酵母双杂交系统Word格式文档下载.docx

1、特别应提出的是，一个阳性克隆的编号往往要被反复记录多次，因此，要时时注意编号的正确性。另外，若从公司购得待筛选的酵母cDNA文库，应注意不同的公司有不同的产品，且各公司的产品不断更新换代，要认真阅读实验指导手册，以防出现失误。4应用研究已知蛋白间的相互作用、寻找在蛋白蛋白相互作用中起关键作用的结构域、寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白。相信随着分子生物学技术的发展与推广，酵母双杂交技术在今后的蛋白质组学研究中将发挥更大的作用。酵母双杂交系统操作方法LexA酵母双杂交系统简介一、LexA酵母双杂交系统的设计原理报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂

2、的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD（202个氨基酸残基组成的LexA蛋白）与目标蛋白（钓饵，Bait）的融以我合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA8结合。质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点（EcoR I与Xho I）上游，含有SV40核定位（SV40 nuclear localization）、HA（血凝素）及AD（

3、来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白）等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。

4、如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。二、商品化酵母双杂交系统的组成1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株）3. 大肠杆菌菌株：E.coli KC8株4. 对照质粒：质 粒 用 途pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照pLexA-Pos（LexA/GAL4 AD融合蛋白 阳性对照pLexA-Lam（LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用） 假阳性检测质粒5.

5、引物：pLexA测序引物及pB42AD测序引物。三、酵母双杂交实验的基本流程1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选。2. 同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵（bait）。4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48（p8op-LacZ）细胞株，用SD/-His/-Ura筛选；并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。转化质粒 选择培养基 克隆生长情况 说 明（

6、含有Gal/Raf） pLexA-Pos SD/-His，-Ura 蓝 阳性对照pLexA SD/-His，-Ura 白 阴性对照PlexA-X SD/-His，-Ura 白 没有直接激活活性PlexA-X SD/-His，-Ura 蓝 具有直接激活活性PlexA-X SD/-His，-Ura 菌落不能生长 酵母细胞毒性4-1. 如果pLexA-X -半乳糖苷酶的信号作用。b能够自动激活报告基因，则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组，减少4-2. 如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因，但对酵母宿主细胞有毒性，则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母。5. 如果pLex

7、A-X既不会自动激活报告基因，也不具有毒性，则可以与纯化的文库DNA同时、或顺序转化酵母细胞，并检测质粒转化效率。转 化 质 粒 SD固体培养基 LacZ表型对照1 pLexA-Pos Gal/Raf/-His/-Ura 蓝对照2 pLexA-53 Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 蓝pB42AD-T 实 验 pLexA-X Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 待测pB42AD-文库 5-1. 用SD/-His/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子，并扩增，使宿主细胞中的质粒在诱导前达到最大拷贝数。-半乳糖苷酶无表达。b5-2. 上述重组子转至含X

8、-gal的固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，观察LacZ及Leu报告基因的表达情形，蓝色克隆即为阳性。白色克隆为假阳性，说明Leu虽有表达，但5-3. 同时用LacZ、Leu两个报告基因的目的，是为了尽可能消除实验的假阳性误差，譬如：AD融合蛋白不与目标蛋白结合，而直接与启动子序列结合域结合等情况。由于2个报告基因的启动子不同，出现上述假阳性的几率就大大减少了。5-4. 将蓝色阳性克隆进行1次以上的划种，尽可能分离克隆中的多种文库质粒。6. 阳性克隆的筛选6-1. 随机选取50个阳性克隆，扩增、抽提酵母质粒，电转化E.coli KC8宿主菌，抽提大肠杆

9、菌中的质粒，酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒。6-2. 如果重复的插入序列较多，可另取50个阳性克隆来分析。最后得到数种片段大小不同的插入序列，再转化新的宿主细胞，检测是否仍为阳性克隆。7. 用质粒自然分选法（Natural Segregation）筛除只含有AD-文库杂合子的克隆7-1. 将初步得到的阳性克隆接种SD/-Trp/-Ura液体培养基，培养1-2天，含有HIS3编码序列的BD-靶质粒在含有外源His培养基中，将以10-20左右的频率随机丢失。C孵育2-3天。7-2. 将上述克隆，转铺固体培养基SD/-Trp/-Ura，307-3. 再挑取生长的单克隆，转入SD/-Tr

10、p/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培养基中，筛选His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文库杂合子的重组子。7-4. 将His表型缺陷的克隆转化固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以验证AD-文库能否直接激活报告基因的表达，弃去阳性克隆，保留阴性克隆。8. 酵母杂合试验（Yeast Mating）确定真阳性克隆如下表所示，在酵母EGY48及其对应的YM4271宿主细胞中分别转入相应的质粒或文库DNA，通过杂合实验确筛选pLexA-靶DNA与pB42AD-文库确实具有相互作用的真阳性克隆。质粒1（in YM4271） 质粒2（in EGY48） LacZ表型 L

11、eu表型pLexA pB42AD 白 不能生长pLexA-靶DNA pB42AD 白 不能生长pLexA pB42AD-文库 白 不能生长pLexA-靶DNA pB42AD-文库 蓝 真 阳 性pLexA-Lam pB42AD-文库 白 不能生长9. 阳性克隆的进一步筛选和确证9-1. 扩增初步确定的阳性克隆，抽提酵母DNA。该DNA为混合成份，既含有酵母基因组DNA，也含有3种转化的质粒DNA。9-2. 将上述DNA电转化E.coli KC8宿主菌。由于在大肠杆菌中，具有不同复制起始调控序列的质粒不相容；同时利用营养缺陷型筛选。因此，在M9/SD/-Trp培养基上，只有含有AD-文库质粒的转

12、化菌才能生长，将其扩增、并抽提质粒DNA，酶切鉴定。9-3. 用pLexA-靶DNA与pB42AD-库DNA一一对应、共转化只含有报告基因的酵母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板扩增，并与后面的诱导板形成对照，说明报告基因的表达与诱导AD融合蛋白的表达有关，再确证LacZ、Leu报告基因的表达。9-4. 扩增与靶DNA相互作用的文库DNA，进行序列分析及进一步的结构、功能研究。10. 对双杂交系统阳性结果的进一步研究10-1. 用不同的双杂交系统验证10-1-1. 将载体 pLexA与pB42AD互换后进行双杂交实验。10-1-2. 选择不同的双杂交系统，如：以GAL4转

13、录激活子为基础的双杂交系统。10-1-3. 将文库质粒移码突变后，再与靶质粒作用，报告基因是否仍能被激活。-半乳糖苷酶水平，比较作用强度变化。b10-1-4. 去除或突变特定结合位点，定量检测10-2. 用试剂盒提供的引物测定插入片段的DNA序列，证明其编码区域。10-3. 用其它的检测方法，如：亲和色谱法或免疫共沉淀法来证明双杂交系统筛选的蛋白之间的具有相互作用。10-4. 进一步研究靶蛋白与筛选蛋白之间的功能关系构建于AD载体的cDNA文库的扩增1. 自-80冰箱取出含有cDNA文库的甘油菌，置于冰浴中缓慢化冻。2. 用新鲜的LB培养液在1.5ml离心管中将上述甘油菌1:106和1:108

14、稀释。lml加入90m3. 取稀释菌液各10 90mm）；37倒置培养过夜或30培养24-36hr，计数平板上单克隆菌落数。fLB培养液在1.5ml离心管中振荡混匀，涂布LB/Amp平板（4. 确定待扩增的cDNA文库滴度（cfu/ml）=克隆数108（1:106稀释）或克隆数1010（1:108稀释）。5. 按照150mm），共100块；37倒置培养过夜。f2-4104cfu/平板的浓度，涂布LB/Amp平板（6. 在超净工作台上，在所有生长菌落的平板上加适量LB培养液，将菌落刮下，转入2000ml LB/Amp培养液中，37振荡培养2-4hr。7. 留取适量培养菌液以50%无菌甘油稀释至2

15、5%终浓度，分装，保存于-80。8. 其余培养菌液离心8000xg10min，4收集细菌；用质粒DNA纯化试剂盒大量抽提质粒DNA。LB液体培养基，121，15lb/in2灭菌15minA. bacto-Tryptone 10.0gB. bacto-Yeast Extract 5.0gC. NaCl 10.0gD. ddH2O 1000 ml* LB固体培养平板为含有1.5%琼脂（Agar）LB培养基。* LB/Amp培养基为含有Amp g/ml的LB培养基。m50-100构建于AD载体的cDNA文库的纯化1. 质粒DNA提取缓冲液名 称 缓 冲 液 配 方g/ml RNasemP1 悬浮缓冲

16、液 50mM Tris-HCl（pH8.0）；10mM EDTA；100 AP2 裂解缓冲液 200mM NaOH；1% SDSP3 中和缓冲液 3.0M Kac（pH5.5）QBT 平衡缓冲液 750mM NaCl；50mM MOPS（pH7.0）；15%异丙醇；0.15% Triton X-100QC 洗涤缓冲液 1.0 M NaCl；15%异丙醇QF 洗脱缓冲液 1.25 M NaCl；50mM Tris-HCl（pH8.5）；2. 培养菌液离心6000xg10min，4，每500ml培养物（下同）的沉淀重悬于50ml P1缓冲液。3. 加入50ml P2缓冲液，倒置4-6次混匀，室温孵

17、育5min。4. 加入4预冷的50ml P3缓冲液，快速倒置4-6次混匀，冰浴30min（其间再倒置混匀4-6次）。5. 将上述混合液再倒置混匀，离心12000xg30min，4，保留上清。6. 上清再离心12000xg15min，4，留上清。7. 将上清液上样于经35ml QBT缓冲液平衡的QIAGEN-tip层析柱。8. 以100ml QC缓冲液洗涤层析柱2次。9. 以35ml QF缓冲液洗脱吸附于层析柱上的DNA。10. 以0.7倍体积异丙醇沉淀DNA，离心12500xg30min，4，小心去除上清。11. 以7ml 70%乙醇洗涤沉淀DNA，离心12500xg10min，4，小心去除上

18、清。12. 将沉淀的质粒DNA溶于5ml TE（pH8.0）缓冲液，转移至新的无菌离心管中，用2.5倍体积无水乙醇；1/10体积3.0M NaAc（pH5.2），于-20静置过夜。13. 离心12500xg20min，4，去除上清，沉淀用70%乙醇洗涤，超净台风干。l），保存于-20。mg/管（用于1次转化反应，约40m14. 干燥的DNA溶于适量体积TE，定量，分装100-200构建于DNA-BD载体的目的DNA转化酵母感受态细胞1. 将酵母菌EGY48（p8op-lacZ）接种于5.0ml SD/-Ura液体培养基中，缓振打散菌落，然后转入95.0ml SD/-Ura液体培养基中，30恒温

19、，250rpm振荡培养16-18hr，至OD6001.0。SD/-Ura液体培养基，115，10lb/in2灭菌15minA. Difco Nitrogen 0.67gB. 葡萄糖 2.00gC. 10DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura） 10.0mlD. 20His 5.0mlE. 20Leu 5.0mlF. 20Trp 5.0mlG. ddH2O 100.0ml2. 将上述新鲜培养菌液接种于300ml YPD，至OD600=0.2-0.3（约50ml），30恒温，250rpm振荡培养至OD600=0.4-0.5（约3hr）。YPD液体培养基，115，10lb/in2灭菌15min

20、A. Polypepton 6.0gB. bacto-Yeast Extract 3.0gC. 葡萄糖 6.0gD. ddH2O 300 ml3. 室温离心5000xg5min，弃上清；加入15-25ml ddH2O重悬洗涤沉淀酵母细胞，离心弃上清，沉淀用1TE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细胞。4. 准备下列试剂2转化反应 10TE 10LiAc 50% PEG ddH2Olml / 120ml 15mA. 1TE/LiAc 0.15ml 15l /ml 960ml 120mB. PEG/LiAc 1.20ml 120lml / / 900mC. 1TE 1.00ml 1005. 分装待转

21、化的质粒DNA，振荡混匀。lmg） 3-5mA. pLexA-X（0.1B. 10mg/ml lmSperm DNA*（0.1mg） 10* 新配制时水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20。 l用1TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，振荡混匀。m6. 每管加入100lm7. 各加入600 PEG/LiAc，振荡混匀，30恒温，250rpm振荡培养30min。lm8. 各加入70 DMSO缓和倒置混匀。42热休克15min，迅速插入冰浴。9. 室温离心13000xg10sec，尽量弃上清；以0.3ml 1TE重悬沉淀细胞，涂布SD/-Ura，-His固体培养板，30倒置培养3-5天。SD/

22、-Ura，-His固体培养基，115，10lb/in2灭菌15min稍冷却后铺板A. Difco Nitrogen 1.34gB. 葡萄糖 4.00gDO（-His，-Leu，-Trp，-Ura） 20.0mlLeu 10.0mlTrp 10.0mlF. Agar 4.00gG. ddH2O 90-100mm）f 200.0ml 铺8-10块平板（附表1. 不同规模转化酵母感受态细胞Small Scale* Large Scale Library Scale转 化 反 应 20 1 1（1） SD液体培养基扩增酵母菌 100ml 100ml 300ml（2） YPD液体培养基扩增酵母菌 300

23、mla 300mla 1000mla（3） TE或ddH2O洗涤酵母细胞 15mlc 25-50mlb 500mla（4） 准备 A. 1TE/LiAc缓冲液 1.5mld 1.0mld 8.0mlcB. PEG/LiAc缓冲液 12.0mlc 6.0mlc 100.0mlbC. 1TE缓冲液 6.0mlc 10.0mlc 10.0mlc（5） 分装 A. DNA-BD vector gd20 / 0.2-1.0mgcm 0.1gd 0.1-0.5mgmg20 10-50mB. AD vector 0.1C. l 2.0mlml20 200mSperm DNA（10mg/ml） 101TE/L

24、iAc重悬感受态细胞 1.5mlc 1.0mlc 8.0mlbl20 1.0ml 8.0mlm酵母感受态细胞 100（7） PEG/LiAc缓冲液 0.6ml20 6.0ml 60.0mll 7.0mlml20 700m DMSO 70（9） 室温离心后弃上清 13000xg10sec 2000xg5min 2000xg5min（10） 1TE重悬感受态细胞 0.3ml20 6.0ml 10.0ml150mm50f150mm30 f90mm20 f铺固体选择培养基平板 注: * 即为“构建于DNA-BD载体的目的DNA转化酵母感受态细胞”* 在不同容积的无菌离心管中进行，a: 300或500m

25、l；b: 50ml；c: 15ml；d: 1.5ml 文库cDNA转化含有DNA-BD载体的酵母感受态细胞1. 以生长于SD/-Ura，-His固体培养板上的含有构建于DNA-BD载体的目的DNA及报告基因（p8op-lacZ）的酵母菌EGY48作为宿主菌，制备酵母感受态细胞。2. 将酵母宿主菌接种于5.0ml SD/-Ura，-His液体培养基中，缓振打散菌落，然后转入95.0ml SD/-Ura，-His液体培养基中，30恒温，250rpm振荡培养16-18hr，至OD600SD/-Ura，-His液体培养基，115，10lb/in2灭菌15minF. ddH2O 100.0ml3. 将上

26、述新鲜培养菌液接种于300ml YPD，至OD600=0.2-0.3（约50ml），30恒温，250rpm振荡培养至OD600=0.4-0.5（约3hr）。4. 室温离心5000xg5. 准备下列试剂lml / 800ml 100mA. 1TE/LiAc 1.0ml 100l 4.8ml /ml 600mB. PEG/LiAc 6.0ml 600TE 10.0ml 1.0ml / / 9.0ml6. 取1.0ml用1TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，加入下列成份，振荡混匀。lmg） 40mA. pB42AD-Library（50-100B. 10mg/ml lmHerring DNA*（2.0mg） 2007. 加入6.0ml PEG/LiAc，振荡混匀，30恒温，250rpm振荡培养30min。lm8. 加入700 DMSO缓和倒置混匀。9. 室温离心2000xg