达托霉素的HPLC的方法学研究Word文件下载.docx

1、水解物P1301，91.4%-异构体P1301，71.9%脱水物P1301，86.6%达托霉素样品S130301浙江海正药业股份有限公司生产二、方法建立与方法描述（一）、方法建立 袁干军等曾报道达托霉素及A21978C组分的含量中提到色谱条件为色谱柱ShimadzuVP-ODS（2504.6mm,5.0m）;梯度洗脱的流动相A:乙腈-0.05MpH7.2的磷酸缓冲液（30:70）,流动相B:乙腈-0.05MpH7.2的磷酸缓冲液（70:30）;流速1.0mL/min;检测波长为223nm,260nm,280nm,360nm。由于达托霉素的成品用上述方法使一些杂质分离的效果不是很理想，因此，把磷

2、酸二氢铵缓冲盐的PH值调整为3.1，梯度也有相应的调整，检测波长使通过二极管阵列检测器（DAD）检测，在190nm360nm区间进行DAD全波段扫描。通过DAD扫描结果显示样品在223nm附近具有最大吸收，综合考虑确定223nm为高效液相色谱仪检测波长。由于达托霉素的分子量比较大以及杂质与主峰分离效果综合考虑最终采用Phenomenex IB-SIL C8 4.6m色谱柱。（二）、方法描述含量色谱柱：m流速：1.0ml/min检测波长：223nm进样量：l柱温：25进样器温度：28流动相A：称取3.4g磷酸二氢铵用1000ml注射用水溶解，用磷酸调节pH至3.1流动相B：流动相：梯度洗脱A（%

3、）B（%）67.532.5456040505556稀释剂：标准溶液：精密称取达托霉素对照品25mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。样品溶液：精密称取达托霉素样品25mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。系统适应性：连续注射5针标准溶液，计算峰面积RSD不大于2.0%。用下式计算达托霉素中C72H101N17O26的含量： 湿计含量%=ruCsP100%rsCu式中：Cu，Cs分别是样品溶液与标准溶液的配制浓度（mg/ml） rs是标准溶液所对应的主峰峰面积 ru为样品溶液所对应的主峰峰面积 P为对照品的含量，%无水无残溶含量计算公式：干计含量%=湿计含量%1-水分%-

4、残溶%限度：以无水无溶剂计算，达托霉素中C72H101N17O26含量应93.0%。有关物质色谱条件和样品溶液同含量。1%对照溶液：精密移取含量项下标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。用下式计算各已知杂质、单个杂质和总杂质的含量： 含量%=Cu，Cs分别是样品溶液与1.0%对照溶液的配制浓度（mg/ml） rs是1.0%对照溶液所对应的主峰响应值 ru为样品溶液中各杂质对应的峰响应值脱水达托霉素1.5%，异构体杂质 0.7%，水解物0.4%，杂质1（RRT约为0.79） 0.2%，杂质2 （RRT约为0.92） 0.2%，杂质3 （RRT约为0.94）（C9） 0.6%

5、，杂质4（RRT约为0.96） 0.5%，杂质5（RRT约为1.07）（C11） 0.7%，杂质6组（RRT约为1.201.25）0.6%单个未知杂质0.1%，总杂质5.0%三、验证内容（一）、系统适应性系统适应性溶液：精密称取达托霉素对照品P1301 25.01mg和25.11mg，分别置于2个50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度，作为STD1溶液和STD2溶液。当色谱系统平衡后，分别进1针空白溶液、进样5针STD1溶液和2针STD2溶液，计算RSD%和回收率，结果见表1。表1. 系统适应性结果STD1的RSD: 2.0%STD2回收率：98.0102.0%序号STD1峰面积STD2峰

6、面积1st22610.222805.02nd22600.922695.43rd22595.2/4th22593.95th22555.1平均值22591.122750.2RSD（%）0.090.34回收率（%）100.30结论：STD1的RSD%为0.09%，STD2的RSD%为0.34%，回收率为100.30%，均满足认可标准，系统适应性良好。（二）、降解实验通过对样品溶液及各种强降解条件下的产物使用DAD 检测器进行分析，判断方法的专属性及稳定性指示性。 表2 降解试验结果 溶液名称新增杂质相对保留时间（RRT） 酸解0.2424、0.2513、0.3534、0.4689、0.6032、0.

7、6936、0.7222、0.7858、0.8761、1.5221、1.6449、1.6729碱解0.4689、0.6147、0.7766、1.1375、1.4352、1.5695氧化0.2424、0.2626、0.2899、0.3358、0.3833、0.3952、0.4294、0.5144、0.5612、0.6032、0.6531、0.6936、0.7276、0.7858、1.0891、1.4950、1.5221、1.5271、1.5372、1.5459、1.5588、1.5695、1.5727、1.6207、1.6263光照0.1669、0.1715、0.1777、0.1968、0.207

8、6、0.2178、0.2513、0.3063、0.5144、0.5612、0.6032、0.6302、0.6531、0.6936、0.7222、0.7766、1.5221、1.5459、1.5588、1.6207避光0.6032、1.5221加热0.6032、0.6936、0.7766、0.7858、0.9771、1.0891、1.1375、1.3630、1.4462、1.4649、1.4950、1.5221、1.5459、1.5695、1.6609、1.6729、1.6972高湿0.5612、0.6032、0.6302、0.6936、0.7858、1.1375、1.5221、1.5459、1

9、.5695、1.6207、1.6729（三）、专属性水解物单个专属性溶液：精密称取水解物P1301 5.327mg于50ml容量瓶中，用乙腈：水=1：1溶解并定容至刻度。-异构体单个专属性溶液：精密称取-异构体P1301 5.930mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。脱水物单个专属性溶液：精密称取脱水物P1301 5.380mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。达托霉素样品溶液：精密称取达托霉素样品S130301 25.78mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。混合溶液：精密称取达托霉素样品S130301 25.85mg于50ml容量瓶中，分别加入各单个专

10、属性溶液5.0ml，用稀释剂溶解并定容至刻度。分别进样空白溶液、各单个专属性溶液和混合溶液，考察空白溶液在各组分保留时间处是否存在干扰，相邻各组分间分离度，结果见表3。表3 专属性理论塔板数2000相邻组分间分离度1.0达托霉素单个组分保留时间（min）29.69731.78335.06839.943混合溶液各组分保留时间（min）29.72531.77734.77640.028相对保留时间（RRT）0.850.911.01.15与相邻前一个色谱峰间分离度1.081.521.831.11与相邻后一个色谱峰间分离度1.731.363.002.72理论塔板数29805324872531644523

11、各组分间分离度和理论塔板数均满足认可标准，专属性良好。（四）、定量限LOQ和检测限LOD1、定量限LOQ（1）、未知杂质定量限精密称取达托霉素对照品P1301 25.39mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。1.0%对照溶液：精密移取标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。未知杂质LOQ溶液：精密移取1.0%对照溶液1.5ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。连续注射6针定量限溶液，计算峰面积RSD%和信噪比S/N，结果见表4-1。表4-1 未知杂质LOQ检测结果LOQ浓度 峰面积S/N未知杂质Conc:0.0721g/ml相当于主峰浓度0.0144%4

12、.5024212.04.2026212.54.1650712.14.3808912.34.2409511.06th4.3401213.74.30535RSD%2.94RSD% 5.0%，信噪比S/N：1015，LOQ 0.05%未知杂质LOQ浓度为0.0721g/ml，峰面积RSD%为2.94%，信噪比均在1015，均满足认可标准。（2）、已知杂质定量限水解物储备溶液：精密称取水解物P1301 9.736mg于50ml容量瓶中，用乙腈：水解物定量限储备溶液：精密移取水解物储备溶液0.5ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。-异构体储备溶液：精密称取-异构体P1301 9.011mg于2

13、0ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。-异构体定量限储备溶液：精密移取-异构体储备溶液0.5ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。脱水物储备溶液：精密称取脱水物P1301 13.584mg于20ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。脱水物定量限储备溶液：精密移取脱水物储备溶液0.5ml于100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。已知杂质定量限溶液：分别精密移取水解物定量限储备溶液8.0ml、-异构体定量限储备溶液5.0ml、脱水物定量限储备溶液3.5ml，置于同一100ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。连续注射6针定量限溶液，计算峰面积RSD%和信噪比S/N，结果见表4-24-4。

14、表4-2 水解物LOQ检测结果0.0712相当于主峰浓度0.0142%2.9821110.83.0032710.63.0117710.33.0667410.23.0389811.32.853492.992732.48表4-3 -异构体LOQ检测结果-异构体Conc:0.0810相当于主峰浓度0.0162%3.220563.194583.4346911.53.290013.1006912.43.1488213.23.231563.67表4-4 脱水物LOQ检测结果0.1029相当于主峰浓度0.0206%3.911583.8387612.74.084053.9907612.23.968434.01

15、02214.83.967302.13水解物LOQ浓度为0.0712g/ml，峰面积RSD%为2.48%；-异构体LOQ浓度为0.0810g/ml，峰面积RSD%为3.67%；脱水物LOQ浓度为0.1029g/ml，峰面积RSD%为2.13%，信噪比S/N均在1015，均满足认可标准。2、检测限LOD（1）、未知杂质检测限未知杂质检测限溶液：精密移取未知杂质定量限溶液3.0ml于10ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。连续注射2针检测限溶液，计算信噪比S/N，结果见表4-5。表4-5 未知杂质检测限结果LOD浓度0.0216相当于主峰浓度0.0043%1.316583.41.234013.11.2

16、7530S/N：25未知杂质LOD浓度为0.0216g/ml，信噪比S/N均在25，满足认可标准。（2）、已知杂质检测限已知杂质检测限溶液：精密移取已知杂质定量限溶液3.0ml于10ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度。连续注射2针检测限溶液，计算信噪比S/N，结果见表4-64-8。表4-6 水解物检测限结果0.02140.6987582.50.8827162.60.790737表4-7 -异构体检测限结果0.0243相当于主峰浓度0.0049%1.245391.112541.17897表4-8 脱水物检测限结果0.0309相当于主峰浓度0.0062%0.9491852.81.261792.71.

17、10549水解物LOD浓度为0.0214g/ml，-异构体LOD浓度为0.0243g/ml，脱水物LOD浓度为0.0309g/ml，信噪比S/N均在25，均满足认可标准。（五）、线性（1）、含量线性200%线性储备液：精密称取达托霉素对照品P1301 49.21mg于50ml容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度。线性溶液：精密移取200%线性储备液2.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml、8.0ml，分别置于5个10ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度，即得到40%、80%、100%、120%、160%线性溶液。每份溶液进样2针，记录数据，做线性回归曲线，求相关系数R、截距百分比（截距/100

18、%含量浓度对应的峰面积100%）。结果见表5-1。表5-1. 达托霉素含量线性结果R 0.999截距百分比 3.0%浓度（mg/ml）平均峰面积40%溶液0.18648811.596688793.046398774.4960980%溶液0.372817491.217464.617438.0100%溶液0.466022034.822031.222027.6120%溶液0.559226455.826450.726445.5160%溶液0.745635709.735704.935700.0线性方程Y=48119x-341.5相关系数RR=0.9999截距百分比1.55%图1. 达托霉素含量线性达托霉

19、素含量线性曲线相关系数R=0.9999，截距百分比1.55%，线性方程Y=48119x-341.5，在0.18640.7456mg/ml浓度范围内线性关系良好。（2）、未知杂质线性以未知杂质的限度0.5%（2.5g/ml）对应的浓度为100%。标准溶液和未知杂质定量限溶液：同4.4.1.1“未知杂质定量限”项下“标准溶液和未知杂质定量限溶液”。未知杂质线性储备溶液：精密移取标准溶液1.0ml于100ml容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度。未知杂质线性溶液：精密移取未知杂质线性储备溶液2.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml、8.0ml、10.0ml，分别置于6个10ml容量瓶中，用稀释剂定容至

20、刻度，即得到40%、80%、100%、120%、160%、200%线性系列溶液。结果见表5-2。表5-2. 未知杂质线性结果R 0.99截距百分比 15.0%浓度（g/ml）LOQ溶液0.07213.856453.851133.845800.961845.1417144.4716043.801481.923589.0286388.4964287.964212.4044110.87798110.74789110.617802.8853135.99603135.44470134.893363.8471179.34697179.50304179.65910200%溶液4.8089232.370532

21、31.83741231.30428Y=47.815x-1.9822R=0.99951.79%图2 未知杂质线性曲线达托霉素未知杂质线性曲线相关系数R=0.9995，截距百分比为1.79%，线性方程Y=47.815x-1.9822，在0.07214.8089g/ml浓度范围内线性关系良好。（3）、已知杂质线性杂质储备溶液：同4.4.1.2“已知杂质定量限”项下“各杂质储备溶液”的配制。同4.4.1.2“已知杂质定量限”项下“已知杂质定量限溶液”的配制。1000%线性储备溶液：分别精密移取水解物储备溶液10.0ml、-异构体储备溶液7.0ml、脱水物储备溶液10.0ml，置于同一100ml容量瓶中

22、，用稀释剂定容至刻度。已知杂质线性溶液：精密移取1000%线性储备溶液2.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml、8.0ml、10.0ml，分别置于6个50ml容量瓶中，用稀释剂定容至刻度，即得到40%、80%、100%、120%、160%、200%线性系列溶液。结果见表5-35-5。表5-3. 水解物线性结果0.07123.438703.273983.109260.711935.1477635.4013235.654871.423870.3083370.7704071.232461.779789.2334588.6593388.085202.1357104.00508103.48459102.96412.8476138.96315138.82312138.683093.5595168.99667168.63343168.27019Y=47.613X+1.78362.01%图3. 水解物线性曲线表5-4 -异构体线性结果0.08103.699193.587143.475090.907043.807442.9410242.074641.814187.7002687.7794987.858722.2676108.70023108.26199107.823752.72111