虫（青杨天牛，云斑天牛，柑桔吉丁虫）以及苹果食心虫，并且对蚊子幼虫也有效。也属于一种广谱杀虫剂。在国外应用其防治害虫的面积超过了自僵菌，防治效果可与白僵菌媲美。它侵染昆虫的途径，杀虫机理与自僵菌相似38。应用真菌杀虫剂防治害虫一直受到国内外的广泛关注，国际生防组织（BC）使用黄绿绿僵菌防治沙漠蝗虫，巴西使用金龟子绿僵菌防治甘薯沫蝉等，均取得了显著效果39。但与Bt等微生物杀虫剂的研究

27、相比还有很大差距。（3）其它真菌杀虫剂还有赤霉菌、虫生藻菌青霉、黄僵菌、虫生藻菌、拟青霉素（淡紫拟青霉，粉拟青霉和玫烟色拟青霉，蝉拟青霉，环链拟青霉）、蜡蚧轮枝菌（防治农田及苗圃蛴螬）、座壳孢菌（双座壳孢菌、柑桔粉虱座壳孢、乳突座壳孢）、多毛菌（如汤氏多毛菌）、曲霉和镰刀菌等。2.2.3 放线菌杀虫剂放线菌类生物农药 放线菌中的链霉素有许多用于生产杀虫抗生素， 于 1 9 7 6年发现，不仅对线虫 ， 而且对螨类、 鳞翅 目、 直翅目、 双翅 目等害虫也有杀灭作用 （egerton ， 1 9 7 9 ） 。最近发现的如刺糖菌素是由多刺糖多孢菌 （ S a c c h a r o p o l

28、y s p o r ai n o s a ） 产生的次生代谢产物（ 李荣贵 ， 2 0 03 ） 40 ， 多刺糖多孢 菌是一种新型的放线菌， 它是由一位化学家在加勒比海度假 时从一个废弃的甘蔗甜酒厂附近土壤 中分离得到的， 通过对 其发酵液的抗蚊虫幼虫活性测定发现了刺糖菌素。由美国 d o w A g r o s c i e n c es C o m p a n y 生产的 2 5 悬浮剂（ 商品名： 菜喜） 和 5 8 悬浮剂（ 商品名 ： 催杀） 已获得我国农药的临时登记。 主要防治鳞翅 目害虫。其他如春雷霉素、 井冈霉素、 中生霉 素、 农抗 1 2 0等。放线菌中的链霉素有许多用于生

29、产杀虫抗 生 素 ， 仅 我 国 就 研 制 了 杀 蚜 素 （ S h a y u） 韶 、 关 霉 素 （ S h a o g u a n m e i s u） 、浏 阳 霉 素 （ L i u y o n e i u s ） 、南 昌 霉 素 （ N a n c h a n g m e i s u ）41。最著名的为阿维菌素（ A v e n n t i n s ， 简 称 A v m） ， 已于 1 9 7 6年 由美 国 Me r c k公司研究 人员在 日本 K i t a s a t o 研究所提供的 S t r e p t o m x a v e r m i t i l i s发酵中发现。A v