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1、分子杂交与免疫组织化学的结合，形成了在细胞、亚细胞和分子水平同时检测基因及其表达产物的完整体系，把基因探针（基因工程）和单克隆抗体技术结合起来，成为当代生物科学和医学在分子水平研究和诊断的新兴技术。尤其是近年来与PCR技术结合的原位PCR技术，敏感性很高，包括分子生物学基础理论、核酸分子探针制备、原位分子杂交技术、聚合酶链式反应（PCR）、核酸分子杂交电镜技术、杂交与免疫细胞化学双标记技术、分子杂交在染色体制片的应用和分子杂交基因诊断的应用等方面。（三）免疫组化技术的特点1、高度的特异性、可达到单个AA水平。2、敏感性高。3、方法、步骤统一。4、形态、机能、代谢的完美结合（定性、定位、定量）。

2、（四）免疫组化技术全过程1、抗原提取（纯化）（粉碎、沉淀、层析、离心、电泳）2、抗体制备：PcAb：用Ag免疫动物产生Ab，由于Ag有多个决定簇，刺激多个B细胞克隆，产生针对多个Ag决定簇的混合物（多价Ab）。McAb：用杂交瘤技术，在细胞培养条件下，经过多次克隆化，使一个杂交细胞及其后代产生一种均质的Ab。（分离出单个细胞，使其通过分裂增殖而获得一个遗传特性）3、抗体纯化：除去抗血清中的其他白蛋白，、球蛋白以及纤维蛋白。（目的：Ab标记时，免受其他蛋白的干扰）4、标记抗体：Marrack于1934年提出了在Ab分子上结合适当的标记物，用以识别其相应抗原的设想。5、细胞和组织切片标本的制备。6

3、、免疫组化反应和显色。7、观察和分析结果。Marker种类：荧光色素、酶、金、铁蛋白、放射性同位素、血浆蛋白、多聚微球蛋白、RBC、 病毒、噬菌体。（五）ABC法和PAP法免疫酶标记步骤1、石蜡切片，二甲苯脱蜡三次。2、经100%、95%、80%酒精、蒸馏水水化。3、阻断内源性HRP：0.3%H202甲醇液，室温20分钟，PBS冲洗3x5。4、蛋白液消化：0.05%胰蛋白酶，室温30，PBS冲洗3x5。5、保护：正常马、牛血清（13%），室温20，勿洗。6、滴加抗，置湿盒内，4冰箱过夜。7、PBS液洗3x5。8、滴加抗，湿盒内室温30，PBS 洗3x5。9、滴加PAP或ABC试剂，室温30，P

4、BS洗3x5。10、显色：DAB液5 15，镜下控制，PBS冲洗。11、复染：苏木素12分钟，盐酸酒精分化30秒，兰化10。12、80%、95%、100%酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。（六）关于标记的几点说明1、阻断：2、消化：3、保护：4、抗体：5、显色原理：HRP+H2O2 HRPH2O2 HRPH2O2+DH2 HRP+D+2H2O6、镜下控制:（七）显色观察1、阳性细胞数2、阳性反应强度 3、表达型4、阳性分级5、必须设对照6、假阳性反应：1.固定不当或固定时间过长2.抗体效价过低3.其他试剂久置4.切片过薄或过厚5.组织储存过久6.组织中抗体被粘稠基质、分泌物或多层细胞膜阻隔7

5、、假阴性反应：（八）免疫组化应用的范围1、肿瘤组织起源上进行诊断2、发现微小转移灶3、肿瘤生长活跃程度的判断4、激素受体检测以指导临床治疗5、激素类细胞的定位、定性，以进一步确定内分泌细胞的类型和功能状态6、指导肿瘤分期7、指导肿瘤预后的判断（癌基因、抗原性）8、免疫性疾病的辅助诊断常用间叶性标记物1.所有间充质细胞 波形蛋白（Vimentin,VIM）2.内皮细胞 第八因子相关抗原（Factor related antigen,F- Rag,F8） 荆豆凝集素（Ulex europaeus lectin,REA-1）3.组织细胞 溶菌酶（Lysozyme,muramidase,LYS） 1-

6、 抗胰蛋白酶（1-antitrupsin,AAT） 1- 抗糜蛋白酶（1 antichumotruosin,AACT间叶组织间质标记物.纤维连结蛋白（Fibronectin,FN）2.基板蛋白（Laminin）3.骨连结蛋白（Osteonectin,ON）4.、和型胶原（Collagen、 ）1.结蛋白（Desmin,DMS）2.肌动蛋白（Actin）3.肌球蛋白（Myosin）4.肌红蛋白（Myoglobin,MG）5. 肌酐激酶BB和MM（Creatinine kinase BB&MM）6.Z-蛋白（Z-protein）淋巴造血组织标记物1.白细胞共同抗原（Leucocyte common

7、 antigen,LCA,CD45）；2.免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）轻链（、）重链（、）；3.全B细胞单克隆抗体：CD19（B4）、CD20（B1）、CD22（Leu14）、L26；4.全T细胞单克隆抗体：CD2（OKT11,Leu5）、CD3（OLT3,Leu4）、CD5（OKT1,Leu1）、CD7（Leu9）、UCHL1;5.T细胞亚群单克隆抗体：CD4（OKT4,Leu3）、CD8（OKT8,Leu2）;6.单核-巨噬细胞抗体：MAC387,LYS;7.其他：TdT、CD10（CALLA）、CD15（Leu M1）、CD30（Ki-1，Ber H2）、HLA-DR

8、、Leu7常用的上皮性标记物1.角蛋白（Keratin,KER;Cytokeratin,CK ）2.上皮（细胞）膜抗原（Epithelial membrane antigen,EMA）3.癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen,CEA）4.包壳蛋白（Involucrin）5.桥粒蛋白（Desmosomal proteins）中枢和周围神经标记物1.胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acdic protein,GFAP）；2.神经微丝蛋白（Neurofilament proteins,NFP）；3.S100蛋白（S100 protein, S100）；4.髓

9、磷脂碱性蛋白（Myelin basic protein,MBP）；5.Leu7；6.神经元特异性烯醇化酶（Neuron specific enolase,NSE）。神经内分泌细胞系统一般性标记物1.神经原特异性烯醇化酶（NSE）2.嗜铬颗粒蛋白（Chromogranin A,CHG-A）3.嗜铬颗粒膜蛋白（Chromomembrin B,CHM-B）4.突触囊泡蛋白（Synaptophysin,SY ）5.Leu7激素标记物1.垂体激素：促肾上腺皮质素（ACTH）、生长素（GH）、泌乳素（LTH）、促甲状腺素（TSH）、促卵泡成熟素（FSH）、黄体生成素（LH）2.胰岛细胞、胃肠道和呼吸道激素

10、：胰岛素（Insulin）、胰高血糖素（Glucagon）、胰多肽（Pancreatic polypeptide,PP）、生长抑素（Somatostatin）、胃泌素（Gastrin）、血管活性肠多肽（Vasoactive intestinal peptide,VIP）、5-羟色胺（Serotonin）、蛙皮素（Bombesin）、降钙素（Calcitonin）和ACTH等3.其他：甲状腺素（T3、T4）、肾上腺素和去甲肾上腺素、绒毛膜促性腺激素（hCG）。器官特异性抗原的标记物1.前列腺特异性抗原（Prostate specific antigen,PSA）2.前列腺酸性磷酸酶（Prosta

11、te acid phosphatase,PAP）3.甲状腺球蛋白（Thyroglobulin,TGB）4.乳酪蛋白（Casein）5.乳白蛋白（Lactalbumin）6.胰淀粉酶（Pancreatic amylase）瘤胚性抗原标记物1.癌胚抗原（CEA）2.甲胎蛋白（1-etoprotein,AFP）第二部分 诊断病理学及其应用 诊断病理学的形成、发展及其研究方法一、病理学发展简史1、祖国病理学发展情况： 祖国医学形成和发展的依据是阴阳五行 学说。诞生了黄帝内经、诸病源候论、伤寒论等经典大作，同时少数医学家对尸体进行剖验，以查明死因，澄清事实，所著书如：宋慈的洗冤录、王清任的医林改错等。2

12、、国外病理学发展： 古希腊在两千多年前就进行尸体剖验。18世纪出现了器官病理学（organ pathology）。19世纪出现了细胞病理学（cellular pathology）。20世纪以电子显微镜技术为支撑的超微结构病理已经建立。随着边缘学科的大量涌现和科技的飞速进步，在传统病理学的基础上产生了 许多新分支，如：免疫病理学（immunopathology）、分子病理学（molecular pathology）、遗传病理学（genetic pathology）、定量病理学（quantitative pathology）、远程病理（ telepathology）和信息病理（pathologic

13、al informatics）。诊断病理学分类：软组织病理、淋巴网状组织和骨髓病理、皮肤病理、口腔组织病理、消化系统病理、呼吸系统病理、心血管病理、泌尿系统病理、生殖系统病理、内分泌系统病理、神经系统病理、眼耳鼻咽喉病理、骨关节病理、细胞学病理等。镜下观察特殊染色二、病理学研究方法：肉眼观察取材切片石蜡包埋 常规染色（H E）涂片或刷片 其它方法： 电镜观察 免疫组织化学 免疫荧光技术 相差显微技术 流式细胞术 图像分析技术 DNA重组技术 核酸分子杂交 原位杂交 激光共聚焦显微技术 DNA测定等 PCR 诊断病理学的应用领域 诊断病理学与临床医学 病理诊断的重要性 造成病理诊断局限性的 主客

14、观因素 病理诊断常规方法 临床病理送检规范 病理医生病理报告书写规范 临床病理讨论会 诊断病理学与医学科研 诊断病理学与新药开发病理诊断的重要性 诊断病理学同影像医学、检验医学并称为临床医学的三大支柱学科。 诊断病理学依靠病理学的理论和技术以及病理医师长期积累的知识和经验，对病变组织和细胞进行大体和镜下的直接观察。病理检查被称为疾病诊断的“金标准”。 正确认识病理诊断的不足。（如必要时重新取材）造成病理诊断局限性的主客观因素 源自临床方面的病理诊断方面局限性v 部分临床医生对病理诊断存在认识误区v 部分临床医生对病理取材、固定和送检的规范 要求存在知识空白或不够重视病理诊断常规方法 细胞学检查

15、v 体腔和自然管道内的细胞v 通过离心浆膜腔积液、脑脊液或刷取、刮取、加压冲洗自然管道内的细胞 活体组织检查v 术后大体标本v 为确定疾病取得小活检 尸体剖验 （图）临床医生病理送检规范 活检病理标本及痰液取材规范v 在可疑的病灶取材v 在病灶与正常组织的交接处垂直取材，不要在病灶表面水平取材v 内镜取材组织块要大一些v 手术切除的标本和淋巴结应全部送检v 肿瘤累及器官或组织的根治性手术，要尽量摘除引流区域的淋巴结全部送检v 尽量避免钳夹对组织造成的挤压v 采集痰液要让患者在清晨起床后，先行漱清食物残渣和口腔唾液，弃去喉头的头两口痰，把呼吸道深部的痰液咳出后送检 病理申请单填写规范 标本的固定

16、及送检规范v 常规送检的标本一般用10中性福尔马林固定v 送检的标本应尽快固定v 所有送检标本的容器或细胞涂片，均应标明患者的姓名，同病理申请单一起送达病理医生病理报告书写规范 肉眼所见改变 镜下改变 病理诊断v 明确诊断v 倾向性诊断v 描述性诊断临床病理讨论会 临床病理讨论会（ clinical pathological conference,cpc）是临床和 病理共同对临床死亡病例的尸检结果与生前诊断及治疗过程进行对比分析，以汲取经验的专题学术会议。诊断病理学与医学科研 目前医学科研中，能作为客观证据的有三类：检验学证据、影像学证据、病理形态学证据 在体实验（动物试验） 离体试验（组织、

17、细胞培养）诊断病理学与新药开发 按照国家药品注册管理办法的规定，新药研究过程分为两个阶段：临床前研究阶段、临床研究阶段。 临床前研究阶段包括药学研究和药理毒理研究 ，这主要是通过动物实验来完成的。第三部分 组织芯片技术及其应用组织微阵列（tissue microarray,TMAs）又称组织芯片（tissue chip），是将数十个、数百个乃至上千个细小组织片整齐地排列在某一载体上而成的缩微组织切片。适于同时分析大量不同肿瘤或同一肿瘤不同临床病理分期的存档石蜡标本。一、组织微阵列/芯片的原理及其构建基本制作过程：（1）收集病例及相关蜡块，切片做H.E染色，复合诊断，选择有关区域在玻片上作标记；

18、（2）在受体蜡块上打孔；（3）借助玻片上的标记找准受体蜡块上的相应部位，打孔采集组织芯；（4）将组织芯转移到受体蜡块上的相应部位，打孔采集组织芯。（5）对组织芯片蜡块切片：需要一套切片辅助系统（胶膜、光胶玻片、紫外线灯等）。用特制仪器从许多不同肿瘤或同一肿瘤不同临床病理分期病变组织蜡块（供体蜡块）中穿取微小组织样品并精确地排列于同一石蜡块（受体蜡块）中，即构建成了组织微阵列。常规连续切片即可用于DNA、RNA的原位杂交和蛋白质免疫组化分析。目前用于科研的组织芯片多数是肿瘤组织芯片：（1）多肿瘤组织芯片（multitumor，TMA）由多种类型肿瘤组成，用于肿瘤基因筛选。（2）肿瘤进展组织芯片（

19、progression，MTA）由不同发展阶段的肿瘤组织组成，用于研究肿瘤不同发展阶段的基因变化情况。（3）预后组织芯片（prgnostic，MTA）由治疗前后的肿瘤组织组成，用于寻找与治疗和预后有关的指标。二、组织微阵列技术在肿瘤病理研究中的应用及可行性评价1、构建人体多肿瘤组织微阵列，对比研究多种肿瘤不同基因的表达。2、构建同一肿瘤不同病理分期组织微阵列，研究其发生和演进过程。3、与cDNA微阵列结合，快速鉴别和进一步研究更多新的肿瘤相关基因。4、临床肿瘤病理定性诊断。 可利用存档石蜡块构建人体多类型肿瘤组织微阵列，并对它进行DNA、RNA及蛋白质表达等不同层次的研究，以快速扫描多种不同恶

20、性肿瘤的分子改编并进行对比分析。尤其适用于稀有类型肿瘤、微小原发肿瘤和微小转移癌灶的分子研究，如：Schraml P等在研究中首次揭示了一例胚胎睾丸癌erb-B2扩增。 借助组织微阵列/芯片技术可将具有明确癌前病变的肿瘤及其癌前系列病变组织排列在同一阵列蜡块上，连续切片，采用多种原位检测方法平行观察分析它们的分子生物学差异，为肿瘤的早发现、早诊断、早治疗提供科学依据。借助这一技术对同一组织起源肿瘤的不同组织学类型、不同分化程度以及不同人种之间进行多样本分子生物学分析，是对以往仅限于流行病学资料分析的有益补充。 cDNA微阵技术能大规模扫描多种已知和未知基因的表达，而不能有效评价所观察到的基因表

21、达量变的有效性和精确性。肿瘤组织微阵列只能用于同时检测同一基因在不同组织的表达而不能大规模扫描多基因表达。如果将cDNA微阵列技术和组织微阵列技术结合，利用cDNA微阵列技术寻找肿瘤组织与正常组织的差异表达基因，然后利用组织微阵列技术构建多种直接来自人体手术或活检标本的多组织芯片并采用各种原位检测法评价cDNA微阵列技术所筛选出的多个后选基因的临床意义，清晰地简化和加快从基础研究到临床应用的进程。三、组织微阵列/芯片技术优点1、高通量。 Kanonen J采用组织微阵列/芯片技术在几天时间内即完成了3372次FISH实验，分析出372例冷酒精固定的微阵列乳癌标本6个基因位点的DNA扩增，其扩增

22、频率与已发表的文献结果一致。2、灵活性。 目前，一个45mm20mm的石蜡块上可以排列多达1000个肿瘤组织块。3、平行性。 以前，不同作者在标本选择、实验方法、结果解释等方面采用的标准均可能不同，故不同文献所得结果可比性差。肿瘤微阵列/芯片技术采用同一标准选材、操作和判定结果，多得结果均一可靠。4、节省性。采用组织微阵列/芯片技术则能显著提高工作效率，且基于多组织得单一芯片研究既能保持研究结果得可靠性，又能省时省力省试剂。四、组织微阵列芯片技术的局限性 由于构成组织芯片的组织很小，这些小组织能否代表其原来的组织。据Moch等的研究，组织芯片是用于检查肿瘤群体而不是个体，他们对组织异源性的影响进行了组织芯片与普通切片对比性研究，结果中出现的一些差异并不影响到相关参数的确定。他们推测，至少在大多数情况下从组织芯片中得到的研究结果应该能够代表原组织。五、组织微阵列/芯片技术的前景展望 目前应用于直接检测高水平表达基因。随着肿瘤基因组计划和疾病基因组计划的提出和实施，组织微阵列技术作为一项高通亮筛选技术的优势将日趋明显。